不同脅迫體系對植物乳桿菌zwq9生物膜形成及其產(chǎn)蛋白酶活力的影響

汪曉雅，陳芳，劉思慧，陳卓，邵淑倩，冉倩楠，李明楊，2*，任曉鏷，2*

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆是多民族聚居區(qū)，本地區(qū)牧民自古以來就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中蘊(yùn)藏著極為豐富的優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源，賦予了產(chǎn)品良好的感官品質(zhì)和風(fēng)味特性。乳酸菌是一類廣泛存在于各種發(fā)酵食品中的有益微生物，其產(chǎn)生的胞外蛋白酶對食品發(fā)酵過程中的風(fēng)味形成及品質(zhì)改善起關(guān)鍵作用[1]，其在發(fā)酵乳、肉制品中的作用尤為突出。發(fā)酵肉制品中的肌肉蛋白質(zhì)在乳酸菌胞外蛋白酶的作用下分解為多肽、氨基酸等風(fēng)味前體物質(zhì)，改善發(fā)酵肉制品的特征風(fēng)味與品質(zhì)特性，提升肉制品的營養(yǎng)價值，同時確保產(chǎn)品的安全性與穩(wěn)定性[2-4]。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，乳酸菌蛋白酶能夠分解乳蛋白產(chǎn)生多肽及氨基酸，提高胃蛋白酶的活性，促進(jìn)損傷的腸黏膜上皮修復(fù)等，同時還能提升乳制品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值[5-6]。

細(xì)菌生物膜是一種有組織的、具有功能性的細(xì)菌群體，是由菌體細(xì)胞及其分泌至胞外的大分子物質(zhì)組成的微生物集合體[7]。生物膜的形成能使細(xì)菌具有良好的穩(wěn)定性和對不利環(huán)境的抗逆性，如果賦予有益細(xì)菌（如乳酸菌）這些特性，將使其能更好地在生產(chǎn)和實踐中發(fā)揮作用[8-9]，乳酸菌生物膜的形成為其生存環(huán)境提供機(jī)械穩(wěn)定性，提高了菌體的抗逆性，保護(hù)了生物膜中的乳酸菌。同時，生物膜的形成也賦予乳酸菌多重功能特性，具有極高的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。因此，開展乳酸菌生物膜的相關(guān)研究可為其在生產(chǎn)上的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，使它們在改善人類健康方面發(fā)揮更大的作用。

乳酸菌在發(fā)酵肉、乳制品過程中，發(fā)酵制品的內(nèi)環(huán)境會隨發(fā)酵進(jìn)程的延長和加工方式的不同而有所差異，如乳酸菌產(chǎn)酸使體系pH值下降，不同的鹽添加量和不同溫度的影響等均可能改變體系的發(fā)酵特性[12-13]。不同加工條件可使乳酸菌生物膜形成能力發(fā)生改變，同時也影響著菌株的產(chǎn)酶活力及酶的活性等特性。酶的催化能力與其活性部位和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，完整的二級和三級結(jié)構(gòu)可維持酶活性中心的空間構(gòu)象，一旦二級和三級結(jié)構(gòu)受到破壞，酶的催化活性即會喪失[14]。加工條件（如鹽濃度、體系pH值、加工溫度）會對酶的活性部位與空間結(jié)構(gòu)造成不可逆破壞，改變菌體自身的合成及代謝進(jìn)程，同時也影響其生物膜形成能力，故不同加工條件脅迫下乳酸菌胞外產(chǎn)酶活力的性質(zhì)及生物膜形成能力均會受到一定的影響[15]。因此，探索加工條件脅迫下乳酸菌的產(chǎn)酶活性與其生物膜形成能力之間的關(guān)系，為進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌生物膜提供思路，同時也對發(fā)酵乳制品形成優(yōu)良的風(fēng)味和提升品質(zhì)特性具有重要意義。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）zwq9是生物膜強(qiáng)陽性菌株[16]，經(jīng)初步分析，該菌株具有良好的產(chǎn)胞外蛋白酶活力。本研究以該菌株為研究對象，探索不同加工條件脅迫下該乳酸菌的生物膜形成能力與其產(chǎn)胞外酶特性，探討乳酸菌生物膜的形成與其產(chǎn)酶特性的關(guān)系，為深入發(fā)掘利用新疆特色乳制品中的乳酸菌資源提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物膜陽性植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）zwq9：塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工課題組分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品老酸奶。

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WHB細(xì)胞培養(yǎng)板：上海臥宏生物科技有限公司；蛋白酶K（40 U/mg）：德國Merck公司；高碘酸鈉：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；干酪素：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；其他試驗所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀（Synergy H1）：美國BioTek儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9162MBE）、立式壓力蒸汽滅菌器（50SII）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)（TGL-bR）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型）：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌生長曲線的測定

挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)12 h，按體積比1∶100的接種比例將培養(yǎng)12 h的菌液接種至新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，前12 h每隔1 h測定培養(yǎng)液590nm處的吸光度，同時測定培養(yǎng)24、36 h和48 h后培養(yǎng)液在590 nm處的吸光度。每組試驗重復(fù)3次。

1.3.2 生物膜形成能力檢測

參照文獻(xiàn)[17-18]的方法，采用微量板半定量法對植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力進(jìn)行檢測。按體積比1∶100的接種比例將培養(yǎng)12 h的菌液30 μL接種至3 mL培養(yǎng)基，充分混勻，吸取200 μL至96孔板中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液在590 nm處的吸光度，傾出培養(yǎng)液，用無菌水洗板4次。56℃烘干固定1 h，50 μL 0.5%結(jié)晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37℃晾干，再用酶標(biāo)儀測定其在490 nm處的吸光度。當(dāng)OD490大于4.0時儀器顯示為OVRFLW，即默認(rèn)此時OD490值為4.0。所有生物膜形成檢測試驗均重復(fù)3次。

1.3.3 生物膜組分分析

參照Rohde等[19]及李英等[20]的方法并略做改動，同1.3.2中采用96孔板法檢測分析植物乳桿菌zwq9生物膜的組分，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)板取出，測定其在590 nm處的吸光度后輕輕傾出培養(yǎng)液，用無菌水洗板洗去未黏附細(xì)菌后，分別向培養(yǎng)板中加入20 μL 1 mg/mL蛋白酶K，37℃孵育2h，或向培養(yǎng)板中加入50μL 50 mmol/L高碘酸鈉，37℃孵育2 h，以不加蛋白酶K或高碘酸鈉的處理組為對照組，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度。每組試驗重復(fù)3次。

1.3.4 發(fā)酵條件脅迫體系的構(gòu)建

根據(jù)乳酸菌的發(fā)酵特性，分別建立乳酸脅迫體系、溫度脅迫體系和鹽脅迫體系。1）乳酸脅迫體系：分別向初始液體培養(yǎng)基中加入一定量的乳酸，使乳酸的終濃度為0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、3.0%；2）溫度脅迫體系：將接種后的培養(yǎng)液分別置于10、20、30℃和40℃條件下培養(yǎng)；3）鹽脅迫體系：分別向初始液體培養(yǎng)基中加入一定量的NaCl，使NaCl的終濃度為0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。分別分析不同脅迫體系條件下植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力及其產(chǎn)酶活力。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶活力的測定

取培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液5mL于4℃下10000r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液[21]；參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法對植物乳桿菌zwq9粗酶液的蛋白酶活力進(jìn)行測定。將不同稀釋梯度的粗酶液與1%酪蛋白溶液充分混合均勻，置于40℃水浴中加熱20 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。20℃靜置10 min后5 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液與5 mL碳酸鈉溶液、0.5 mL福林酚溶液混合，40℃顯色20 min，測定680 nm處的吸光度。以酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算粗蛋白酶的活力。本研究所得酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010 8x+0.001 8（R2=0.999 6）。蛋白酶活力的定義：在最適條件下，每分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定為一個活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所得試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計分析，One-way ANOVA和Duncan’s多重比較用于分析不同處理組之間的差異，顯著水平為P＜0.05；所有試驗至少重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌zwq9的生長曲線及其生物膜形成能力

圖1為植物乳桿菌zwq9的生長曲線及其生物膜形成能力。

圖1 植物乳桿菌zwq9生長曲線及其生物膜形成能力Fig.1 Growth curve and biofilm formation of L.plantarum zwq9

如圖1A所示，植物乳桿菌zwq9的生長曲線呈典型的“S”型，能較清晰地區(qū)分延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，其中0～4 h為細(xì)菌生長的延滯期，4 h～10 h為對數(shù)期，隨后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。該菌株的生長符合細(xì)菌分批培養(yǎng)的典型生長規(guī)律。如圖1B所示，植物乳桿菌zwq9具有極強(qiáng)的生物膜形成能力，經(jīng)微量板半定量法檢測其OD490值高于4.0，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果保持一致[16-17]。

2.2 植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析

圖2為植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析。

圖2 植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析Fig.2 The component analysis of the biofilm formed by L.plantarum zwq9

如圖2所示，不同處理對植物乳桿菌zwq9的生物膜有不同影響，與對照組相比，采用高碘酸鈉處理后，生物膜的OD490值無顯著變化（P＞0.05），而經(jīng)蛋白酶K處理后，其OD490值顯著降低（P＜0.05），蛋白酶K處理后生物膜的OD490值僅為對照組的13.64%，表明在zwq9的生物膜結(jié)構(gòu)中，胞外蛋白質(zhì)可能發(fā)揮著重要作用。

2.3 不同脅迫條件對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

2.3.1 乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖3所示。

圖3 不同乳酸添加量對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.3 Effects of different lactic acid concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖3所示，當(dāng)外源乳酸添加量低于0.2%時，植物乳桿菌zwq9的生長及生物膜形成均不受影響，其OD590和OD490值與對照組（乳酸添加量為0%）相比均無顯著差異（P＞0.05）；在乳酸添加量為0.4%時，zwq9的生長濁度是對照組的90.51%，而其生物膜形成能力顯著降低了36%（P＜0.05）；當(dāng)乳酸添加量在0.8%以上時，其能夠顯著抑制zwq9的生長和生物膜的形成（P＜0.05），其OD590和OD490值比對照組均降低了90%以上。

2.3.2 溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖4所示。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.4 Effects of different culture temperatures on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于10℃時，植物乳桿菌zwq9的生長及生物膜形成能力在所有處理組中相對最低；當(dāng)培養(yǎng)溫度提升至30℃時，其生長及生物膜形成情況良好，此時與40℃處理組之間無顯著差異（P＞0.05），兩組生物膜形成的OD490值均大于4.0，并且均顯著高于10℃和20℃處理組（P＜0.05）。

2.3.3 鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖5所示。

圖5 不同鹽濃度對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.5 Effects of different salt concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖5所示，當(dāng)NaCl濃度低于4%時，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成與對照組（NaCl濃度為0%）無顯著差異（P＞0.05），但其生長受到一定影響。與對照組相比，1%NaCl顯著增加了植物乳桿菌zwq9的OD590值（P＜0.05），而4%NaCl則顯著抑制了植物乳桿菌zwq9的生長（P＜0.05），2%NaCl處理組的 OD590值與對照組無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)NaCl濃度高于 6%時，植物乳桿菌zwq9的生長及其生物膜形成能力均被顯著抑制（P＜0.05），當(dāng)NaCl濃度達(dá)到8%時，與對照組相比，其OD590值降低了90%以上，OD490值減小了98%以上。

通過對樣機(jī)進(jìn)行標(biāo)定獲得大量數(shù)據(jù),使用以上兩種方法進(jìn)行解耦運算,發(fā)現(xiàn)兩種方法解得的結(jié)果都有較大的誤差。其中使用求解標(biāo)定矩陣方法時發(fā)現(xiàn),該樣機(jī)當(dāng)單獨施加My或Mz方向的力矩時,其他方向會產(chǎn)生非常嚴(yán)重的維間耦合;使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的方法時發(fā)現(xiàn),對標(biāo)定數(shù)據(jù)的解算結(jié)果良好,但是當(dāng)將該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行對多維復(fù)合加載數(shù)據(jù)的驗證時,會產(chǎn)生極大的偏差。這兩個問題的出現(xiàn)意味著常用的兩種解耦方法無法針對該樣機(jī)使用。

2.4 不同脅迫條件對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

2.4.1 乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖6所示。

圖6 不同乳酸濃度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effects of different lactic acid concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖6所示，在乳酸脅迫條件下，隨著外源乳酸濃度的增加，植物乳桿菌zwq9產(chǎn)胞外蛋白酶活力呈下降趨勢；與對照組（乳酸濃度為0%）相比，當(dāng)乳酸濃度為0.2%時，菌株的產(chǎn)酶活力顯著下降了12.57%（P＜0.05）；當(dāng)濃度增加至0.4%時，產(chǎn)酶活力顯著低于對照組（P＜0.05），僅為對照組的60%；當(dāng)乳酸濃度增加至0.8%以上時，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)酶活力與對照組相比顯著降低（P＜0.05），降低了94%以上。

2.4.2 溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖7所示。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.7 Effects of different culture temperatures on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖7所示，溫度條件對植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)胞外蛋白酶活力也有較大影響。隨著培養(yǎng)溫度的升高，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)酶活力呈先增加再降低的趨勢，在30℃時，產(chǎn)酶活力相對最高，顯著高于其他處理組（P＜0.05），其次為40℃處理組，但其產(chǎn)酶活力僅為30℃處理組的50.79%。

2.4.3 鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖8 不同鹽濃度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.8 Effects of different salt concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖8所示，在不同鹽濃度脅迫體系中，隨著NaCl添加濃度的增加，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)胞外蛋白酶活力也整體呈先升高后降低的趨勢，添加1%NaCl能夠顯著增加zwq9的產(chǎn)酶活力（P＜0.05），產(chǎn)酶活力比對照組提高了43.80%，并且添加2%和4%NaCl處理組的產(chǎn)酶活力也顯著高于對照組（P＜0.05）；當(dāng)NaCl濃度高于8%時，zwq9的產(chǎn)酶活力顯著低于其他處理組（P＜0.05），與對照組相比降低了90%以上。這表明較低濃度NaCl（≤4%）的添加能夠在一定程度上提高zwq9的產(chǎn)蛋白酶活力，而高濃度NaCl（≥8%）的添加幾乎完全抑制了菌株的產(chǎn)酶活力。

2.5 相關(guān)性分析

采用SPSS 22對不同脅迫條件下植物乳桿菌zwq9的生長量（OD590值）、生物膜形成能力（OD490值）和產(chǎn)蛋白酶活力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。

表1 Pearson相關(guān)性分析Table 1 Pearson correlation analysis

由表1可知，在乳酸和鹽脅迫條件下，植物乳桿菌zwq9的生長量、生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

新疆地區(qū)由于其獨特的地理環(huán)境及歷史文化等因素，發(fā)酵肉、乳制品是優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源的重要來源，尤其是亟待充分開發(fā)利用的生物膜陽性乳酸菌資源。西熱娜依·阿布力克木等[22]從新疆阿圖什市和烏什縣傳統(tǒng)酸奶分離獲得57株乳酸菌，其中生物膜陽性菌38株，占73%，并且發(fā)現(xiàn)生物膜的形成能力與酸奶的拉絲特性呈正相關(guān)關(guān)系。本課題組前期從新疆特色酸奶及奶疙瘩等乳制品中分離獲得110株乳酸菌，其中生物膜陽性乳酸菌70株，占比63.64%[16]；遠(yuǎn)高于其他學(xué)者所報道的其他地區(qū)和來源乳酸菌的生物膜形成能力[23-24]。

細(xì)菌生物膜是由細(xì)菌細(xì)胞及其分泌至胞外的大分子物質(zhì)所組成的集合體，其組分通常包括胞外多糖、胞外蛋白、核酸及少量其他物質(zhì)，但不同種類細(xì)菌生物膜的組分及各組分的作用有較大差異[7，25-26]。李英等[20]對2株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的生物膜組分分析發(fā)現(xiàn)，菌株ATCC 35984的生物膜主要為胞外多糖，而臨床分離株5-121-2的生物膜中胞外蛋白起主導(dǎo)作用。金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC 29213的生物膜中，胞外蛋白含量最高，胞外多糖的含量相對最低[27]。在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的生物膜中，胞外蛋白的含量與生物膜的形成呈正相關(guān)，而胞外多糖的含量與生物膜的形成不具有相關(guān)性[28]。而本研究結(jié)果顯示在植物乳桿菌zwq9的生物膜中，胞外蛋白所起的作用比胞外多糖更為重要。乳酸菌是一類富產(chǎn)胞外多糖的細(xì)菌，該類多糖在食品工業(yè)應(yīng)用廣泛，而胞外多糖又是乳酸菌生物膜的組成部分，但產(chǎn)量高并不一定參與到乳酸菌的生理活動中，這與紀(jì)亞楠[29]的研究結(jié)果相一致。在不同脅迫體系中，乳酸菌生物膜形成無明顯變化時，其胞外多糖產(chǎn)量卻明顯降低，二者并未呈正相關(guān)關(guān)系。

在發(fā)酵乳、肉制品生產(chǎn)過程中，體系內(nèi)存在的多種脅迫因素等會促進(jìn)或抑制乳酸菌的產(chǎn)酶活力和生物膜形成能力，這些脅迫因素中最常見的有酸脅迫、溫度脅迫和鹽脅迫。這些因素不僅是菌體生長的重要控制條件，同時也關(guān)系到菌體的產(chǎn)酶活性及生物膜的形成能力。Sharma等[30]指出，體系的pH值影響微生物的產(chǎn)酶和營養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)胞膜運輸，這可能是由于在最適pH值時，質(zhì)子在化學(xué)滲透中的動力受體系pH值的影響，微生物的相對代謝效率較高，故產(chǎn)酶能力提升。體系溫度不僅影響與菌體產(chǎn)酶相關(guān)的細(xì)胞代謝，而且和酶與底物蛋白的反應(yīng)速率、分子作用強(qiáng)度及相關(guān)理化特性密切相關(guān)[31]。龐豐平等[32]通過Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面分析得出，瑞士乳桿菌（L.helveticus）的最優(yōu)產(chǎn)蛋白酶條件為發(fā)酵溫度36℃、起始pH6.65、發(fā)酵時間16 h，此時蛋白酶活力為22.59 U/mL。宋園亮等[33]對一株分離自云南豆豉中乳酸菌的產(chǎn)蛋白酶條件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)起始pH5.0、35℃發(fā)酵培養(yǎng)36 h，菌株的產(chǎn)蛋白酶活力可達(dá)32.50 U/mL。乳酸菌生物膜的形成也與體系的pH值和溫度密切相關(guān)。趙佳偉等[34]指出植物乳桿菌RS66CD在NaCl質(zhì)量濃度為53 g/L、40℃培養(yǎng)24 h時，菌株的生物膜形成量最大。紀(jì)亞楠[29]研究發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌生物膜形成的最佳條件不同，植物乳桿菌5-4-1生物膜形成的最佳條件為培養(yǎng)基pH7.5、培養(yǎng)溫度44℃、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，而對于乳酸片球菌（Pediococcus lactis）TG1-1-10，培養(yǎng)基 pH7.5、培養(yǎng)溫度30℃、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%時，其生物膜形成能力最強(qiáng)。在本研究中，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力及其產(chǎn)蛋白酶活力也受到培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)溫度的影響。植物乳桿菌的乳酸發(fā)酵屬于同型乳酸發(fā)酵，在其發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸在發(fā)酵液中逐漸積累導(dǎo)致pH值降低，進(jìn)而導(dǎo)致其生長量、生物膜形成能力及產(chǎn)蛋白酶活力均降低，尤其是當(dāng)乳酸添加量高于0.8%時，乳酸菌的生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力與對照組相比均降低90%以上。有學(xué)者指出，在乳酸菌的發(fā)酵進(jìn)程中，隨著體系中乳酸等酸性物質(zhì)的累積，乳酸菌細(xì)胞的生長及代謝活動被抑制，同時高濃度的酸使細(xì)胞質(zhì)中積累大量質(zhì)子，最終影響乳酸菌的增殖能力和各種生物活性功能[29]。培養(yǎng)溫度過高或過低均不利于乳酸菌的生長和代謝機(jī)能，在10℃時，植物乳桿菌zwq9的生長量、生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力均被抑制，而當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)蛋白酶活力顯著降低（P＜0.05），但其生長及生物膜形成能力與30℃相比無顯著差異（P＞0.05）。在低溫脅迫條件下，冷刺激會造成乳酸菌細(xì)胞的機(jī)械性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞流動性變差，甚至引起DNA損傷，最終導(dǎo)致乳酸菌生長及代謝活動減緩甚至停滯[35-36]；而在高溫脅迫下，可能會引起乳酸菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性和沉降，還會使細(xì)胞內(nèi)核糖體、RNA等多種大分子物質(zhì)的穩(wěn)定性下降，改變細(xì)胞膜的流動性等，進(jìn)而影響乳酸菌的生理特性及代謝活動[37-38]。

外界鹽脅迫條件對乳酸菌細(xì)胞的存活、增殖、代謝途徑及活力均有較大影響，進(jìn)而改變?nèi)樗峋陌l(fā)酵特性。有學(xué)者分析了鹽脅迫體系中嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和瑞士乳桿菌的產(chǎn)酶活力的變化，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可使兩種乳酸菌細(xì)胞活力下降、產(chǎn)酶活力升高，體系中游離氨基酸含量增加[39]；而隨著鹽濃度的進(jìn)一步增加，高鹽脅迫條件使乳酸菌的產(chǎn)酶活力迅速降低，細(xì)胞存活力也急劇下降，細(xì)胞膜的完整性遭到嚴(yán)重破壞[40]。對于乳酸菌生物膜，有學(xué)者指出，較低濃度的Na+能夠通過影響體系滲透壓平衡，促進(jìn)生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)，補(bǔ)償生物膜表型不穩(wěn)定等，促進(jìn)生物膜的形成[34，41-42]。這與本研究的結(jié)果較為相似，添加1%NaCl能夠顯著增加植物乳桿菌zwq9的生長量（P＜0.05），并顯著增強(qiáng)其產(chǎn)酶活力（P＜0.05）（可能對其生物膜形成能力也具有一定的增強(qiáng)效應(yīng)，但由于所用儀器最高限值的影響在本研究中的數(shù)據(jù)未顯示）。根據(jù)目前已有關(guān)于乳酸菌耐鹽機(jī)制的研究結(jié)果，植物乳桿菌的耐鹽機(jī)制主要包括相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)和糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)[43]，在相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)中，隨著NaCl添加量的增加，植物乳桿菌zwq9在細(xì)胞內(nèi)積累相容性物質(zhì)（如甘氨酸甜菜堿、海藻糖、脯氨酸等），這些物質(zhì)在維持細(xì)胞正常滲透壓的同時，也在一定程度上改變了乳酸菌的合成與代謝通路，進(jìn)而影響其生長、生物膜形成及胞外酶的產(chǎn)生等[43-44]；另一方面，一定濃度NaCl的添加會誘導(dǎo)植物乳桿菌糖酵解途徑（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）相關(guān)基因 pfk、fba、pgk、ldh等的表達(dá)量上調(diào)，使EMP途徑更為高效地進(jìn)行[45]，進(jìn)而導(dǎo)致植物乳桿菌的生長特性和發(fā)酵特性發(fā)生改變，影響其生長、生物膜形成和產(chǎn)蛋白酶活力。

綜上，本研究從生物膜形成及產(chǎn)生胞外蛋白酶方面著手，發(fā)現(xiàn)在不同脅迫條件下，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力與其產(chǎn)胞外蛋白酶活力緊密相關(guān)，二者呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），兩種代謝活動均隨乳酸菌細(xì)胞在不同脅迫條件下生理特性的改變而發(fā)生變化，這為進(jìn)一步開發(fā)利用優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源提供參考思路。