飼喂仿刺參性腺對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

李 倩，教 楊，劉 淇，張 媛，趙 玲，孫慧慧，曹 榮,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.廣州工商學(xué)院工學(xué)院，廣東 廣州 510850；3.獐子島集團(tuán)股份有限公司，遼寧 大連 116001）

海參是藥食同源的典范，食用歷史悠久，保健功效深入人心。隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人均可支配收入的增加，吃海參逐漸成為人們?nèi)粘ｐB(yǎng)生的一種潮流。與此同時(shí)，海參養(yǎng)殖技術(shù)不斷進(jìn)步和完善，有力推動(dòng)了海參產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。2021年全國仿刺參總產(chǎn)量達(dá)22.27 萬t[1]，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值估算超1 000 億元。海參營養(yǎng)功效與加工一直是國內(nèi)的研究熱點(diǎn)?！笆濉币詠?，科研人員先后在海參自溶機(jī)制與控制、海參功能成分與構(gòu)效關(guān)系解析、海參加工技術(shù)與產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等方面取得了重要進(jìn)展。與此同時(shí)，海參加工產(chǎn)業(yè)依舊面臨一些問題，尤為突出的是海參在加工過程中會(huì)產(chǎn)生30%左右的副產(chǎn)物（海參腸、性腺、呼吸樹等組織），目前利用率極低[2]，部分甚至直接丟棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。

海參性腺，俗稱海參花，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)以及海參多糖、海參皂苷、功能脂質(zhì)等活性成分[3]，是生產(chǎn)功 能性海洋制品的潛在原料?？蒲腥藛T從海參性腺中提取到多種活性物質(zhì)，并驗(yàn)證了其功能活性，如體外抗氧化活性[4]、抗腫瘤[5]及促進(jìn)生殖系統(tǒng)健康[6-7]等。而目前有關(guān)海參性腺在免疫調(diào)節(jié)方面的研究報(bào)道還非常少。常年吃海參的人群不易感冒，普遍認(rèn)為與食用海參可以提高人體免疫力有關(guān)[8]，通常人們食用的部分為海參體壁。而仿刺參性腺是否具有免疫功效，目前尚沒有相關(guān)的研究證明。由此，本研究以仿刺參雌、雄性腺為原料，對其基本營養(yǎng)組分和主要功效成分進(jìn)行測定，采用小鼠飼喂實(shí)驗(yàn)，通過分析臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)、肝臟生化指標(biāo)等考察仿刺參性腺在小鼠免疫力調(diào)節(jié)方面的作用，以期為仿刺參性腺的精深加工與產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仿刺參雌、雄性腺由青島海濱食品有限公司提供，系2020年春季采捕仿刺參時(shí)現(xiàn)場分離得到，雌、雄性腺分別分裝于樣品袋中，立即冷凍處理。SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20.0±2.0） g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

Hank’s液、RPMI1640等細(xì)胞培養(yǎng)液 ?？寺∩锘瘜W(xué)有限公司；胎牛血清 賽默飛世爾科技有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞 中國科學(xué)院細(xì)胞庫；2-巰基 乙醇 寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；青霉素、鏈霉素 上海生物工程股份有限公司；紅細(xì)胞裂解液 北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán) 美國Sigma公司；濃鹽酸、氯仿、甲醇、磺基水楊酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；灌胃器、注射器、凍存管、96 孔培養(yǎng)板、無菌濾器 青島阿貝特儀器科技有限公司。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G50型組織研磨器 卡尤迪生物科技有限公司；Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；DHG-9423A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏設(shè)備有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；MARS Xpress型微波消解儀 美國CEM公司；5810R型冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

仿刺參雌、雄性腺分別真空冷凍干燥處理，研磨成粉末，備用；體壁切塊后進(jìn)行真空冷凍干燥處理，研磨成粉末，備用。將仿刺參雌、雄性腺鮮樣分別勻漿，制得勻漿液備用。

1.3.2 基本化學(xué)成分與功效成分測定

蛋白質(zhì)含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[9]中的凱氏定氮法。脂肪含量測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[10]中的索氏提取法。灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》[11]中的高溫灼燒法。海參多糖含量測定：參照常耀光[12]的方法。海參皂苷含量測定：參照高子陽等[13]的方法。

1.3.3 小鼠飼喂

小鼠預(yù)飼1 周，之后隨機(jī)分為3 組，每組20 只，即：對照組、飼喂雌性性腺組（灌胃仿刺參雌性性腺勻漿液）、飼喂雄性性腺組（灌胃仿刺參雄性性腺勻漿液）。每周測定小鼠體質(zhì)量，灌胃劑量按照 2.6 mg/（g·d）計(jì)算，對照組灌胃同等體積的蒸餾水。連續(xù)灌胃30 d，飼喂結(jié)束后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3.4 臟器指數(shù)測定

摘取小鼠胸腺和脾臟，分別稱質(zhì)量，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)分別按式（1）～（2）計(jì)算。

1.3.5 自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性率測定

實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用Hank’s液洗3 次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，用Hank’s液洗2 次，3 500 r/min離心10 min棄上清，加入0.5 mL細(xì)胞裂解液20 s，再加入0.5 mL 2 倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1 000 r/min離心10 min，用1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，稀釋后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞。同時(shí)設(shè)定靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定光密度（OD），NK細(xì)胞活性率按式（3）計(jì)算。

1.3.6 血清生化指標(biāo)測定

末次灌胃后禁食不禁水12 h，小鼠稱質(zhì)量，摘眼球取血，靜置30 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血清。按照試劑盒說明書步驟，測定血清IL-2、IL-6、TNF-α、MDA、GSH含量及LDH、SOD活性。

1.3.7 肝臟生化指標(biāo)測定

取血后小鼠脫頸處死，無菌環(huán)境下，取脾臟、胸腺和肝臟，冷生理鹽水清洗，稱質(zhì)量。肝臟勻漿，按照試劑盒說明書步驟，測定勻漿液中的GSH、MDA含量及SOD、LDH、CAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

營養(yǎng)和功效成分含量測定實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，每次3 個(gè)平行，小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果為20 個(gè)樣本的平均值，結(jié)果用平均 值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS軟件的Duncan’s法進(jìn)行組間差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參性腺基本營養(yǎng)組成與功效成分

由表1可知，仿刺參雌、雄性腺與體壁的蛋白質(zhì)、脂肪、灰分含量以及海參多糖、海參皂苷含量有明顯差別。三者的蛋白質(zhì)含量有顯著差異（P＜0.05），其中雄性性腺蛋白質(zhì)含量最高，而雌性性腺蛋白質(zhì)含量最低，這與張健等[14]的研究結(jié)果類似。仿刺參體壁的脂肪含量較低，而雌、雄性腺的脂肪含量均顯著高于體壁（P＜0.05），尤其是雌性性腺的脂肪含量達(dá)到15.93 g/100 g，是體壁的近4 倍。雌、雄性腺的灰分含量均顯著低于體壁（P＜0.05），這與仿刺參體壁含有內(nèi)骨骼及沙嘴有關(guān)。

表1 仿刺參性腺與體壁基本營養(yǎng)成分與功效成分含量（干基）Table 1 Basic nutrients and functional compounds contents in gonads and body wall of Apostichopus japonicus (on a dry basis)g/100 g

海參多糖和海參皂苷是海參特有的功能活性成分，已被證實(shí)具有多種生理功能[15]。與仿刺參體壁相比，雄性性腺中海參多糖含量顯著偏低（P＜0.05），而雌性性腺的海參多糖含量與體壁相當(dāng)。雌性性腺的海參皂苷含量高達(dá)4.77 g/100 g，是體壁的10 倍以上。因此，仿刺參性腺在功能食品方面具有良好的開發(fā)利用前景。

2.2 小鼠體質(zhì)量與臟器指數(shù)

由表2可知，小鼠飼喂30 d后，體質(zhì)量明顯增加，但3 組小鼠的終體質(zhì)量并無顯著差異。胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，參與細(xì)胞免疫。脾臟中有豐富的B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，與體液免疫關(guān)系更為密切。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高，表明免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng) 弱[16]。喂食仿刺參雄性性腺的小鼠，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）；喂食雌性性腺的小鼠，脾臟指數(shù)顯著增加（P＜0.05），胸腺指數(shù)同樣有所提高，但與對照組相比差異不顯著。由此可知，仿刺參雌、雄性腺對小鼠的免疫功能均可起到一定的促進(jìn)作用，且雄性性腺的效果相對更好。

表2 小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)Table 2 Body mass and organ indices of mice

研究表明，海參中的多種成分都具有提高免疫力的作用，如海參多糖[17]、海參皂苷[18]、海參肽[19]等。食品原料本身是一個(gè)復(fù)雜體系，多組分之間可能存在協(xié)同效應(yīng)[20]，且這種協(xié)同作用對整體功效的貢獻(xiàn)可能更大。因此，對原料本身而非純化組分開展功效研究同樣十分必要。李艷菊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，食用海參可顯著提高小鼠的體液免疫應(yīng)答功能；陳垚[22]將海參凍干粉與茯苓、枸杞等配伍，同樣發(fā)現(xiàn)其具有理想的增強(qiáng)免疫力效果。

2.3 NK細(xì)胞活力

NK細(xì)胞在生物體非特異性免疫中有重要作用，其殺傷作用不需要預(yù)先免疫或致敏，且殺傷作用早于其他效應(yīng)細(xì)胞，在抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)方面有積極作用，同時(shí)可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等[23]。因此，發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的化合物具有重要意義。

由圖1可知，飼喂仿刺參性腺的小鼠，其NK細(xì)胞活力顯著提升（P＜0.05），且飼喂雄性性腺組提升更為明顯，經(jīng)測定其NK細(xì)胞活性率可達(dá)（47.19±4.99）%，表明仿刺參性腺在提高小鼠免疫力方面具有積極作用，這與臟器指數(shù)的檢測結(jié)果一致。

圖1 飼喂仿刺參性腺對小鼠NK細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on NK cell activity of mice

2.4 血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

白細(xì)胞介素是對免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用的一類細(xì)胞因子，在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。其中，IL-2對淋巴細(xì)胞的生長、增殖、分化起促進(jìn)作用，可以激活巨噬細(xì)胞，刺激免疫應(yīng)答[24]。IL-6主要由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，能加快B細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長和分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞裂解功能等。由表3可知，飼喂仿刺參性腺的小鼠，其IL-2含量略有增加，但與對照組相比差異并不顯著，而IL-6含量變化更為明顯，其中飼喂仿刺參雄性性腺組的IL-6含量顯著增加（P＜0.05）， 為（209.75±24.82） pg/mL。

表3 飼喂仿刺參性腺對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on serum biochemical indices of mice

TNF-α主要由脂肪組織中的巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分泌產(chǎn)生，與免疫調(diào)控、抑制腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。楊東達(dá)[25]從海參內(nèi)臟中分離出SCVP-1和SCVP-2 2 種多糖組分，發(fā)現(xiàn)SCVP-1可以顯著提高小鼠血清中TNF-α含量，增強(qiáng)小鼠免疫活性。飼喂仿刺參性腺的小鼠，其血清中TNF-α含量略有增加，但與對照組相比差異并不顯著，雌性性腺組對應(yīng)的TNF-α含量增加更為明顯，可能與雌性性腺中海參多糖的含量更高有關(guān)[26]。

SOD是存在于機(jī)體內(nèi)的一種可清除超氧自由基的酶，其活性不僅在一定程度上反映了機(jī)體抗氧化和抗衰老作用的強(qiáng)弱，還可在一定程度上反映機(jī)體免疫活性，如抗炎癥能力等[27]。與對照組相比，飼喂雄性性腺的小鼠，其SOD活力顯著升高（P＜0.05），為（18.61±0.28） U/mL。飼喂雌性性腺的小鼠，其SOD活力也略有升高，但與對照組相比差異不顯著。LDH存在于組織細(xì)胞內(nèi)，其主要功能是將運(yùn)動(dòng)所致肌肉中堆積的乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，減少乳酸在肌肉中的堆積。LDH活力越高，表明機(jī)體對運(yùn)動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的乳酸清除能力越強(qiáng)，進(jìn)而延緩疲勞的發(fā)生或加速疲勞的消除，間接提升機(jī)體的免疫功能。飼喂雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其LDH活力均顯著提升，分別達(dá)（391.01±32.18）、（379.12±18.44） U/L（P＜0.05），且飼喂雌性性腺的小鼠提升更為明顯，這可能與雌性性腺富含極性脂質(zhì)有關(guān)。雌性性腺中脂質(zhì)含量高達(dá)15.93%，其中磷脂、鞘脂類占有相當(dāng)比例，而海參磷脂可顯著提高生物體SOD、LDH活力[28]。

自由基是影響生物體免疫系統(tǒng)的重要因素。機(jī)體中的自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物[29]。MDA具有細(xì)胞毒性，能加劇膜損傷，引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，導(dǎo)致細(xì)胞代謝及功能障礙。與對照組相比，飼喂雄性性腺可顯著降低血清中的MDA含量 （P＜0.05），這與SOD活力提高的結(jié)果相一致。 付雪媛等[30]研究認(rèn)為，海參可改善小鼠的抗氧化能力，同時(shí)提高免疫力，具體表現(xiàn)為MDA含量減少、SOD活力提升。飼喂雌性性腺也可在一定程度上降低血清中的MDA含量，但與對照組相比差異不顯著。

2.5 肝臟生化指標(biāo)檢測結(jié)果

由表4可知，肝臟生化指標(biāo)檢測結(jié)果與血清類似。飼喂仿刺參雄性性腺組的小鼠，其SOD、LDH活力顯著提升（P＜0.05）（（6.32±0.31） U/mg和（246.77±26.10） U/g），MDA含量顯著下降 （P＜0.05），為（1.98±0.25） nmol/mg。CAT存在于動(dòng)物的各個(gè)組織中，尤其在肝臟中大量存在，是肝臟發(fā)揮抗氧化、解毒等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。飼喂仿刺參雄性性腺組的小鼠，CAT活力略有提高，但與對照組相比差異并不顯著。GSH由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成，廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，可維持免疫系統(tǒng)正常功能，并具有抗氧化、解毒的作用。飼喂仿刺參雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其GSH含量均有所增加，且雄性性腺組增加更為明顯。Meng等[31]研究發(fā)現(xiàn)，海參中的蛋白肽可提高機(jī)體抗氧化能力、增加GSH含量。仿刺參雄性性腺蛋白含量高，該組的小鼠肝臟GSH含量增加可能與之有關(guān)。

表4 飼喂仿刺參性腺對小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響Table 4 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on liver biochemical indicators of mice

3 結(jié) 論

仿刺參性腺富含營養(yǎng)和功效成分，且雌性性腺和雄性性腺化學(xué)組成有明顯不同，雌性性腺富含脂肪和皂苷，而雄性性腺蛋白含量較高。與對照組相比，飼喂仿刺參雄性性腺的小鼠，其胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著增加（P＜0.05），分別為（4.70±0.36）、（3.70±0.29） mg/g，NK細(xì)胞活性顯著提高 （P＜0.05），達(dá)（47.19±4.99）%，血清中IL-6含量顯著增加（P＜0.05），為（209.75±24.82） pg/mL，血清和肝臟中LDH、SOD活力均顯著提升（P＜0.05），肝臟MDA含量顯著降低至（1.98±0.25） nmol/mg （P＜0.05）；飼喂仿刺參雌性性腺的小鼠，脾臟指數(shù)為（3.14±0.26） mg/g（P＜0.05），血清LDH活力顯著提升（P＜0.05），達(dá)（391.01±32.18） U/L。由此可知，飼喂仿刺參性腺可提高小鼠的免疫活性，且飼喂雄性性腺的作用更加明顯。