基于響應(yīng)面法的花豇豆酯酶提取工藝

馬月瓊，陳守慧，魏新林

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海食品安全工程技術(shù)研究中心（上海 200240）

聯(lián)合國(guó)預(yù)測(cè)，到2050年全球人口可達(dá)到92億。隨著人口密度的增加，食物的需求也在不斷地增加。因此，對(duì)于提高作物及農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，需要引起全世界的重點(diǎn)關(guān)注，糧食產(chǎn)量增加的前提是農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展。農(nóng)藥是保護(hù)農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量最重要的工具。在世界范圍內(nèi)，我國(guó)是最大的農(nóng)藥產(chǎn)地，其使用量位居首位，每年產(chǎn)量可達(dá)50多萬(wàn) t，農(nóng)藥的種類約1 100種[1]，全球每年使用的化學(xué)農(nóng)藥約300萬(wàn) t[2]。有研究表明，在全球范圍內(nèi)的農(nóng)作物種植過(guò)程中，若不使用農(nóng)藥，全球農(nóng)作物總產(chǎn)量損失的10%～40%是由病蟲(chóng)害造成的[3]。農(nóng)藥是一把雙刃劍：一方面，農(nóng)藥的使用具有防治病蟲(chóng)害、使農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)、增加農(nóng)民收入的好處；另一方面，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥殘留是使用農(nóng)藥后必不可少的一種現(xiàn)象，亦是不能忽視的重要問(wèn)題。農(nóng)藥是有毒、易殘留的化學(xué)物質(zhì)，大部分具有穩(wěn)定性較高、半衰期長(zhǎng)[4]的特點(diǎn)。國(guó)家及相關(guān)部門雖然對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行管控，但事實(shí)上執(zhí)行力度尚且不夠，對(duì)于農(nóng)藥的過(guò)分依賴或者不合理使用導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問(wèn)題極其嚴(yán)重，自然環(huán)境也會(huì)受到嚴(yán)重污染，與此同時(shí)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境均帶來(lái)極大的危害[5]。據(jù)報(bào)道，在每年各省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布的食品抽檢報(bào)告中，其不合格食品涉及的問(wèn)題主要包括農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)、食品添加劑超標(biāo)、微生物污染和重金屬超標(biāo)。其他國(guó)家也會(huì)因我國(guó)食品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題選擇拒絕進(jìn)口并召回含農(nóng)殘的食品。

酶抑制法根據(jù)酶源的不同可分為動(dòng)物酯酶抑制法和植物酯酶抑制法。動(dòng)物酯酶一般來(lái)源于動(dòng)物的腦組織和血液中[6-7]。而植物酯酶廣泛存在于各種作物中，包括小麥、玉米和不同豆類作物等。與動(dòng)物酯酶相比，植物酯酶具有來(lái)源豐富、取材方便、提取步驟簡(jiǎn)單快捷、成本低、易于保存等優(yōu)勢(shì)，因此自20世紀(jì)80年代以來(lái)，研究者開(kāi)始逐漸地用植物酯酶代替動(dòng)物酯酶。試驗(yàn)以總酯酶活力和比活力為考核指標(biāo)，對(duì)面粉、麥麩和13種植物種子中提取的植物酯酶進(jìn)行篩選，選取適宜的植物酶源，并采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)合的方法對(duì)植物酯酶的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為植物酯酶的有效提取和深入研究花豇豆酯酶用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供參考，為尋求新的植物酯酶源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面粉、小麥（普洱市思茅區(qū)魏曉蘭百貨店）；玉米、紅蕓豆、花豇豆、麥麩、黑小麥、小麥仁、生白芝麻、蕎麥、蠶豆、綠豆、青豌豆、大黑豆、扁豆（河南省虞城縣興藝商貿(mào)有限公司）；α-乙酸萘酯、α-萘酚、固藍(lán)B鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙酮（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛血清蛋白（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Dynamica高速冷凍離心機(jī)（上海馭锘實(shí)業(yè)有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；524G恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ST5000實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（常州奧豪斯儀器有限公司）；BSA3202S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 植物酯酶粗酶液的制備

將植物種子清洗干凈，曬干后粉碎3次后備用。準(zhǔn)確稱取一定量的樣品加入到250 mL錐形瓶中，按1∶5（g/mL）的料液比加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分振蕩1 h，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機(jī)中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速率離心10 min，收集上清液即為植物酯酶粗酶液，置于-4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[8]

配制濃度1 mmol/L的α-萘酚無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，取8支試管，用移液槍分別準(zhǔn)確吸取0，10，20，30，40，50，60和70 μL的α-萘酚無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，依次加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液至3 mL，混合均勻，分別加入0.5 mL固藍(lán)B鹽溶液，再次充分混合后放于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，取200 μL于96孔板中，在595 nm處測(cè)定吸光度（A595），以不加α-萘酚的溶液作空白，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。以α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），作圖可得最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率按式（1）計(jì)算。

式中：K為α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Ai為反應(yīng)液在595 nm處的吸光度（A）；Ci為α-萘酚溶液濃度；n為α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù)。

1.3.2.2 總酯酶活力的測(cè)定[9]

取10 mL試管，依次加入1.950 mL濃度0.04 mol/L、pH 6.4磷酸鹽緩沖溶液、50 μL濃度16 mmol/L的α-乙酸萘酯丙酮溶液和0.5 mL稀釋一定倍數(shù)后的酶液，充分振蕩使試管內(nèi)的溶液混合均勻，將試管放入30 ℃恒溫水浴鍋中，開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)15 min后取出試管，加入0.5 mL固藍(lán)B 鹽溶液于試管中，振蕩混勻后放入30 ℃恒溫水浴鍋中，開(kāi)始計(jì)時(shí)，10 min后取出試管，用移液槍吸取200 μL于96孔板中，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)其溶液的吸光度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。用磷酸鹽緩沖溶液作對(duì)照，根據(jù)式（2）計(jì)算總酯酶活力。

式中：E為每毫升酶液的總酯酶活力，U/mL；D為酶液的稀釋倍數(shù)；K為α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；A595為波長(zhǎng)在595 nm處的吸光度；V0為體系的終體積，mL；T表示反應(yīng)時(shí)間，min；V1為所用酶液的體積，mL；U為酶活力單位，1 U表示在一定條件下，每分鐘分解得到1 μmolα-萘酚所需要的酶量。

1.3.2.3 蛋白含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：選用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照Bradford[10]的考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。使用牛血清蛋白配制質(zhì)量濃度100 μg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，0，20，40，60和80 μg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可用100 μg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液直接稀釋即可，取6支試管，每支試管加入0.1 mL BSA溶液和1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250后，充分振蕩，在常溫條件下反應(yīng)3～5 min后，取200 μL于96孔板中，在595 nm處測(cè)定吸光度A595，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。以蒸餾水作空白。以BSA質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光度A595為縱坐標(biāo)（Y），作圖可得最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.3.2.4 比活力的測(cè)定

比活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]，比活力（U/mg）按式（3）計(jì)算。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 料液比對(duì)酶活力的影響

將植物種子粉碎后準(zhǔn)確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，以0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液作為提取液，分別以1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入磷酸鹽緩沖液對(duì)花豇豆酯酶進(jìn)行提取，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢? h，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機(jī)中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速率離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對(duì)總酯酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.2 提取液pH對(duì)酶活力的影響

配制濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0。將植物種子粉碎后準(zhǔn)確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）向錐形瓶中分別加入以上不同pH的磷酸鹽緩沖液對(duì)花豇豆酯酶進(jìn)行提取，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢? h，再經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將濾液倒入離心管，然后放于冷凍離心機(jī)中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速度離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對(duì)總酯酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 浸提時(shí)間對(duì)酶活力的影響

將植物種子粉碎后準(zhǔn)確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上分別攪拌0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0和18 h后，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機(jī)中，在4 ℃條件下以8 000 r/min的速度離心10 min，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對(duì)總酯酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.4 離心速率對(duì)酶活力的影響

將植物種子粉碎后準(zhǔn)確稱取10 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，在恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢? h，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將濾液倒入離心管，放于冷凍離心機(jī)中，在4 ℃條件下，離心速率設(shè)置為2 000，4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 r/min，離心10 min后，收集粗酶液，按照1.3.2.2的方法對(duì)總酯酶活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各參數(shù)對(duì)酯酶總活力的影響規(guī)律，并得到最佳提取條件。以料液比（A）、提取液pH（B）、浸提時(shí)間（C）和離心速率（D）為自變量，酶活力作為響應(yīng)值，其因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平及編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。使用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，采用Design-Expert 11進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-萘酚及蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

α-乙酸萘酯經(jīng)植物酯酶催化水解產(chǎn)生α-萘酚和乙酸，α-萘酚和顯色劑固藍(lán)B鹽發(fā)生反應(yīng)，生成紫紅色的偶氮化合物和鹽酸。如圖1所示，以α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制得到的α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，斜率為K，結(jié)合α-萘酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和總酯酶活力的計(jì)算公式就可以計(jì)算出相應(yīng)植物酯酶的總活力。α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.996 63，線性關(guān)系表現(xiàn)良好。

圖1 α-萘酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)植物酯酶的比活力計(jì)算公式，需測(cè)定總蛋白含量。試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，相關(guān)系數(shù)為0.997 55，具有良好的線性關(guān)系，符合試驗(yàn)使用。

圖2 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同植物酶源總酯酶活力和比活力的比較

試驗(yàn)選取的酶源材料有面粉、麥麩及13種植物種子，測(cè)定并比較其總酯酶活力和比活力，結(jié)果如圖3所示。通過(guò)方差分析，結(jié)果顯示植物酯酶廣泛存在于面粉、麥麩和其他13種植物種子中。由此可以看出花豇豆酯酶的總酯酶活力和比活力極顯著高于其他14種植物酯酶，花豇豆的總酯酶活力是面粉的21.718倍、蠶豆的30.644倍。其比活力是面粉的5.587倍、蠶豆的27.379倍。其中，玉米的總酯酶活力最小，蠶豆酯酶的比活力最小。綜合考慮，試驗(yàn)選擇花豇豆作為最佳植物酯酶酶源。

圖3 不同植物酶源

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 料液比對(duì)酶活力的影響

比較不同料液比對(duì)于花豇豆酯酶提取效果的影響，由圖4可知，隨著料液比從1∶4（g/mL）到1∶8（g/mL）的變化，即提取液用量不斷增加，相當(dāng)于對(duì)花豇豆酯酶的稀釋倍數(shù)不斷增大，總酯酶活力呈現(xiàn)先增大后持續(xù)降低再上升的變化趨勢(shì)，料液比1∶5（g/mL）時(shí)，總酯酶活力達(dá)到最大值，提取效果最佳。由此可以判斷，料液比太低時(shí)，花豇豆酯酶不能充分地溶解于提取液中，從而導(dǎo)致提取不完全，總酯酶活力會(huì)偏低，繼續(xù)增加提取液用量，花豇豆酯酶的總酶活力會(huì)隨之增大，料液比超過(guò)1∶5（g/mL）時(shí)，提取液用量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致酯酶量減少，并且料液比過(guò)大會(huì)產(chǎn)生試劑和能源的浪費(fèi)。因此，綜合考慮，最佳料液比為1∶5（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.2 提取液pH對(duì)酶活力的影響

對(duì)比pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)對(duì)花豇豆酯酶提取的效果。不同提取液pH對(duì)總活力的影響如圖5所示。隨著提取液pH增大，花豇豆酯酶的總活力先呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。pH 8.0時(shí)，總活力達(dá)到最大值。繼續(xù)提高pH，總酯酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在酸性或強(qiáng)堿性條件下，酶的構(gòu)象和穩(wěn)定性均會(huì)受到較大影響，易造成酶蛋白的變形或聚集等，從而使得酶的活性減弱。因此，提取液最佳pH為8.0。

圖5 提取液pH對(duì)花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.3 浸提時(shí)間對(duì)酶活力的影響

在0.5～18 h的浸提時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行花豇豆酯酶提取效果的比較。不同浸提時(shí)間對(duì)總活力的影響如圖6所示。提取時(shí)間小于2 h時(shí)，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，花豇豆的總酯酶活力也在不斷增大。超過(guò)2 h后，花豇豆的總酯酶活力先下降到達(dá)最低值后又開(kāi)始上升。但浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，再加后續(xù)酯酶的分離純化導(dǎo)致時(shí)間成本太高，因此，綜合考慮，選擇合適的浸提時(shí)間使得酯酶充分溶出即可，故選取2 h作為花豇豆酯酶的最佳浸提時(shí)間。

圖6 浸提時(shí)間對(duì)花豇豆酯酶總活力的影響

2.3.4 離心速率對(duì)酶活力的影響

在2 000～12 000 r/min的離心速率范圍內(nèi)進(jìn)行花豇豆酯酶提取效果的比較。不同離心速率對(duì)總活力的影響如圖7所示。離心速率在6 000～10 000 r/min的范圍內(nèi)，花豇豆酯酶的總酯酶活力具有極顯著的變化。轉(zhuǎn)速小于8 000 r/min時(shí)，提高轉(zhuǎn)速，酯酶總活力相應(yīng)地提高。轉(zhuǎn)速大于8 000 r/min時(shí)，提高轉(zhuǎn)速，酯酶總活力又出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取8 000 r/min作為花豇豆酯酶的最佳離心速率。

圖7 離心速率對(duì)花豇豆酯酶總活力的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗(yàn)的分析結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)方案根據(jù)表1的因子與水平設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 11軟件將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

得到花豇豆酯酶總活力對(duì)料液比（A）、提取液pH（B）、浸提時(shí)間（C）和離心速率（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程：酶活力=-10.09+0.369 7A+0.180 9B+0.254 1C+0.222 4D+0.105 1AB-0.228 7AC-0.071 2AD+0.269 7BC-0.071 2BD-0.143 9CD-1.74A2-1.27B2-2.88C2-0.823 4D2?；貧w模型方差分析見(jiàn)表3。

應(yīng)用方差分析對(duì)模型的顯著性進(jìn)行評(píng)價(jià)，響應(yīng)值酶活力的方差分析結(jié)果如表3所示。在模型的建立過(guò)程中，若出現(xiàn)影響不顯著的項(xiàng)會(huì)直接刪除，P值反映模型中每一項(xiàng)的顯著性，P＜0.01說(shuō)明影響極顯著，P＜0.05說(shuō)明影響顯著，P＞0.05說(shuō)明影響不顯著。該模型中的A、B、C、D、AC、BC、CD均為極顯著，說(shuō)明試驗(yàn)因素對(duì)酶活力不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，方程回歸顯著。

模型F=2 086.27，P＜0.000 1，表明建立的模型具有極高的有效性。方程失擬項(xiàng)（Lack of fit）F=3.64，P=0.112 2＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型沒(méi)有失擬現(xiàn)象，模型合適。由表3可知，花豇豆酯酶提取效果的顯著性大小順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即料液比＞浸提時(shí)間＞離心速率＞提取液pH。該模型的R2=0.999 5，Radj2=0.999 0，兩者非常接近，預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值高度相關(guān)，說(shuō)明該模型能夠解釋99.90%的響應(yīng)值變化，模型擬合的效果較好。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析及顯著性檢查

接表3

2.4.2 響應(yīng)面分析

等高線的形狀可以直觀地反映出兩因素交互作用對(duì)花豇豆酯酶活力影響的大小，圓形表明交互作用不顯著，橢圓形表明交互作用顯著。根據(jù)對(duì)所模型的分析結(jié)果可知，主要影響花豇豆酯酶酶活的因素是料液比（A）和浸提時(shí)間（C）。圖8顯示料液比和浸提時(shí)間對(duì)花豇豆酯酶酶活交互作用的結(jié)果，可以直觀看出兩者交互作用顯著。

圖8 料液比和浸提時(shí)間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)所得的結(jié)果和多項(xiàng)式回歸方程，可以得到花豇豆酯酶的最佳提取工藝條件：料液比1∶5.326（g/mL）、提取液pH 8.138、浸提時(shí)間2.434 h、離心速率7 648.768 r/min。該條件下酶活力的預(yù)測(cè)值為9.515 U/mL。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將提取工藝條件調(diào)整為料液比1∶5（g/mL）、提取液pH 8、浸提時(shí)間2 h、離心速率8 000 r/min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，酶活力的實(shí)際值為9.081 U/mL，非常接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明該模型可靠性較高，可以較好地預(yù)測(cè)花豇豆酯酶的實(shí)際酶活。

3 結(jié)論

根據(jù)對(duì)玉米、麥麩、生白芝麻、黑小麥、蠶豆、蕎麥、面粉、小麥、小麥仁、大黑豆、青豌豆、扁豆、紅蕓豆、綠豆和花豇豆中提取的植物酯酶的總酶活力和比活力的比較，得出花豇豆為最佳植物酶源。以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，用響應(yīng)面法對(duì)花豇豆酯酶的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立料液比、提取液pH、浸提時(shí)間和離心速率對(duì)酶活力二次回歸方程模型。經(jīng)驗(yàn)證，模型的可靠性較高，可較好地預(yù)測(cè)花豇豆酯酶的實(shí)際酶活。結(jié)合單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定植物酯酶最佳提取條件：料液比1∶5（g/mL）、提取液pH 8、浸提時(shí)間2 h、離心速率8 000 r/min。在此最佳提取條件下酶活力為9.081 U/mL，與預(yù)測(cè)值較為接近。