LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p調(diào)節(jié)Akt通路對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的機(jī)制研究*

李亮，李建忠，張丹杰，馬躍峰，李少民

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 胸外科，陜西 西安 710004）

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中85%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。肺癌的臨床治療以手術(shù)、放化療、靶向治療為主，這些方法雖然在一定程度上能延長(zhǎng)患者的生存期，但肺癌患者的預(yù)后仍然不容樂觀，文獻(xiàn)報(bào)道其5年總生存率僅為15%左右[2]，因此有必要對(duì)肺癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究并尋找新的靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA,LncRNA）近年來被發(fā)現(xiàn)參與多種惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA 在乳腺癌[3]、肝癌[4]、胰腺癌[5]、肺癌[6]等多種癌組織中高表達(dá)，LncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT-1）是肺癌的特異性標(biāo)志物，LncRNA MALAT1 高表達(dá)是肺癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素之一[7]。微小RNA（microRNA,miR）是一種廣泛存在于細(xì)胞中的非編碼RNA，miR 是LncRNA MALAT1 的靶基因之一，LncRNA MALAT1 可以通過與有靶向結(jié)合位點(diǎn)的miR 靶基因相結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄或翻譯水平，進(jìn)一步參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有相關(guān)研究[8]報(bào)道LncRNA 可以通過與下游miR 結(jié)合調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Akt 激酶信號(hào)通路途徑是影響肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的重要通路。目前關(guān)于LncRNA MALAT1 與miR-370-3p 在肺癌中是否存在相互作用尚不可知，本研究擬觀察LncRNA MALAT1是否可以通過靶向結(jié)合miR-370-3p 影響肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡，并檢測(cè)下游Akt 通路蛋白的表達(dá)變化，探究其是否對(duì)該通路存在影響作用，以期為肺癌的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人肺癌細(xì)胞A549 由上海細(xì)胞資源中心提供，DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermofisher 公司，熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司，LncRNA MALAT-1 siRNA（si-MALAT-1）及其陰性對(duì)照（si-MALAT-1-NC）、pcDNA-MALAT-1、miR-370-3p 模擬物（miR-370-3p mimic）和抑制劑（miR-370-3p inhibitor）及其陰性對(duì)照序列（miR-NC）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Alrdich 公司，轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，Akt 單克隆抗體、p-Akt 單克隆抗體、PI3K 單克隆抗體、p-PI3K 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，辣根過氧化物酶購(gòu)自北京中杉金橋公司，膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自常州恒隆儀器有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，BSC-1100IIA2-X 生物安全柜購(gòu)自濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549 培養(yǎng)于含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳恒溫箱中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度80%以上開始傳代實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并接種在24 板孔中。

1.2.2 分組①抑制LncRNA MALAT-1 或過表達(dá)miR-370-3p 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及Akt 通路的影響：隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組，不轉(zhuǎn)染）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-MALAT-1 NC）、si-MALAT-1 組（轉(zhuǎn)染si-MALAT-1）、mi-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-370-3p組（轉(zhuǎn)染miR-370-3p mimic）。 ②抑制LncRNA MALAT-1 并干擾miR-370-3p 對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及Akt 通路的影響：隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組，不轉(zhuǎn)染）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-MALAT-1 NC）、si-MALAT-1 組（轉(zhuǎn)染si-MALAT-1）、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組（同時(shí)轉(zhuǎn)染si-MALAT-1 和anti-miR-NC）、si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組（同時(shí)轉(zhuǎn)染si-MALAT-1 和anti-miR-370-3p）。所有轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照Lipofectmine 2000 說明書進(jìn)行，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h 后更換新的含有青霉素/鏈霉素的10%FBS DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，分別于24 h、48 h、72 h 進(jìn)行細(xì)胞收集。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)首先使用預(yù)測(cè)軟件TargetScan 和miRanda 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，檢查L(zhǎng)ncRNA MALAT-1 與miR-370-3p 是否存在結(jié)合位點(diǎn)，再分別構(gòu)建MALAT-1 野生型（MALAT-1WT_1uc）與突變型（MALAT-1MUT_1uc）熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。然后將培養(yǎng)的A549 細(xì)胞接種于24 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待完全貼壁后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將帶有MALAT-1WT_luc、MALAT-1MUT_luc 雙報(bào)告基因質(zhì)粒和miR-370-3p、miR-NC 轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)螢火蟲熒光素酶（Firefly）和海腎（Renilla）的熒光強(qiáng)度，以二者的比值（Firefly/Renilla）衡量相對(duì)活性，反映LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p 的結(jié)合情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)LncRNA MALAT-1、miR-370-3p 表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液1 000 r/min 離心5 min，取下層細(xì)胞沉淀，加入1 mL TRIzol 液吹打均勻后移入EP 管，室溫放置5 min，然后12 000 r/min 離心5 min，取上清液。測(cè)定純度時(shí)加入Buffer 溶解，計(jì)算A260/A280 比值，比值處于1.6～1.8，最后調(diào)整RNA 濃度至100 μg/mL。按照試劑盒說明書配制總反應(yīng)體系20 μL（2 μL 逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶、2 μL dNTPs、0.5 μL RNA 酶抑制劑、4 μL RT Buffer、9.5 μL ddH2O）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min、85℃ 酶失活反應(yīng)5 min，置入-20℃冰箱冷凍保存。再進(jìn)行qRT-PCR，按照試劑盒說明書配制總反應(yīng)體系20 μL（2 μL 正向引物、2 μL 反向引物、2 μL cDNA、10 μL PCR master mix、4 μL ddH2O），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，58℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲與遷移侵襲實(shí)驗(yàn)：采用含0.1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于含有基質(zhì)膠的Transwell 小室的上室中，在下室中加入500 μL 含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，棄去培養(yǎng)液，PBS 緩沖液沖洗3 遍，多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽擦去上層未遷移細(xì)胞，PBS 緩沖液沖洗3 遍，顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)：用不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸制備細(xì)胞懸液，將其重懸后接種于Transwell 小室的上室中，其他操作與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取各組細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化并制成細(xì)胞懸液，以每管1×106個(gè)細(xì)胞加入流式離心管，培養(yǎng)48 h 后，加入10 μL Annexin V-FITC，混勻后在冰上避光孵育30 min，再加入5μL PI，渦旋混勻，冰上孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 MMT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)期細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于96 孔板（每孔100 μL），培養(yǎng)48 h 后于每孔中加入20 μL 的MTT 溶液（5 mg/mL），室溫下孵育4 h，再加入150 μL 的DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀讀取490 nm 波長(zhǎng)處各孔的光密度度值（OD）。 細(xì)胞存活率=（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔）/（OD對(duì)照孔-OD空白孔）×100%。

1.2.8 Western blotting 法檢測(cè)Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量Tris 法提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配置10% SDS-PAGE 凝膠，取20 μL 樣品上樣，120 V 垂直電泳60 min，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，顯影后進(jìn)行曝光洗片，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件計(jì)算每個(gè)條帶的光密度值，以目的蛋白的灰度值/GAPDH 灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制LncRNA MALAT-1或過表達(dá)miR-370-3p各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較

qRT-PCR 結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control 組、si-NC 組及si-MALAT-1組的LncRNA MALAT-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與Control組和si-NC 組比較，si-MALAT-1 組的LncRNA MALAT-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降（P<0.05），見表1。細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p組的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組和miR-370-3p 組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05），與miR-NC 組比較，miR-370-3p組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見表2 和圖1～3。

圖1 各組A549細(xì)胞的遷移情況 （結(jié)晶紫染色×200）

表2 各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）

表2 各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）

注：①與Control組比較，P <0.05；②與si-NC組比較P <0.05；③與miR-NC組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組F 值P 值LncRNA MALAT-1 mRNA 1.00±0.02 0.98±0.03 0.42±0.06①②--9.206 0.021遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)156.39±5.41 150.67±6.52 64.36±4.73①②150.84±5.23 52.68±4.35①③22.015 0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)120.20±6.38 125.88±7.16 70.53±5.62①②130.99±6.81 60.77±5.06①③18.902 0.002細(xì)胞凋亡率/%4.08±0.33 4.03±0.17 12.92±0.21①②4.79±0.33 11.96±1.17①③12.569 0.009

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性的比較

MMT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p 組的細(xì)胞增殖活性比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性有差異（F=9.308，P=0.020）；②各組細(xì)胞增殖活性有差異（F=11.308，P=0.013）；③各組細(xì)胞增殖活性變化趨勢(shì)有差異（F=7.338，P=0.036）。見表3。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性的比較 （±s）

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與miR-NC組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組24 h 0.35±0.04 0.34±0.03 0.32±0.05 0.36±0.08 0.31±0.09①③48 h 0.67±0.07 0.64±0.07 0.44±0.06①②0.62±0.10 0.39±0.11①③72 h 1.33±0.16 1.29±0.15 0.75±0.11①②1.27±0.22 0.68±0.14①③

圖2 各組A549細(xì)胞的侵襲情況 （結(jié)晶紫染色×200）

圖3 各組A549細(xì)胞的凋亡情況

2.3 各組A549細(xì)胞的Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blotting 結(jié)果顯示，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p 組細(xì)胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組和miR-370-3p 組細(xì)胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05），與miR-NC 組比較，miR-370-3p 組細(xì)胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）。見表4 和圖4。

表4 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表4 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與miR-NC組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組F 值P 值p-Akt/Akt 1.16±0.04 1.08±0.06 0.46±0.09①②0.99±0.02 0.28±0.07①③6.569 0.008 p-PI3K/PI3K 0.97±0.06 0.93±0.18 0.33±0.05①②0.88±0.09 0.25±0.04①③7.235 0.003

圖4 各組A549細(xì)胞的Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 LncRNA MALAT-1對(duì)miR-370-3p的靶向調(diào)控作用

TargetScan 靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT-1與miR-370-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)（見圖5）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MALAT-1WT_1uc+Control組、MALAT-1WT_1uc+miR NC 組、MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p 組相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.00±0.12）、（0.98±0.11）、（0.35±0.09），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.521，P=0.008）；與MALAT-1WT_1uc+Control 組和MALAT-1WT_1uc+miR NC 組比較，LncRNA MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p 組的相對(duì)熒光強(qiáng)度降低（P<0.05）。MALAT-1MUT_1uc+Control 組、MALAT-1MUT_1uc+ miR NC 組、 MALAT-1MUT_1uc+miR-370-3p 組相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.02±0.14）、（0.93±0.10）、（0.96±0.13），經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.013，P=0.092）。

圖5 LncRNA MALAT-1與miR-370-3p的結(jié)合位點(diǎn)

進(jìn)一步qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的miR-370-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.332，P=0.006）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組的miR-370-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）；與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的miR-370-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）。見表5。

表5 各組miR-370-3p mRNA、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）

表5 各組miR-370-3p mRNA、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）

注：①與Control組比較，P <0.05；②與si-NC組比較，P<0.05；③與si-MALAT-1組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+anti-miR-NC組si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組F 值P 值miR-370-3p mRNA 1.00±0.03 1.01±0.01 4.84±0.09①②4.77±0.05①②2.29±0.04①②③12.332 0.006遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)95.22±7.63 93.79±7.55 30.60±3.02①②33.69±4.11①②60.35±3.62①②③22.891 0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)100.44±5.93 98.35±6.64 30.60±4.12①②24.39±5.04①②50.02±4.91①②③23.298 0.000細(xì)胞凋亡率/%2.63±0.16 3.04±0.28 9.27±0.68①②7.94±0.54①②3.87±0.25①②③7.231 0.036

2.5 抑制LncRNA MALAT-1并干擾miR-370-3p各組miR-370-3p 表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較

細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+antimiR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control組比較，si-MALAT-1 組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)增加（P<0.05），細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。見表5 和圖6～8。

圖6 各組A549細(xì)胞的遷移情況 （結(jié)晶紫染色×200）

圖7 各組A549細(xì)胞的侵襲情況 （結(jié)晶紫染色×200）

圖8 各組A549細(xì)胞的凋亡情況

2.6 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性的比較

培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的細(xì)胞增殖活性比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性有差異（F=8.137，P=0.027）；②各組細(xì)胞增殖活性有差異（F=13.108，P=0.005）；③各組細(xì)胞增殖活性變化趨勢(shì)有差異（F=9.086，P=0.022）。見表6。

表6 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較 （±s）

表6 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較，P <0.05；③與si-MALAT-1組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+antimiR-NC組si-MALAT-1+antimiR-370-3p組24 h 0.37±0.03 0.33±0.06 0.34±0.08 0.36±0.08 0.35±0.10 48 h 0.85±0.09 0.81±0.08 0.48±0.07①②0.52±0.11①②0.70±0.14①②③72 h 1.56±0.22 1.61±0.27 0.83±0.16①②0.80±0.20①②1.15±0.17①②③

2.7 各組A549細(xì)胞的Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

Western blotting 結(jié)果顯示，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）。與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+antimiR-370-3p 組的細(xì)胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。見表7 和圖9。

表7 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表7 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+anti-miR-NC組si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組F 值P 值p-Akt/Akt 0.93±0.10 1.02±0.08 0.23±0.06①②0.26±0.04①②0.48±0.09①②③8.299 0.008 p-PI3K/PI3K 0.71±0.11 0.64±0.13 0.21±0.07①②0.23±0.09①②0.38±0.11①②③9.236 0.006

圖9 各組A549細(xì)胞的Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

LncRNA 是一種非編碼RNA，其長(zhǎng)度大約為200 個(gè)核苷酸，研究[9]發(fā)現(xiàn)LncRNA 不僅參與人類的生長(zhǎng)發(fā)育，還與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肺癌是一種極其復(fù)雜的疾病，癌變過程涉及多種基因和蛋白的表達(dá)變化，這種變化不僅可以影響癌細(xì)胞的增殖和凋亡，還能影響其侵襲和遷移。越來越多的體外研究和臨床研究均發(fā)現(xiàn)LncRNA 可以通過多通路、多水平、多機(jī)制、多聯(lián)合等多種途徑干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及耐藥性[10-12]。LncRNA-MALAT1 是一種廣泛表達(dá)于真核生物的LncRNA，研究發(fā)現(xiàn)LncRNAMALAT1 在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中呈高表達(dá)，被認(rèn)為是一種促癌基因。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是世界上發(fā)病率和病死率最高的最常見惡性腫瘤之一。張進(jìn)儒等[13]經(jīng)過臨床研究發(fā)現(xiàn)LncRNAMALAT1 不僅與肺癌密切相關(guān)，其高表達(dá)還是NSCLC 不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。MA 等[14]經(jīng)過體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)A549 細(xì)胞可以高表達(dá)LncRNAMALAT1，以上研究都提示LncRNA-MALAT1 與肺癌密切相關(guān)。miR 是一種單鏈非編碼RNA，現(xiàn)已有不少證據(jù)[15-16]表明LncRNA 可以通過靶向結(jié)合位點(diǎn)與多種miR 基因靶向結(jié)合，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制降低miR 的表達(dá)，以此來調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。但關(guān)于LncRNA-MALAT1 與miR-370-3p 之間是否存在靶向作用還不清楚。

WANG 等[17]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-370-3p參與了NSCLC 的進(jìn)展，為了探究LncRNA-MALAT1、miR-370-3p 與肺癌之間的相互關(guān)系，本研究選取A549 NSCLC 細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制LncRNA MALAT-1 或過表達(dá)miR-370-3p 都能抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)增加癌細(xì)胞的凋亡，提示LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p 都能影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，這為肺癌的臨床研究提供了新的靶點(diǎn)。但是關(guān)于LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p之間的相互關(guān)系及具體的作用機(jī)制尚不清楚。通過靶基因預(yù)測(cè)筆者發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT-1 與miR-370-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)，為了探究LncRNA MALAT-1是否對(duì)miR-370-3p 存在靶向調(diào)控作用，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型LncRNA MALAT-1+miR-370-3p的熒光強(qiáng)度顯著低于突變型，提示LncRNA MALAT-1 對(duì)miR-370-3p 有靶向負(fù)調(diào)控作用，RT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制MALAT-1 后miR-370-3p 表達(dá)顯著升高，pc-DNA-MALAT-1 組miR-370-3p 表達(dá)顯著下降，這進(jìn)一步證實(shí)了LncRNA MALAT-1 對(duì)miR-370-3p 具有負(fù)調(diào)控作用。與單純抑制LncRNA MALAT-1 相比，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 在培養(yǎng)48 h 和72 h 時(shí)A549 細(xì)胞的增殖以及遷移和侵襲顯著升高但仍顯著低于si-NC 組，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的細(xì)胞凋亡率則顯著下降但仍然顯著高于si-NC 組，這更加印證了MALAT-1和miR-370-3p之間的負(fù)向關(guān)系。

PI3K/Akt 信號(hào)途徑（又稱為Akt 通路）是一條與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的絡(luò)氨酸激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，多項(xiàng)研究[18-19]證實(shí)該途徑參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。本研究中，抑制LncRNA MALAT-1或過表達(dá)miR-370-3p 時(shí)p-Akt 和p-PI3K 表達(dá)均顯著下降，但Akt 和PI3K 無顯著變化，同時(shí)抑制LncRNA MALAT-1 和干擾miR-370-3p 時(shí)，p-Akt 和p-PI3K 表達(dá)均有所上升但仍顯著低于單純抑制LncRNA MALAT-1。 說明單純沉默 LncRNA MALAT-1 或提高miR-370-3p 的表達(dá)都能抑制Akt和PI3K 的磷酸化，而沉默LncRNA MALAT-1 并干擾miR-370-3p，對(duì)Akt 和PI3K 磷酸化的抑制作用被減弱。PI3K/Akt 信號(hào)通路的磷酸化能促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，WU 等[20]發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)LncRNA WT1-AS 來調(diào)控其靶向基因miR-494-3p，并最終抑制PI3K/Akt 通路的激活，起到抑制A549 和NCIH1975 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用。磷酸化的PI3K/Akt 可以下調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)以及抗凋亡蛋白Bcl-2 的降解，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，還可以通過激活酶激酶-3β 來加重癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，LncRNA MALAT-1 可以與miR-370-3p 靶向結(jié)合且對(duì)miR-370-3p 的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。抑制LncRNA MALAT-1 可以上調(diào)miR-370-3p 的表達(dá)，抑制549細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，并下調(diào)Akt通路蛋白的磷酸化。