金針菇多糖的提取純化及生物活性研究進展

申鑫玉，黃悅同，阿依江·特列吾汗，鄭艷，岳喜慶

沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院（沈陽 110866）

金針菇（Flammulina velutipes）又名樸菇、智力菇、金菇等，是中國和日本最受歡迎的食用菌之一[1]。從歷史上看，自公元800年以來，中國一直在種植供食用和藥用。如今，金針菇作為膳食補充劑也被廣泛應(yīng)用于一些西方國家。金針菇是一種低熱量的食物，不僅味道鮮美且具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，富含多種營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)元素及各種功能因子，這些物質(zhì)均為人體所必需，長期食用對人體健康有益。

近年來，金針菇中生物活性物質(zhì)越來越受科研工作者所關(guān)注，已成為研究的熱點，在功能性食品等方面具有良好的應(yīng)用前景。在金針菇的子實體中已分離出許多具有生物活性的化合物，如多糖、類黃酮、蛋白質(zhì)、酚類和倍半萜等。主要生物活性成分之一多糖，被證明具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、改善學習記憶能力、保肝等生物活性作用[2-4]。對近年來國內(nèi)外金針菇多糖（Flammulina velutipespolysaccharide，F(xiàn)VP）的研究進行整理、歸納和總結(jié)，綜述金針菇多糖的提取純化技術(shù)、結(jié)構(gòu)解析、生物活性及其作用機理，以期為深入研究多糖的構(gòu)效關(guān)系及更好地發(fā)展工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 金針菇多糖的提取

金針菇多糖的提取率受提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)和初始pH等因素的影響，并且不同的提取方法對多糖得率，以及單糖組成、分子量和結(jié)構(gòu)特征等均有一定影響。傳統(tǒng)提取方法存在操作時間長等缺點，為提高提取效率，超聲波輔助提取法等一系列方法得到發(fā)展。國內(nèi)外應(yīng)用的提取方法及優(yōu)缺點如表1所示。

表1 金針菇多糖的提取方法

1.1 傳統(tǒng)提取法

熱水提取法是最常見的傳統(tǒng)提取方法之一，溫度在60～100 ℃，高于或低于最佳溫度范圍會使提取效率降低。熱水提取法得到的多糖主要以β-（1→3），（1→4），（1→6）糖苷鍵為主鏈的葡聚糖構(gòu)成。劉曉敏等[5]通過單因素試驗和響應(yīng)面分析得到金針菇子實體多糖的最佳提取條件：提取溫度96 ℃、料液比1∶40、提取時間2.26 h，在此條件下粗多糖得率為3.82%。傳統(tǒng)的水提取法所需的高溫可能會破壞金針菇中多糖的化學結(jié)構(gòu)，進而影響生物活性。因此，多采用熱水提取法與其他方法相結(jié)合。

酸堿提取法一般在熱水提取法后進行，酸堿提取液可使多糖迅速沉淀，將樣品干燥、粉碎，并用1∶15（w/V）的沸水提取2 h，在4 ℃下與等體積的0.8 mol/L三氯乙酸混合3 h，將上清液與95%乙醇混合，最終獲得多糖。盡管傳統(tǒng)提取方法易于實施，但需要較長的提取時間、大量的溶劑和高溫，阻礙其廣泛的商業(yè)應(yīng)用。

1.2 超聲輔助提取法

超聲波在金針菇多糖提取過程中對多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生空化效應(yīng)及攪拌作用，空化會導致局部的壓力和溫度升高，致使細胞破裂，從而促進溶質(zhì)分子的擴散性、溶解性和運輸能力，但多糖的構(gòu)象不會改變[6]。作用產(chǎn)生的瞬時高壓或剪切力可破壞金針菇多糖鏈的三螺旋結(jié)構(gòu)并降解為分子質(zhì)量多糖，有效增加多糖的提取率。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)超聲功率680 W、提取時間19.8 min、料液比1∶28時，粗多糖得率為16.20%，提取率遠高于傳統(tǒng)提取方法。超聲輔助提取可能會降解一部分可溶性多糖，但對多糖生物活性的影響并不顯著。

1.3 酶輔助提取法

酶可以有效催化金針菇細胞壁基質(zhì)的水解和降解，從而釋放出胞內(nèi)生物活性物質(zhì)。常用的酶有纖維素酶、胰蛋白酶、果膠酶和木瓜蛋白酶。陳貴堂等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加木瓜蛋白酶可以顯著提高金針菇根部多糖得率，木瓜蛋白酶添加量1.5%、料液比1∶20、酶解pH 5.5、酶解溫度52 ℃、酶解時間82 min時多糖提取率為5.90%。此外，多酶水解具有協(xié)同作用，有利于打破分子間的物理化學聯(lián)系，釋放出更多的多糖，提高多糖提取率。

1.4 微波輔助提取法

微波加熱可對極性分子取向進行轉(zhuǎn)變，使分子發(fā)生振動和旋轉(zhuǎn)，細胞中的水分蒸發(fā)，從而增加分子間碰撞的頻率及溫度急劇上升導致內(nèi)壓增加[9]。巨大的壓力使細胞破裂，進而使多糖分子釋放。張斌等[10]以金針菇廢渣為原料，利用微波輔助提取法從中提取多糖，確定料液比1∶26、微波功率640 W、微波時間115 s為最佳提取條件，此條件下多糖得率為7.53%。該方法得到的多糖提取時間較短且提取率高，這可能是由于微波輻射會破壞細胞壁，使得內(nèi)容物更好地與溶劑接觸。

1.5 亞臨界水萃取法

亞臨界水萃取法也稱熱壓水提取法，是一種在高壓下使水在超過沸點的情況下依舊保持液態(tài)的新技術(shù)。根據(jù)使用溫度，該方法可以選擇性地提取不同種類的化合物，極性較大的化合物在較低的溫度下提取，極性較小的化合物在較高的溫度下提取。程斌[11]研究表明，亞臨界水萃取FVP的最佳提取條件為萃取壓力7 MPa、料液比1∶20、提取溫度150 ℃、提取時間12 min，在此條件下多糖得率為5.21%。該方法的高溫和高壓可以提高代謝物的溶解度，但同時會引起多糖結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，導致其應(yīng)用受到高溫高壓特性的限制。

1.6 其他提取方法

近年來，對多相提取系統(tǒng)的關(guān)注度日益增加，雙水相萃取法可以同時提取2種或多種組分多糖，逐漸被應(yīng)用于小分子的分離純化[12]。高壓脈沖電場提取法是通過變壓器將220 V直流電變?yōu)樯锨Х涣麟?，?jīng)過整流變回為高壓直流電，該過程可使細胞壁瞬間破裂，導致細胞內(nèi)容物流出[13]。超臨界CO2萃取法是利用溫度和壓力使超臨界CO2與待分離物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性、分子量和沸點不同的成分萃取出來[14]。關(guān)于提取金針菇多糖的研究中大多數(shù)集中在如何提高提取率上，而多糖的理化性質(zhì)和化學結(jié)構(gòu)很大程度取決于提取多糖的方式。對于比較提取方法與化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)之間的關(guān)系尚且缺乏研究。

2 分離純化

金針菇粗多糖通常含有各種雜質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、色素及小分子物質(zhì)等，這些雜質(zhì)會影響多糖的結(jié)構(gòu)和活性。除蛋白的主要方法有Sevage法、三氯乙酸法、蛋白酶水解法和三氟三氯乙烷法。Sevage法是最廣泛且經(jīng)典的除蛋白方法，此方法操作簡單、成本低，但需重復(fù)多次。三氯乙酸法是將三氯乙酸與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶性鹽從而使蛋白質(zhì)變性。蛋白酶水解法對多糖的破壞小，但成本較高。三氟三氯乙烷法的去除率較高，但因其具有揮發(fā)性，不宜大量使用。

在提取多糖的過程中可能會混入一些酚類物質(zhì)，導致多糖溶液顏色加深，因此需要除去色素。常用的脫色素方法主要有活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法和過氧化氫（H2O2）法。活性炭吸附法主要是利用對色素具有吸附作用。該方法操作簡單且成本較低，但多糖損失率較大。大孔樹脂吸附法是根據(jù)其多孔結(jié)構(gòu)對多糖進行脫色。該方法雖脫色率高但成本高，使用率較低。H2O2法是利用H2O2將色素氧化，進而除去色素。H2O2法操作簡單、脫色率高且成本低，是除色素中使用率較高的方法。

除去蛋白和色素后，多糖中還會混有一些小分子物質(zhì)，因此要對多糖溶液進行透析。常用的為半透膜法，根據(jù)半透膜孔徑大小截留或去除分子量不同的物質(zhì)。提純后通常獲得的是幾種組分形成的多糖混合物，很難同時對多組分多糖進行分析，因此需要對提純后的多糖進行進一步純化得到單一組分多糖?？墒褂贸瑸V、凍融、沉淀或柱層析進一步純化多糖。在這些純化方法中，柱層析法使用最多，因其成本低、效率高[22]。柱層析主要有凝膠柱層析、離子交換柱層析和纖維素柱層析。多糖可基于不同的離子性質(zhì)通過陰離子交換層析分離，并根據(jù)不同的分子量通過凝膠過濾層析進一步純化，并非得到單一組分多糖。

3 金針菇多糖的結(jié)構(gòu)表征

FVP結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，但由于多糖的活性可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，因此有必要研究其結(jié)構(gòu)特性。多糖是由一系列單糖通過糖苷鍵連接而成的，可分為同多糖和雜多糖，F(xiàn)VP大多為雜多糖，除了其單糖單元具有不同類型和順序外，其在分子量、單糖組成及糖苷鍵等方面也不同，這導致其結(jié)構(gòu)的多樣性[23]。

高效凝膠色譜、高效液相色譜（HPLC）和高效尺寸排阻色譜等分析方法用于測定多糖的分子量。在單糖組成的研究中，通常將FVP進行水解和衍生，通過HPLC、氣相色譜-質(zhì)譜和高效陰離子色譜等進一步分析。甲基化分析及核磁共振光譜可以確定主鏈和支鏈的組成。研究FVP的官能團通常采用紅外光譜、傅里葉紅外光譜和紫外光譜。高碘酸鹽氧化、Smith降解及還原裂解通常用于確定糖苷鍵類型[24]。掃描電鏡及原子力顯微鏡通常用于高級結(jié)構(gòu)的測定。

FVP的單糖組成主要包括葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）和木糖（Xyl），分子量范圍主要為3.84～2 782 kDa[25]。Smiderle等[26]從金針菇子實體中得到由Glc組成的均一多糖PK2，PK2為支鏈型β-葡聚糖，主鏈為（1→3）-Glcp殘基，在O-6位點被β-Glcp側(cè)鏈取代。嚴茂祥等[27]從金針菇中提取多糖得到3個組分FVP-1、FVP-2、FVP-3，平均分子量依次為10×104，4×104和2×104Da，且3個組分均主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及木糖組成。不同組分多糖的單糖組成、分子量和糖鏈結(jié)構(gòu)等均會呈現(xiàn)一定差異。

4 金針菇多糖的生物活性

多糖作為金針菇中的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤、改善學習記憶、抗炎癥、保肝等生物活性作用，對人體健康十分有益。FVP的生物活性及簡單的作用機理如圖1所示。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VP可作為改善或減輕癥狀的膳食補充劑用于對抗疾病[15]。但對生物活性的研究普遍傾向于細胞和動物試驗，并且對生物活性的作用機理及構(gòu)效關(guān)系的研究還不夠深入。

圖1 金針菇多糖的生物活性及作用機理

4.1 抗氧化

活性氧自由基（ROS）在細胞信號傳導和生物體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用。許多疾病都是由自由基引起的，因此具有抗氧化作用的物質(zhì)可以對此改善和緩解。研究表明，F(xiàn)VP能有效清除自由基，具有顯著的抗氧化作用，維持機體氧化代謝產(chǎn)生的ROS在機體內(nèi)的動態(tài)平衡狀態(tài)以保護細胞免受氧化應(yīng)激。有研究表明抗氧化性能與FVP的分子量有關(guān)。Liu等[18]從金針菇渣中提取多糖，并通過柱層析純化得到多糖FVRP-1、FVRP-2、FVRP-3，平均分子量分別為29 930，62 290和36 310 Da，三者均具有較強的抗氧化性，其順序為FVRP-1＜FVRP-3＜FVRP-2。且金針菇酸性多糖的清除自由基活性高于中性多糖。這是因為酸性多糖是由糖醛酸組成的復(fù)雜酸性碳水化合物。糖醛酸可以改變碳水化合物的理化性質(zhì)和溶解性，從而增強多糖的抗氧化活性。

4.2 免疫調(diào)節(jié)作用

FVP主要通過激活巨噬細胞、B細胞、T細胞和NK細胞，加速脾細胞增殖來增加抗體的分泌，同時還能增加B細胞分泌的IgG和IgM的水平，從而達到免疫調(diào)節(jié)的功能。多糖中的β-葡聚糖與dectin-1受體結(jié)合后出現(xiàn)在不同的細胞上，包括巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞產(chǎn)生信號傳導，導致觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶，進而產(chǎn)生細胞因子，促進免疫反應(yīng)[28]。Liang等[29]采用蛋白質(zhì)組學和腸道菌群學研究FVP對免疫抑制小鼠的調(diào)節(jié)作用機制，結(jié)果表明FVP通過參與轉(zhuǎn)運與分解代謝、吞噬體等信號通路調(diào)節(jié)免疫蛋白，增加腸道菌群豐度，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，多糖的免疫活性與其主鏈結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關(guān)。不同的食用菌多糖具有不同的化學成分，其中大多數(shù)以β-葡聚糖為主，在葡聚糖主鏈上以β-（1-3）-Glc作為主要的連接方式。高分子量的葡聚糖比低分子量的葡聚糖更有效。Chen等[6]研究超聲輔助提取法和熱水提取法提取的2種金針菇多糖FVPU和FVPH對免疫調(diào)節(jié)活性的影響，研究表明，兩者均可增強A型巨噬細胞的吞噬活性，但最高濃度50 μg/mL時，F(xiàn)VPH的激活作用優(yōu)于FVPU，這可能由于FVPU的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。由此可見，F(xiàn)VP的三螺旋結(jié)構(gòu)在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用。FVP有助于機體提高免疫力，不僅可作調(diào)節(jié)腸道微生物群的益生元劑，還具有作為功能性食品或免疫調(diào)節(jié)劑的潛能。

4.3 抗腫瘤

FVP主要通過清除自由基和增強細胞的免疫調(diào)節(jié)功能從而間接抑制腫瘤細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡或轉(zhuǎn)移。1982年，Ikekawa等[30]從金針菇中提取、分離純化后得到的多糖，首次通過分析發(fā)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性之間的關(guān)系，即分子量大的多糖具有更高的抗腫瘤活性。Yang等[31]從金針菇中分離得到2種純化多糖FVP-1和FVP-2，研究其對人胃癌BGC-823細胞和肺癌A549細胞的體外抗增殖作用，結(jié)果顯示兩者均能顯著抑制BGC-823細胞的增殖，且呈濃度依賴性。這種高抗增殖活性可能是由于多糖的結(jié)構(gòu)特征，以及生物系統(tǒng)對多糖的三重螺旋結(jié)構(gòu)的識別。多糖組分能顯著提高巨噬細胞的增殖和吞噬活性，并對癌細胞有抑制作用。FVP具有良好的抗腫瘤活性，具有開發(fā)抗癌藥品的潛力。但癌癥至今仍是尚未解決的致命疾病之一，世界公共衛(wèi)生仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

4.4 改善學習記憶能力

金針菇經(jīng)常被稱為“智力菇”。其記憶功能可能與腦組織中的乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。膽堿能系統(tǒng)涉及廣泛的大腦功能，影響突觸可塑性和認知能力。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶負責將細胞質(zhì)中的乙酰輔酶A和膽堿合成ACh，泡狀乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體將神經(jīng)遞質(zhì)攝取到突觸泡中。乙酰膽堿酯酶活性升高會使突觸間隙中的ACh含量下降，從而導致學習記憶能力下降。一項研究[32]采用Morris水迷宮法和大鼠腦生化分析方法，探究FVP對東莨菪堿誘導的學習記憶障礙的影響，結(jié)果表明FVP顯著降低隱藏平臺試驗大鼠的逃避潛伏期和總游泳距離，增加大鼠的過平臺次數(shù)。生化檢查顯示，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及ACh等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著提高。此外，F(xiàn)VP可激活與學習記憶相關(guān)的信號通路，提高connexin36和p-CaMKII的表達。研究結(jié)果表明FVP對學習記憶能力有一定促進作用，為使用FVP作為一種安全有效的藥物預(yù)防和治療阿爾茨海默病提供科學證據(jù)，但對于多糖改善學習記憶能力在信號通路調(diào)節(jié)機制的研究還不夠深入。

4.5 抗炎活性

炎癥是組織防御各種損傷因子的刺激所發(fā)生的基本病理過程，是一種自我保護機制。FVP具有潛在的抗炎活性，通過調(diào)節(jié)腸道微生物可以增加有益菌從而減少炎癥，其抗炎活性主要基于免疫調(diào)節(jié)作用[25]。Zhang等[33]以右旋糖酐硫酸鈉誘導大鼠結(jié)腸炎為試驗對象，F(xiàn)VP治療可調(diào)節(jié)結(jié)腸微生物菌群失調(diào)，促進盲腸短脂肪鏈水平的增加，導致TLR4/NF-kappa B信號通路下調(diào)，最終結(jié)腸中炎癥因子明顯降低，改善結(jié)腸炎。FVP具有作為功能性食品成分或預(yù)防結(jié)腸炎藥物的潛力。

4.6 保肝活性

FVP可以通過阻止丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的釋放以減少肝細胞的凋亡，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護肝細胞免受四氯化碳（CCl4）代謝物的損傷及破壞蛋白合成帶來的損傷。Zhang等[34]研究發(fā)現(xiàn)金針菇水溶性多糖可降低乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制表達，表現(xiàn)出顯著的乙肝表面抗體活性，起到保護肝臟受損的作用。此外，F(xiàn)VP還可以提高肝臟中SOD和GSH-Px活性，增強肝臟自由基的清除能力，從而減少對肝細胞的損害作用。由此可見FVP在保肝活性方面具有很大的發(fā)展前景，但研究仍處于比較基礎(chǔ)的層面，還需深入研究。

4.7 其他生物活性

FVP除具有上述生物活性外，還具有降血糖、降血脂、抗疲勞等生物活性。FVP具有促進機體胰島素分泌，改善胰島素敏感性和修復(fù)受損胰島細胞的作用[35]。Yeh等[36]研究表明添加3%的金針菇提取物對高脂飲食誘導的血清高密度脂蛋白膽固醇水平升高的倉鼠脂質(zhì)代謝有顯著影響。Su等[37]評價金針菇等4種食用菌多糖對小鼠的抗缺氧和抗疲勞作用。研究表明，F(xiàn)VP可提高負重游泳能力、缺氧生存時間、肝和肌糖原含量、紅細胞比容和血紅蛋白水平，降低血清尿素氮和血乳酸水平，調(diào)節(jié)機體的自我代謝和恢復(fù)能力，具有緩解運動疲勞、補充體力和促進恢復(fù)運動疲勞的作用。

5 結(jié)語與展望

近年來，食用菌多糖成為研究熱點。我國金針菇資源較為豐富，為FVP的研究提供得天獨厚的資源優(yōu)勢。傳統(tǒng)的多糖提取、分離純化方法及近些年發(fā)展起來的新興方法都各有優(yōu)缺點，因此有必要找到最適合金針菇的方法，從而使其發(fā)揮良好的生物活性。也可將2種或2種以上方法結(jié)合使用，旨在提高多糖提取率的同時降低成本。

多糖結(jié)構(gòu)的分析現(xiàn)在仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。由于不同提取純化技術(shù)分離的多糖結(jié)構(gòu)特征不同，其生物活性也有一定差異?？蒲泄ぷ髡呖梢赃M一步嘗試研究金針菇多糖的主體結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，還可以使用3D和其他新興技術(shù)來修飾多糖的結(jié)構(gòu)，從而增強生物活性。只有更準確地了解具體結(jié)構(gòu)，才能進一步探索多糖的分子結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系，并擴大其在醫(yī)藥、保健品和化妝品中的應(yīng)用。由于多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此研究活性多糖的結(jié)構(gòu)和功效對改善多糖的性能和未來藥物的開發(fā)具有重要意義。此外，有些金針菇多糖是以糖蛋白的形式發(fā)揮生物活性，需要深入研究。

未來的研究可能有幾點：（1）從金針菇菌絲體中提取多糖，比栽培金針菇子實體大幅縮短用時，提高生產(chǎn)效率，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。將菌絲體與子實體多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性進行對比分析，建立優(yōu)良的構(gòu)效關(guān)系。（2）許多試驗證明金針菇具有一定生物活性，但有些活性的作用機制尚未研究清晰，還需進一步研究。（3）深入研究金針菇多糖在膳食補充劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。這種資源的開發(fā)和利用將會促進工業(yè)和醫(yī)藥等許多領(lǐng)域的發(fā)展。