腫瘤抑制因子microRNA-218對(duì)前列腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展及腫瘤干細(xì)胞特性的調(diào)控作用

穆麗君，管 冰，田娟華，杜岳峰，李旭東

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是發(fā)達(dá)國(guó)家男性最常見的癌癥，2008年約有64.84萬(wàn)例新發(fā)病例和13.65萬(wàn)例死亡病例[1]。目前，雄激素剝奪療法是轉(zhuǎn)移性PCa的主要治療方法，然而許多患者卻出現(xiàn)了去勢(shì)抵抗PCa，使得治療效果不甚理想，這也是發(fā)達(dá)國(guó)家男性病例死亡的主要原因[2]。因此，我們迫切需要進(jìn)一步的研究來(lái)開發(fā)更有效的治療方法。

microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈RNA，通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3’-UTR來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[3-5]。已有研究報(bào)道，miRNAs(miR)在人類癌癥生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移和轉(zhuǎn)移[6-8]。就PCa的進(jìn)展而言，miR-34a可通過(guò)直接抑制CD44[9]從而抑制PCa干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)特性和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；miR-132/212可通過(guò)靶向SOX4抑制TGF-β介導(dǎo)的PCa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[10]。腫瘤抑制性miR-29可靶向PCa中的LAMC1抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[11]。我們先前的研究也報(bào)道了miR-218在PCa中起到腫瘤抑制的作用，但miR-218在調(diào)節(jié)PCa干細(xì)胞和EMT中的作用仍不明確。為此，本研究就miR-218在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)及在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)PCa細(xì)胞系遷移、EMT和腫瘤干細(xì)胞特性的影響作一探索并報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)PCa細(xì)胞系LNCaP和C4-2購(gòu)買自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，前列腺-上皮細(xì)胞(BPH-1)細(xì)胞由美國(guó)德克薩斯州達(dá)拉斯德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Jer-Tsong Hsieh博士提供。這3種細(xì)胞均培養(yǎng)于添加了10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclone， GE Healthcare Life Sciences)的RPMI-1640培養(yǎng)基中(Gibco，Thermo Fisher Scientific)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2。

1.2 總RNA提取和qPCR分析依據(jù)試劑使用說(shuō)明，應(yīng)用Trizol(Thermo Fisher Scientific)從收獲的細(xì)胞中提取總RNA，并使用miSccript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen，GmbH，Hilden)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96 PCR系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)和SYBR-Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio)用于檢測(cè)miR-218的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃下30 s，然后在95 ℃下40次循環(huán)每次5 s，最后在60 ℃下30 s。使用U6作為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCq方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)[12]。使用的引物序列如下：miR-218正向引物5’-CGA GTG CAT TTG TGC TTG ATC TA-3’，反向引物5’-TAA TGG TCG AAC GCC TAA CGT C-3’；U6正向引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物5’-TGG TGT CGT GGA GTC G-3’。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染LNCaP和C4-2細(xì)胞接種培養(yǎng)皿并培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞融合度達(dá)到40%～50%時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建慢病毒載體3(LV3-miR-218)，和LV3加擾慢病毒載體(LV3-NC)作為陰性對(duì)照，用于隔夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。慢病毒感染細(xì)胞后48 h，通過(guò)嘌呤霉素(2～3 μg/mL)(Sigma-Aldrich)抗性培養(yǎng)維持miR-218過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的穩(wěn)定克隆。

1.4 Transwell遷移試驗(yàn)在24孔板內(nèi)加入1 mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化劑。將孔徑為8 μm的Transwell小室(Millipore)放入24孔板中，再將懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞以(5～8)×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種到小室上層，接種體積為400 μL/孔。培養(yǎng)20 h后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，接著用棉簽輕擦除上室表面未穿出的細(xì)胞，然后將小室在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，最后用PBS清洗干凈。在顯微鏡下觀察，放大200倍，每孔隨機(jī)選6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)用提前在4 ℃預(yù)冷的PBS涮洗細(xì)胞，然后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，接著通過(guò)Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量(Abcam)。每份樣品取30 μg蛋白質(zhì)所需的體積，通過(guò)12%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜中。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜在室溫下于50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，然后將膜孵育在一抗中，4 ℃過(guò)夜。應(yīng)用一抗?jié)舛燃皩?duì)應(yīng)貨號(hào)如下：GAPDH (1∶10 000;貨號(hào)KC-5G4; 康成生物); E-cadherin (1∶1 000; 貨號(hào)sc-8426; Santa Cruz); Vimentin (1∶200; 貨號(hào)sc-6260; Santa Cruz); CD44 (1∶800; 貨號(hào) 3 570; Cell Signaling Technology); Oct4 (1∶500; 貨號(hào) ab18976; Abcam); Nanog (1∶200;貨號(hào) ab21624; Abcam)。接著將膜在含有0.1%吐溫(Tween)的三緩沖鹽水(tris-buffered saline)中緩慢洗滌3次，并與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗山羊抗兔IgG(1∶2 000；貨號(hào)ZB-2301，傲銳東源)或山羊抗鼠IgG(1∶2 000；貨號(hào)ZB-2305，傲銳東源)在室溫下孵育1 h。最后使用分子成像儀ChemiDoc XRS系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行成像。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)6孔板中每孔接種約2×103個(gè)細(xì)胞，孵育10～14 d。用PBS涮洗3次，接著用40 g/L多聚甲醛在室溫固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用PBS清洗干凈后，對(duì)每孔的細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 腫瘤成球?qū)嶒?yàn)在低粘附性6孔板中每孔接種約1×104個(gè)細(xì)胞，添加無(wú)血清F12培養(yǎng)基，及20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子，10 ng/mL基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及2% B27(皆來(lái)自Invitrogen; Thermo Fisher Scient)。培養(yǎng)2周后，使用倒置顯微鏡放大200倍觀察細(xì)胞成球情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 6.0版本進(jìn)行。兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)比較；3組及以上的比較，采用單因素方差分析和Tukey法檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-218在PCa細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)應(yīng)用RT-qPCR比較PCa細(xì)胞和人正常前列腺上皮細(xì)胞(BPH-1)miR-218的表達(dá)。結(jié)果顯示，與人正常BPH-1相比，PCa細(xì)胞系LNCaP和C4-2中miR-218的表達(dá)顯著下調(diào)(U6作為內(nèi)參)。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)miR-218的PCa細(xì)胞系為了揭示miR-218對(duì)PCa細(xì)胞遷移、EMT以及CSC特性的影響，我們通過(guò)搭載LV3-miR-218的慢病毒載體轉(zhuǎn)染PCa細(xì)胞系LNCaP和C4-2，構(gòu)建了2種穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-218的PCa細(xì)胞系，接著RT-qPCR檢驗(yàn)過(guò)表達(dá)效率。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-218可抑制PCa細(xì)胞遷移和EMTTranswell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-218過(guò)表達(dá)抑制了LNCaP和C4-2細(xì)胞的遷移(圖1)。同時(shí)EMT標(biāo)記物的Western blot結(jié)果顯示，miR-218過(guò)表達(dá)導(dǎo)致E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達(dá)輕微增加，波形蛋白(vimentin)表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明，miR-218的過(guò)度表達(dá)可抑制PCa細(xì)胞的遷移和EMT。

A：miR-218過(guò)表達(dá)抑制了LNCaP細(xì)胞的遷移；B：在C4-2細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。以上數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(×200)。與LV3-NC相比，*P<0.05。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒載體3；NC，陰性對(duì)照。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-218可抑制PCa細(xì)胞CSC特性在驗(yàn)證miR-218過(guò)表達(dá)可抑制PCa細(xì)胞遷移和EMT之后，我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析。結(jié)果表明，miR-218的過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)CD44、Oct4和Nanog的表達(dá)。此外，我們進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步評(píng)估PCa細(xì)胞的自我更新能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miR-218的LNCaP細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆更少、更小(圖2A)。在C4-2細(xì)胞中進(jìn)行的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也獲得了類似的結(jié)果(圖2B)，這表明miR-218可能在腫瘤生長(zhǎng)抑制中起關(guān)鍵作用。腫瘤成球試驗(yàn)已被廣泛應(yīng)用于測(cè)量干細(xì)胞的自我更新能力，表明miR-218的過(guò)表達(dá)可降低PCa細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

A：在集落形成試驗(yàn)中，與對(duì)照組LV3-NC細(xì)胞相比，LNCaP-LV3-miR-218細(xì)胞形成的集落更少、更小；B：C4-2-LV3-miR-218細(xì)胞較LV3-NC細(xì)胞相比，形成的細(xì)胞集落更少且更小。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒載體3；NC:陰性對(duì)照。

3 討 論

近年來(lái)，PCa的診斷和治療雖取得了一定的進(jìn)展[13]，但有關(guān)PCa的研究仍具挑戰(zhàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EMT和CSC對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[14-18]，且先前研究表明，miRNA在人類癌癥生物學(xué)過(guò)程中也起著重要作用，包括發(fā)生、發(fā)展、遷移和轉(zhuǎn)移[19-23]。miR-218作為腫瘤抑制因子，在多種類型的人類癌癥中表達(dá)下調(diào)[24-28]。miR-218可抑制膠質(zhì)瘤、宮頸癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、EMT、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和自我更新[29-33]。有研究闡明，PCa中miR-218的表達(dá)降低，而其可通過(guò)抑制富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體4(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 4，LGR4)表達(dá)阻止白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)誘導(dǎo)的PCa細(xì)胞增殖和侵襲[34]。miR-218還被證明通過(guò)抑制TPD52表達(dá)進(jìn)而抑制PCa細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡[35]，并通過(guò)靶向LASP1抑制PCa細(xì)胞遷移和侵襲[36]。因此，我們推測(cè)miR-218也可能抑制PCa細(xì)胞的EMT和CSC特性。

在本研究中，miR-218在PCa細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-218的LNCaP/C4-2細(xì)胞可顯著抑制PCa細(xì)胞的遷移。Western blot結(jié)果顯示，miR-218的過(guò)表達(dá)下調(diào)了波形蛋白、CD44、Oct4和Nanog的表達(dá)。在集落形成試驗(yàn)中，miR-218過(guò)表達(dá)細(xì)胞所形成的集落比對(duì)照組要少且小。此外，與miR-218過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞相比，對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤球數(shù)量更多，這表明miR-218過(guò)度表達(dá)可抑制PCa的干細(xì)胞特性。

總之，本研究表明miR-218在抑制PCa細(xì)胞的遷移、EMT和CSC特性方面起著關(guān)鍵作用。這為闡明PCa癌變的潛在機(jī)制提供了新的見解，并表明miR-218可能是PCa的潛在治療靶點(diǎn)。