NaCl添加量對(duì)煮制海灣扇貝多糖結(jié)構(gòu)和消化吸收性的影響

尚宇博，李欣怡，曹心亭，王海波,2,3，趙前程,2,3，李智博,2,3*

1(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連，116023)2(遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗(yàn)及加工技術(shù)科技服務(wù)中心，遼寧 大連，116023)3(遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連，116023)

海灣扇貝(Argopectenirradians)，又稱大西洋海灣扇貝，屬于軟體動(dòng)物門，含有豐富的蛋白質(zhì)、活性多糖、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分，是我國(guó)重要的海洋貝類資源之一[1]。據(jù)報(bào)道，扇貝多糖具有抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、抗氧化[4]等活性，已經(jīng)成為重要的功能食品資源。扇貝的加工方式很多，有干貝柱、冷凍貝柱、即食貝柱等，雖然加工產(chǎn)品不同，但在扇貝加工的第一步通常都要煮制處理。現(xiàn)階段，在扇貝的加工過程中，對(duì)煮制條件的控制不是很嚴(yán)格，關(guān)于煮制條件對(duì)扇貝營(yíng)養(yǎng)成分的影響也鮮有報(bào)道。

營(yíng)養(yǎng)是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，水產(chǎn)品加工過程中的糖類組分在物理、化學(xué)和生物等因素作用下，會(huì)發(fā)生分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成以及功能特性的變化，進(jìn)而影響其在人體內(nèi)的消化吸收特性。多糖和蛋白質(zhì)熱加工能夠發(fā)生美拉德反應(yīng)[5-6]，多糖中金屬離子的含量和種類也會(huì)影響多糖的結(jié)構(gòu)和活性[7-8]。因此，研究不同煮制加工條件對(duì)扇貝柱多糖結(jié)構(gòu)和消化吸收的影響，可以為高品質(zhì)高營(yíng)養(yǎng)的扇貝加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海灣扇貝柱，玉洋集團(tuán)有限公司；堿性蛋白酶、胃蛋白酶，天津諾奧酶生產(chǎn)力促進(jìn)有限公司；胰酶(食品級(jí))、Dextran Blue 2000、Dextran T-10、Dextran T-70、Dextran T-500、DMEM，北京索萊寶科技有限公司；L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-氨基葡萄糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、氨基半乳糖，美國(guó)Sigma公司；KBr粉末(光譜純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

354-00771酶標(biāo)儀，LabSystems公司；GL-21M恒溫離心機(jī)，湖南湘儀公司；傅里葉變換紅外光譜儀，北京瑞利分析儀器公司；L-2000液相，日本日立公司；TU-1080紫外-可見光分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；Agilent高效液相色譜儀；電阻儀，北京金工鴻泰科技有限公司；精密pH計(jì)，上海市精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 扇貝多糖的提取

將扇貝柱加2倍體積的水和貝柱質(zhì)量0%、1.5%、3%和4.5%的NaCl，煮制6 min，撈出晾涼后，按貝柱肉與水1∶3(g∶mL)的比例進(jìn)行勻漿，加入堿性蛋白酶酶解(pH 9.5、2%加酶量、55 ℃酶解4 h)，等電點(diǎn)沉蛋白(pH 5.0)，離心，取上清液加入3倍體積的乙醇，醇沉24 h。取沉淀，采用胃蛋白酶二次酶解(pH 2.0、2%加酶量、37 ℃酶解4 h)，醇沉，凍干，得到4種扇貝多糖CSPA(0% NaCl)、CSPB(1.5% NaCl)、CSPC(3% NaCl)和CSPD(4.5% NaCl)。

1.3.2 扇貝多糖的純度測(cè)定

采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定扇貝多糖的總糖含量。多糖純度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：M0，樣品溶液中葡萄糖質(zhì)量，mg；N，樣品溶液稀釋倍數(shù)；M，干燥的扇貝多糖的質(zhì)量，mg。

1.3.3 紅外光譜測(cè)定

將扇貝柱多糖樣品在105 ℃烘箱里烘干至恒重后取2 mg，然后取烘干的KBr粉末200 mg，混合研磨均勻后壓成透明薄片，在傅里葉變換紅外光譜儀上掃描4 000～400 cm-1紅外光譜吸收值，然后對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)

根據(jù)JIA等[9]的方法并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取2.0 mg干燥的扇貝多糖樣品，用1.0 mL去離子水溶解后加入100 μmol/L剛果紅試劑。然后依次加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mol/L NaOH溶液，用紫外掃描儀掃描400～600 nm下的紫外吸收。

1.3.5 單糖組成分析

參考范三紅等[10]的方法并稍作改進(jìn)。通過PMP柱前衍生化單糖，經(jīng)高效液相色譜分離檢測(cè)。取樣品2 mg加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)加入經(jīng)110 ℃水解8 h后，取400 μL樣品加入450 μL 0.3 mol/L NaOH和450 μL 0.5 mol/L NaOH PMP衍生劑，充分振蕩，70 ℃衍生30 min，冷卻至室溫后加入450 μL 0.3 mol/L HCl 中和，加入1 mL氯仿，充分振蕩，棄去有機(jī)相，重復(fù)萃取3次，過0.22 μm膜，置于樣品瓶，待進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱為L(zhǎng)a Chorm C18，流動(dòng)相A為15%(體積分?jǐn)?shù))乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液，流動(dòng)相B為40%(體積分?jǐn)?shù))乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液，時(shí)間梯度：0～15～60 min；濃度梯度：A相90%～70%～70%，B相10%～30%～30%；流速0.9 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；檢測(cè)溫度：25 ℃。

1.3.6 分子質(zhì)量的測(cè)定

參考何晉浙等[11]的方法。取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(分子質(zhì)量為2 000、500、70、10 kDa)和多糖樣品分別配成2%的溶液，過0.22 μm膜后進(jìn)樣檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為TSKgel-G500PWXL，蒸發(fā)光檢測(cè)器，柱溫為常溫，流動(dòng)相為超純水，流速0.5 mL/min。以色譜峰的保留時(shí)間tR為橫坐標(biāo)，以lgMW為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 掃描電鏡

參照吳麗萍等[12]的方法并略做改進(jìn)。取適量多糖樣品，鍍上導(dǎo)電金粉后將其放置于S-3400 N掃描電鏡下觀察。工作條件：加速電壓15 kV，觀測(cè)倍數(shù)選用5 000倍。

1.3.8 扇貝多糖的模擬消化

參考閔芳芳等[13]的方法并稍作改進(jìn)。

模擬胃液消化過程：取模擬胃液和扇貝多糖溶液混勻，于150 r/min，37 ℃的搖床中進(jìn)行消化，在1 h、4 h分別取出1組，調(diào)pH 7.0，4 800×g離心10 min，取上清液得到樣液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模擬腸液：取模擬胃液中消化6 h的多糖離心管，調(diào)pH 7.0，加6 mL體外模擬腸消化液，充分混勻后在150 r/min，37 ℃的搖床中消化，然后分別在2、5 h取出一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取模擬消化后的樣液進(jìn)行還原糖和分子質(zhì)量的測(cè)定。

胃電解質(zhì)溶液：3.10 g氯化鈉，1.10 g氯化鉀，0.15 g氯化鈣，0.60 g碳酸氫鈉溶于1.00 L去離子水中。

體外模擬胃液：135.00 mg 胃蛋白酶加入180.00 mL胃電解質(zhì)溶液中，將其混合均勻，再用1.00 mol/L HCl調(diào)pH 2.0。

腸電解質(zhì)溶液：5.40 g氯化鈉，0.65 g氯化鉀，0.33 g氯化鈣溶于1.00 L去離子水中。

7 g/100mL胰酶：7.00 g胰酶溶于100.00 mL水，4 800×g離心10 min，取上清液待用。

體外模擬腸液：取90.00 mL胰酶溶液(7 g/100mL)加入90.00 mL腸電解質(zhì)溶液，混合均勻，再用1.00 mol/L碳酸氫鈉調(diào)pH 7.0。

1.3.9 Caco-2 細(xì)胞單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇在培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。參考DENG等[14]的MTT方法通過二甲基亞砜能夠溶解被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原的水不溶性的藍(lán)色結(jié)晶，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而反映扇貝多糖對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖作用。將細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)側(cè)，外側(cè)加入完全培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d。根據(jù)每天對(duì)Transwell小室中各個(gè)孔的形態(tài)學(xué)觀察、電阻的測(cè)量以及第1、5、10、15、20天每個(gè)孔的AP側(cè)和BL側(cè)的堿性磷酸酶測(cè)定來(lái)判定Caco-2 細(xì)胞造模的完整性。最后通過細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[15]的表觀滲透系數(shù)判斷Caco-2 細(xì)胞對(duì)扇貝多糖的吸收情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種扇貝多糖的純度和提取率

由表1可知，不同NaCl添加量煮制扇貝所提取多糖的純度是先增加后減小，CSPC(3% NaCl)組分的純度最大，可能隨著鹽濃度升高，更多的鹽溶性蛋白溶解到蒸煮液中，扇貝中的蛋白質(zhì)含量降低，從而提取的多糖純度較高。當(dāng)鹽濃度過高時(shí)(4.5% NaCl)，與鹽溶性蛋白結(jié)合在一起的糖蛋白也溶解到蒸煮液中，致使貝柱中的多糖含量下降，提取到的多糖純度降低。因此，扇貝煮制加工時(shí)，加2倍水，NaCl添加量為鮮貝柱質(zhì)量3%時(shí)，所提取的扇貝多糖純度最高。

表1 不同NaCl添加量煮制扇貝多糖的純度(煮制時(shí)間6 min)

2.2 紅外光譜圖分析

圖1 CSPC(3% NaCl)扇貝多糖紅外光譜圖

2.3 剛果紅實(shí)驗(yàn)分析

剛果紅與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在弱堿性溶液中絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)增大，而在強(qiáng)堿性溶液中絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)減小[17]。通過NaOH濃度變化時(shí)溶液最大吸收波長(zhǎng)的變化，可以判斷多糖樣品是否具有3股螺旋結(jié)構(gòu)[18]。

在不同NaOH濃度時(shí)，剛果紅試劑的最大吸收波長(zhǎng)以及剛果紅試劑與扇貝多糖作用后的最大吸收波長(zhǎng)變化情況如圖2所示。由圖2可知，隨著NaOH濃度由低到高增加，扇貝多糖與剛果紅試劑作用后，它們的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了特征性變化。由此表明4種扇貝多糖均具有3股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 不同NaCl添加量煮制扇貝多糖在不同堿性環(huán)境下的最大吸收波長(zhǎng)

2.4 單糖組成分析

由表2可知，扇貝多糖均可檢測(cè)出：甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖。除CSPC(3% NaCl)以外，其余扇貝多糖均可檢測(cè)出：鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和巖藻糖。CSPC(3% NaCl)扇貝多糖的純度最高，單糖組成中葡萄糖的占比也最高，這與曹倩倩[19]的研究結(jié)果比較一致，高純度的扇貝柱多糖(91.91%)是以糖原形式存在，單糖組成中只檢測(cè)到葡萄糖，而扇貝內(nèi)臟多糖的單糖組成比較豐富。另外3種多糖，可能由于多糖純度略低，因此單糖組成的種類更加豐富。

表2 不同NaCl添加量煮制扇貝多糖中各單糖所占比例

2.5 分子質(zhì)量分析

不同NaCl添加量的4種扇貝多糖均只顯示一個(gè)大峰，出峰時(shí)間基本一致，以純度較高的CSPC(3% NaCl)圖譜為例，保留時(shí)間在8.148 min，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-0.229 8x+8.544 3)可得分子質(zhì)量在2 000 kDa以上。

圖3 CSPC(3% NaCl)扇貝多糖分子質(zhì)量

2.6 電鏡分析

圖4為不同NaCl添加量扇貝多糖放大5 000倍的掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)圖片。多糖CSPC(3% NaCl)的表面為粗糙的片層空洞結(jié)構(gòu)，粗糙的表面會(huì)使比表面積的增加，有助于提高多糖在水中的溶解性[20]，CSPA(0% NaCl)、CSPB(1.5% NaCl)和CSPD(4.5% NaCl)的扇貝多糖呈塊狀，表面相對(duì)光滑。多糖顯微組織和表面的差異，與它們的物理性質(zhì)有一定相關(guān)性，可能是由于樣品純度差異造成的[21]。

a-CSPA(0% NaCl)；b-CSPB(1.5% NaCl)；c-CSPC(3% NaCl)；d-CSPD(4.5% NaCl)

2.7 扇貝多糖的體外模擬消化分析

由表3可知，隨著消化時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，不同NaCl添加量的扇貝多糖樣品在模擬胃液和模擬腸液中的還原糖含量變化不大，沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 不同NaCl添加量扇貝所提取多糖在體外模擬消化后還原糖含量分析

由表4可知，扇貝多糖CSPA(0% NaCl)、CSPB(1.5% NaCl)、CSPC(3% NaCl)經(jīng)模擬胃液消化后都出現(xiàn)3個(gè)峰，分子質(zhì)量都小于2 000 kDa，說明4種扇貝多糖經(jīng)過胃腸液消化后，都能被部分降解，但降解程度不同。扇貝多糖CSPC(3% NaCl)消化產(chǎn)物中的小分子質(zhì)量多糖占比最大，消化效果最好，而扇貝多糖CSPD(4.5% NaCl)經(jīng)模擬胃液消化后，90%以上的多糖分子質(zhì)量都在1 600 kDa，消化效果最差。HU等[22]研究發(fā)現(xiàn)多糖糖苷鍵的斷鍵一定會(huì)增加多糖還原糖的含量。4種多糖經(jīng)過模擬消化后，還原糖的含量增加并不多，說明多糖分子質(zhì)量的降低主要是由于多糖聚合物的解聚和聚合物分子鏈的共價(jià)鍵斷裂[23]，結(jié)合電鏡的分析結(jié)果，CSPC(3% NaCl)的比表面積更大，有利于消化液的作用，所以消化效果最好。本研究模擬消化液中的胰酶含有胰淀粉酶，其酶切位點(diǎn)為葡聚糖的α1,4-糖苷鍵，CSPD(4.5% NaCl)中葡萄糖的占比最小，胰淀粉酶的酶切位點(diǎn)較少，所以消化效果不好。

表4 不同NaCl添加量所提取多糖在體外模擬胃液消化后的分子質(zhì)量分析

2.8 扇貝多糖的體內(nèi)吸收分析

2.8.1 扇貝多糖對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響

圖5為扇貝多糖CSPC(3% NaCl)質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL時(shí)對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響。由圖5可知在培養(yǎng)過程中加入不同濃度的扇貝多糖溶液與空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)相比，對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒有影響(P>0.05)，由此可見，扇貝多糖對(duì)Caco-2細(xì)胞沒有毒性。

圖5 扇貝多糖CSPC(3% NaCl)對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響

2.8.2 Caco-2 細(xì)胞單層完整性檢驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(光學(xué)顯微鏡)、細(xì)胞跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)測(cè)量值以及堿性磷酸酶測(cè)量3種方法對(duì)Caco-2細(xì)胞的完整性以及緊密性進(jìn)行檢測(cè)。

2.8.2.1 Caco-2 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

Caco-2細(xì)胞接種于Transwell小室上層的聚碳脂膜上后，胞開始沉降貼壁，由球形變?yōu)樗笮?，展開并開始不斷地與周圍細(xì)胞進(jìn)行融合，生長(zhǎng)成片。當(dāng)Caco-2細(xì)胞在Transwell小室中培養(yǎng)4～5 d時(shí)，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞間可清楚的看見連接邊緣。培養(yǎng)15～21 d時(shí)，細(xì)胞間已經(jīng)完全融合，形成了致密的單層細(xì)胞膜。Caco-2細(xì)胞剛接種于Transwell小室未貼壁時(shí)、培養(yǎng)第1、5、10、15、20天的顯微鏡下狀態(tài)如圖6所示。

a-剛接種到Transwell小室時(shí)；b-培養(yǎng)1 d時(shí)；c-培養(yǎng)5 d時(shí)；d-培養(yǎng)10 d時(shí)；e-培養(yǎng)15 d時(shí)；f-培養(yǎng)20 d時(shí)

2.8.2.2 Caco-2細(xì)胞的TEER值結(jié)果

確定Caco-2細(xì)胞的單層致密完整性可通過測(cè)定細(xì)胞的TEER值。當(dāng)電阻值大于200 Ω/cm2時(shí)可以說明此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)處于單層致密完整[24]。

由圖7可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Caco-2細(xì)胞在Transwell小室中的跨膜電阻值不斷增加，在20 d時(shí)達(dá)到290 Ω/cm2，說明細(xì)胞已經(jīng)形成了致密的單層細(xì)胞膜。

圖7 Caco-2細(xì)胞21 d的TEER值變化

2.8.2.3 Caco-2細(xì)胞的堿性磷酸酶活性

由表5可知，隨著Caco-2細(xì)胞在Transwell小室中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，腸腔側(cè)(AP側(cè))與基底側(cè)(BL側(cè))的堿性磷酸酶的活力比值也逐漸增加。到第20天時(shí)比值為6.78，與第1天的比值1.05相比增加了6倍左右。說明隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，腸腔側(cè)(AP側(cè))和基底側(cè)(BL側(cè))的堿性磷酸酶分布不均勻，出現(xiàn)明顯的極化現(xiàn)象，可以進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

表5 Caco-2細(xì)胞腸腔側(cè)與基底側(cè)堿性磷酸酶的活力比值

2.8.3 扇貝多糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在通常情況下，當(dāng)表觀滲透系數(shù)的值大于1×10-4時(shí)說明藥物可以被完全吸收，當(dāng)表觀滲透系數(shù)的值小于1×10-7時(shí)說明藥物不能被吸收[25]。

由表6可知，扇貝多糖CSPC(3% NaCl)從AP側(cè)到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù)為6.24×10-5；BL側(cè)到AP側(cè)的表觀滲透系數(shù)為5.03×10-5。結(jié)果表明，扇貝多糖能被部分吸收，且吸收作用大于外排作用。

表6 扇貝多糖CSPC(3% NaCl)的表觀滲透系數(shù)

3 結(jié)論

適當(dāng)?shù)闹笾茥l件下(添加3%NaCl、煮制6 min)，扇貝多糖的純度最高，為55.50%。不同NaCl添加量的扇貝多糖結(jié)構(gòu)比較相似，但單糖組成有明顯差異，CSPC(3% NaCl)中主要成分是葡萄糖(99.05%)，其余扇貝多糖也是葡萄糖為主(79.85%～95.66%)，但可檢測(cè)出鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和巖藻糖。在體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)中，CSPC(3% NaCl)的消化效果最好。Caco-2細(xì)胞模擬小腸吸收實(shí)驗(yàn)顯示，扇貝多糖能被部分吸收，且吸收作用大于外排作用。