UPLC-MS/MS測(cè)定桂皮中的氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留

吳曉萍

福建中檢華日食品安全檢測(cè)有限公司（福州 350028）

桂皮（或肉桂、官桂或香桂）常被用作中藥、香料和調(diào)料。但近年來(lái)，隨著食品安全要求的提高和農(nóng)藥的不合理使用，使得各個(gè)國(guó)家對(duì)這類(lèi)產(chǎn)品制定嚴(yán)格的限量。農(nóng)藥殘留問(wèn)題影響我國(guó)桂皮的出口，故有必要建立一種能快速檢測(cè)桂皮中農(nóng)藥殘留的方法。

關(guān)于桂皮中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜（GC）[1-3]和氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）[4-5]。GC或GC-MS/MS對(duì)于檢測(cè)苯氨基甲酸酯類(lèi)等沸點(diǎn)高且熱穩(wěn)定性差的化合物并不適用，而液質(zhì)聯(lián)用色譜對(duì)于這些化合物卻有著高于GC或GC-MS/M的選擇性和靈敏度[6]。桂皮一種相對(duì)基質(zhì)較復(fù)雜中草藥，為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和避免對(duì)儀器造成污染，開(kāi)發(fā)一種有效凈化前處理很有必要。農(nóng)藥檢測(cè)常用的提取方法有固相萃?。⊿PE）[7]、基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）[8]、加速溶劑萃取法（ASE）[9]、液-液萃取（LLE）[10]和凝膠色譜法（GPC）[11]。其中，部分方法（如MSPD）需要大量有機(jī)溶劑（LLE）、特殊設(shè)備（GPC和ASE）和勞動(dòng)量，所以環(huán)保型的檢測(cè)技術(shù)是目前主推的檢測(cè)手段[12]，如QuEChERS技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便，分析速度快，溶劑使用量少，污染小，近年來(lái)被廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)農(nóng)藥的多殘留測(cè)定，但在對(duì)復(fù)雜基質(zhì)凈化效果這方面還存在欠缺。因此，選擇一款高選擇性的凈化劑成為關(guān)鍵突破口，據(jù)報(bào)道，多壁碳納米管作為凈化劑被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥的檢測(cè)[13-15]，其吸附性能不僅優(yōu)于C18、GCB和PSA等常用吸附材料，而且擁有高選擇性。故試驗(yàn)采用改良后的前處理方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立桂皮中氨基甲酸酯類(lèi)的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS（Agilent 1290-6470，安捷倫有限公司）；低速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；克百威、3-羥基克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、甲萘威和異丙威（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）；PSA粉末（美國(guó)Supelco公司）；多壁碳納米管（上海麥克林生化科技有限公司）；多管渦旋混勻儀（逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和乙酸銨均為分析純或色譜純（國(guó)藥科技）；試驗(yàn)用水為三重過(guò)濾去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的8種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解、定容配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃的冰箱儲(chǔ)存。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣置于-18 ℃儲(chǔ)存。

1.3 樣品的前處理

將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL超純水渦旋30 s后浸泡30 min，加入15 mL乙腈、5.0 g氯化鈉混勻和漩渦振蕩3 min，在4 000 r/min條件下離心5 min，離心后取2.00 mL上清液于5 mL離心管（50 mg PSA、150 mg無(wú)水硫酸鎂和5.0 mg選擇性多壁碳納米管），漩渦振蕩2 min，在15 000 r/min條件下高速離心5 min，取上層清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜條件

色譜條件：ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙酸銨水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min，75% A；1～2.5 min，75%～70% A；2.5～4 min，10% A；4～5 min，10%～75% A，5～7 min，75%A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度300 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔反吹氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

表1 8種農(nóng)藥的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP）

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

氨基甲酸酯類(lèi)化合物是含有較強(qiáng)的電負(fù)性元素，如氧原子和氮原子等，在ESI+模式下，氨基甲酸酯類(lèi)化合物中的這些強(qiáng)電負(fù)性元素可以和噴霧液滴中的H+形成加合離子（[M+H]+），從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。一般進(jìn)樣瓶和溶劑存在微量的鈉離子，這些鈉離子會(huì)和目標(biāo)物形成較強(qiáng)的加合離子（[M+Na]+），從而降低基于[M+H]+的檢測(cè)靈敏度。但如果向流動(dòng)相的水相中添加適量NH4+，便可有效抑制[M+Na]+的形成從而提高檢測(cè)[M+H]+的靈敏度[16]。通過(guò)MS2Scan選擇豐度最高的母離子，對(duì)去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)產(chǎn)物離子掃描選擇2個(gè)響應(yīng)較大的子離子并對(duì)兩者的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)值大的1組設(shè)為定量離子對(duì)，響應(yīng)強(qiáng)度相對(duì)較弱的1組設(shè)為定性離子對(duì)。

為保證各農(nóng)藥成分擁有足夠的靈敏度和較好的峰形，同時(shí)考察乙腈-水溶液（0.1%甲酸）、乙腈-含4 mmol/L乙酸銨的水溶液（0.1%甲酸）這2種流動(dòng)相體系，得到如圖1所示的總離子流圖：選擇乙腈-含4 mmol/L乙酸銨的水溶液（0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，僅有部分農(nóng)藥化合物（如涕滅威、滅多威）響應(yīng)強(qiáng)度被抑制，大部分農(nóng)藥化合物響應(yīng)度高，峰形較好，故選擇加4 mmol/L乙酸銨的-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

圖1 8種化合物的總離子流圖

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 樣品加水量的考察

從含水量低的樣品中提取農(nóng)藥時(shí)，用溶劑直接浸提難以充分滲透到組織內(nèi)部，加入適量的水進(jìn)行復(fù)水處理有利于提高目標(biāo)農(nóng)藥的回收率。試驗(yàn)比較目標(biāo)農(nóng)藥分別加入5，10，15和20 mL水量后的回收率，結(jié)果表明，加水量5 mL時(shí)，6種農(nóng)藥回收率＜70%；加水量10 mL時(shí)，8種農(nóng)藥的回收率在70%～110%；加水量＞10 mL時(shí)，回收率＞110%的農(nóng)藥數(shù)量明顯增多，且20 mL加水量的高回收率農(nóng)藥數(shù)量較10 mL加水量的多。因此，2 g桂皮中加入10 mL水時(shí)，各個(gè)農(nóng)藥化合物的提取效果最佳。

2.2.2 提取溶劑的選擇

為探究最佳提取方法，同時(shí)對(duì)乙腈、乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷4種提取溶劑進(jìn)行考察，以8種農(nóng)藥在桂皮上的平均回收率為評(píng)定依據(jù)。在樣品提取前加入10.0 mL超純水渦旋30 s，靜置30 min，提高樣品的分散程度，增大比表面積。結(jié)果表明，二氯甲烷和乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，提取液顏色較深，提取出來(lái)的雜質(zhì)較多；丙酮屬于易制毒溶劑且不易與水形成分層，對(duì)后續(xù)操作帶來(lái)較多不便；乙腈與水可互溶，水可以進(jìn)入植物組織內(nèi)部，兩者結(jié)合可以增加滲透性，從而明顯提高提取率。另外，乙腈可以適用極性范圍相對(duì)廣泛的農(nóng)藥，加入氯化鈉可使得離子濃度增大且介電常數(shù)增大，可具有高離子溶劑的特征，有機(jī)物基本上沒(méi)有離子特征，兩者的溶解度進(jìn)一步增大，可促進(jìn)兩者快速分層，故提取溶劑選用乙腈。

2.2.3 凈化劑的選擇

傳統(tǒng)的QuEChERS吸附劑主要有PSA、GCB、C18和MgSO4，其中PSA是一種含有2個(gè)氨基的吸附劑，在不同的環(huán)境對(duì)不同的物質(zhì)具有不同的吸附能力，故經(jīng)常用于可除去樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖類(lèi)等物質(zhì)；GCB能去除色素、類(lèi)胡蘿卜素、固醇，但是對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)目標(biāo)物也有吸附，故很多文獻(xiàn)報(bào)道在提取劑中加入甲苯可以提高回收率，但甲苯是易制毒化合物且對(duì)人體傷害很大；然而MWCNTs（一種呈管狀結(jié)構(gòu)新型的納米材料）的吸附特性一定程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的吸附劑，開(kāi)展對(duì)其吸附性的探究試驗(yàn)，固定PSA 50 mg、MgSO4150 mg用量條件下，考察不同MWCNTs用量（0，2，5，10和15 mg）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明5 mg用量時(shí)目標(biāo)物回收率最好。綜合考慮凈化效果與回收率，選擇5 mg多壁碳納米管作為吸附劑。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的線(xiàn)性范圍、檢出限與定量限

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，用桂皮空白樣品提取液將8種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液混合儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋?zhuān)渲瞥?.001～0.05 μg/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[橫坐標(biāo)為8種農(nóng)藥化合物的質(zhì)量濃度（x，μg/mL），縱坐標(biāo)為定量離子峰面積（y）]，以3倍信噪比計(jì)算8種農(nóng)藥化合物在基質(zhì)中的檢出限（SLOD），以最小添加濃度為定量限（SLOQ）。結(jié)果顯示，在0.001～0.05 μg/mL范圍內(nèi)，8種農(nóng)藥化合物的質(zhì)量濃度與其峰面積間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.99，8種氨基甲酸酯類(lèi)的檢出限為0.003～0.007 mg/kg（詳見(jiàn)表2）。

表2 桂皮中8種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

相比于氣相色譜，液質(zhì)聯(lián)用色譜的基質(zhì)效應(yīng)原因?yàn)?，基質(zhì)干擾成分的共流出抑制目標(biāo)物的離子化效率，其存在常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況存在誤差[17]。通常情況下，基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率的比值越接近1，基質(zhì)效應(yīng)越小。若比值＜1表現(xiàn)減弱的基質(zhì)效應(yīng)，比值＞1表現(xiàn)增強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。對(duì)桂皮的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，首先對(duì)桂皮空白樣品進(jìn)行前處理（按1.3節(jié)的方法），配制、測(cè)定空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果顯示，桂皮的匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率的比值為-6.36～-4.33（＜1），說(shuō)明其表現(xiàn)出較大的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。

2.3.3 加標(biāo)回收率與精密度

往空白的桂皮基質(zhì)中添加SLOQ，2倍SLOQ和10倍SLOQ這3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加標(biāo)水平均做6次平行試驗(yàn)，并優(yōu)化條件后測(cè)定，結(jié)果如表3所示。8種氨基甲酸酯類(lèi)回收率范圍在71.0%～110.7%，SRSD區(qū)間為1.7%～10.3%。如此可見(jiàn)，該方法的準(zhǔn)確度、精密度較高，可用于測(cè)定樣品中多種農(nóng)藥殘留。

表3 8種農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 樣品的測(cè)定

采用建立的方法測(cè)定20批市售桂皮樣品中8種農(nóng)藥殘留，有3批的克百威及其代謝物3-羥基克百威有檢出，檢出值在0.02～0.08 mg/kg，其余農(nóng)藥尚未有檢出。

3 結(jié)論

研究建立了8種氨基甲酸酯類(lèi)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）快速篩查方法。乙腈作為提取溶劑，采用改進(jìn)的QuEChERS凈化方法，UPLC-MS/MS測(cè)定。該方法在0.001～0.05 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，R2＞0.99，檢出限為0.003～0.007 mg/kg。在SLOQ（0.02 mg/kg），2倍SLOQ（0.04 mg/kg）和10倍SLOQ（0.2 mg/kg）3個(gè)添加水平下，8種氨基甲酸酯類(lèi)在桂皮中的平均回收率均為71.0%～110.7%，SRSD區(qū)間為1.7%～10.3%，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。