延胡索HPLC指紋圖譜評(píng)價(jià)及含量測(cè)定研究

李強(qiáng)，程艷芹，崔曉博，劉楊，劉旭

(中國(guó)人民解放軍海軍九七一醫(yī)院，山東 青島 266071)

延胡索(Corydalisyanhusuo)，又稱延胡、元胡、元胡索，是罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)干燥塊莖。延胡索性質(zhì)溫和，味辛且苦，歸肝及脾經(jīng)，具有活血、行氣、止痛的功效[1-2]。近代醫(yī)藥學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，延胡索中包含60余種生物堿和20余種非生物堿類化合物，成分非常復(fù)雜，其中的生物堿是其主要的活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗?jié)?、抗菌抗病毒等藥理作用[3-4]，是現(xiàn)代中藥制劑的常用藥材，在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該藥材原產(chǎn)于浙江，近年來(lái)在河南、江蘇等地大量種植，也有多種同屬植物的塊莖在部分地區(qū)作元胡藥用，種類繁雜。文獻(xiàn)資料中延胡索藥材的相關(guān)研究多以標(biāo)志性成分延胡索乙素單一指標(biāo)為考察對(duì)象，不足以全面地反映藥材的質(zhì)量[5-6]。因此，建立有效的延胡索藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，確保延胡索藥材質(zhì)量穩(wěn)定，直接關(guān)系到延胡索相關(guān)藥品和臨床處方的療效。本試驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法建立延胡索的指紋圖譜，同時(shí)對(duì)原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、延胡索乙素6種生物堿含量進(jìn)行研究分析，為進(jìn)一步考察6種不同產(chǎn)地延胡索藥材的質(zhì)量狀況提供了更為全面的圖譜信息，為延胡索藥材整體的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的借鑒和參考。

1 材料和設(shè)備

1.1 藥品和試劑 乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200731)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200924)；磷酸(分析純，萊陽(yáng)市康德化工有限公司，批號(hào)：2019081)；三乙胺(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200827)；濃氨水(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20190920)；滅菌注射用水(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2019062002)；延胡索甲素(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z25N8B49010)；延胡索乙素(成都化夏化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：P550201)；鹽酸巴馬汀(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SP8050)；原阿片堿(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y12J10L90499)；脫氫紫堇堿(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W13M8Z31183)；鹽酸小檗堿(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)：SP8140)；延胡索藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 延胡索藥材來(lái)源

1.2 儀器和設(shè)備 液相色譜儀LC-2030型(日本島津制作所)；超聲波儀SY2200-SB2200型(上海必能信超聲有限公司)；電子天平Y(jié)P202N型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子天平DV215CD型(美國(guó)奧豪斯公司)；循環(huán)水真空泵SHZ-DⅢ型(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；電熱恒溫水箱HH-W21-420型(余姚市亞星儀器儀表有限公司)；酸度計(jì)PHS-3E型(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；紅外線干燥箱70-1型(龍口市電爐制造廠)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)(三乙胺調(diào)pH值至 6.1)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃[4]，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫流動(dòng)相變化時(shí)間程序

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取已粉碎的藥材粉末1 g于圓底燒瓶中，精密加入濃氨-甲醇(1∶20)50 mL，稱重，冷浸1 h，超聲40 min，取出靜置冷卻，再次稱重，并用濃氨-甲醇(1∶20)補(bǔ)充損失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL于坩堝中，在水浴鍋中蒸干，取得的殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，充分搖勻，微孔濾膜濾過(guò)即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取6種生物堿對(duì)照品適量，加甲醇超聲(功率：500 W，頻率：59 kHz，下同)溶解，制成每1 mL含原阿片堿17.75 μg、鹽酸巴馬汀19.65 μg、鹽酸小檗堿10.10 μg、脫氫紫堇堿61.70 μg、延胡索乙素58.00 μg、延胡索甲素46.45 μg的混合對(duì)照品溶液，密封后放入冰箱內(nèi)冷凍保存，備用。

2.4 單個(gè)生物堿對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素對(duì)照品藥物適量分別于不同的10 mL容量瓶中，分別加適量甲醇搖勻，超聲溶解，用甲醇分別定容，制得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素質(zhì)量濃度分別為0.104 2、0.096 6、0.101 6、0.100 2、0.101 0、0.110 8 mg·mL-1的單個(gè)對(duì)照品溶液，密封后放入冰箱內(nèi)冷藏保存，備用。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，所得RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，在0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，所得RSD值均小于2%，表明延胡索供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同批次的延胡索樣品6份，分別配置供試品溶液后按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，比較脫氫紫堇堿的色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，所得RSD值均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 指紋圖譜的生成 取6批不同產(chǎn)地的延胡索樣品按照“2.2.2”項(xiàng)下制成的供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。取6種生物堿制成的混合對(duì)照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。取各生物堿對(duì)照品6種分別配置單個(gè)生物堿對(duì)照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。對(duì)比指紋圖譜除溶劑峰外共確定有12個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)進(jìn)樣剖析單個(gè)生物堿對(duì)照品后獲得的色譜圖，如圖1～3，確定其中6個(gè)色譜峰，按序號(hào)1、2、3、4、7、9分別為原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素。以脫氫紫堇堿為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表3～4。

圖1 6批不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜

1.原阿片堿；2.鹽酸巴馬??；3.鹽酸小檗堿；4.脫氫紫堇堿；7.延胡索乙素；9.延胡索甲素

表3 6批延胡索藥材樣品中共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 6批延胡索藥材樣品中共有峰相對(duì)峰面積

2.5.5 指紋圖譜相似度分析 對(duì)6批不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜利用“中國(guó)色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行相似度分析，結(jié)果6批藥材(S1～S6)與對(duì)照?qǐng)D譜(SR)相似度分別為0.976、0.922、0.953、0.981、0.943、0.992。提示6種不同產(chǎn)地的延胡索藥品指紋圖譜差異較小。

2.6 延胡索中6種生物堿的含量測(cè)定

2.6.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取延胡索供試品和混合對(duì)照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖。分析結(jié)果表明，6種生物堿的分離度均大于1.5。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取相同的延胡索混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15、20、25、30、35 μL進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖，測(cè)出6種生物堿的峰面積，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量作自變量X，以生物堿相應(yīng)峰面積作因變量Y做線性回歸，結(jié)果顯示，6種生物堿均具有良好的線性關(guān)系。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取相同的延胡索混合對(duì)照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析6次并記錄所得色譜圖，測(cè)出6種生物堿的峰面積RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

A.原阿片堿；B.鹽酸巴馬汀；C.鹽酸小檗堿；D.脫氫紫堇堿；E.延胡索乙素；F.延胡索甲素

表5 6種生物堿線性關(guān)系考察表

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同的延胡索供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件，在0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，測(cè)出6種生物堿的峰面積所得RSD值均小于2%，表明延胡索供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同批次的延胡索樣品6份，分別配置供試品溶液后按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，測(cè)出6種生物堿的峰面積所得RSD值均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批延胡索樣品(批號(hào)：20200511)6份各0.5 g，置于平底燒瓶中，精密加入6種生物堿對(duì)照品適量，分析測(cè)定。結(jié)果顯示，原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素的平均加樣回收率分別為：101.6%、99.9%、100.5%、99.0%、100.2%、102.2%，其RSD分別為：1.6%、1.3%、0.6%、1.5%、2.3%、1.7%(見(jiàn)表6)。

表6 延胡索6種組分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.7 樣品測(cè)定 取延胡索樣品制成的供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄75 min色譜圖并計(jì)算出樣品中各6種生物堿含量見(jiàn)表7(為6批不同產(chǎn)地藥材各生物堿的平均含量)。

表7 延胡索各組分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1,n=6)

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品溶液制備條件的篩選 采用單因素法，以原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素6種生物堿色譜峰為考察指標(biāo)，對(duì)超聲和加熱回流提取30 min兩種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲提取所得的生物堿含量較高，因此選用超聲提取方式對(duì)藥材進(jìn)行制備；此外，又分別選擇甲醇、70%甲醇、濃氨-甲醇(1∶20)對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明濃氨-甲醇(1∶20)所得的生物堿含量較高，因此選用濃氨-甲醇(1∶20)作為溶劑進(jìn)行提??；采用濃氨-甲醇(1∶20)作提取溶劑分別超聲提取20、40、60 min，結(jié)果表明超聲提取40 min和60 min生物堿含量較超聲提取20 min高，且二者之間無(wú)明顯差別，因此選用超聲40 min作為供試品提取制備方式。

3.2 色譜條件的選擇 通過(guò)對(duì)比流動(dòng)相[甲醇A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-水B(每100 mL水中含有1 mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液)]、流動(dòng)相pH(6.0、6.1、6.2)、檢測(cè)波長(zhǎng)(230、250、280 nm)及柱溫(25、30、35 ℃)等色譜條件，經(jīng)過(guò)圖譜分析后篩選出流動(dòng)相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B(三乙胺調(diào)pH值至 6.1),檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：30 ℃為最優(yōu)檢測(cè)條件，所得色譜峰分離度良好，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

3.3 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證及相似度分析 本試驗(yàn)建立了延胡索藥材HPLC指紋圖譜，并考察比較了6批不同產(chǎn)地延胡索藥材的指紋圖譜相似度。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該HPLC方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定準(zhǔn)確，特征突出，可行性好。

本試驗(yàn)所采用的延胡索為我國(guó)南方地區(qū)的延胡索生品，試驗(yàn)結(jié)果顯示，指紋圖譜共成功匹配12個(gè)共有峰，共有峰基本特征均一致，為延胡索藥材的鑒別及生物堿成分的含量測(cè)定提供了相對(duì)全面的參考信息，對(duì)延胡索藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定具有一定的借鑒意義[5]。圖譜比較后發(fā)現(xiàn)，6批不同產(chǎn)地的延胡索藥材指紋圖譜相似度較高，提示這幾個(gè)地區(qū)延胡索藥材質(zhì)量差異不大。這可能與延胡索藥材產(chǎn)地空間距離較近，產(chǎn)地之間土壤、光照、氣候等地理因素差異較小，藥材采集時(shí)間，采集方式和儲(chǔ)存條件相對(duì)一致等因素密切相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步分析研究。