甲酸微生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

趙同心，趙磊，2，張延平，李寅

（1 中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

二氧化碳（CO2）中的碳是正四價(jià)，為最高氧化價(jià)態(tài)，分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。CO2的生物固定主要是利用合適的能量和還原力將CO2的碳氧雙鍵打開，使之加成到其他底物上實(shí)現(xiàn)四價(jià)碳的還原和碳鏈延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物。自然界中的生物固碳過(guò)程主要由包含固碳酶的多酶催化體系協(xié)調(diào)完成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6條天然的固碳途徑，其中包含9種固碳酶[1]。天然固碳途徑固碳效率普遍較低，用于生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品存在諸多問(wèn)題。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，效率更高的人工生物固碳途徑也被開發(fā)出來(lái)，如CETCH 循環(huán)[2]、人工合成淀粉的ASAP 途徑[3]、最簡(jiǎn)酶促碳固定循環(huán)POAP循環(huán)[4]等。

CO2接受電子，依次能夠還原為甲酸、甲醛、甲醇等一碳化合物。這些一碳化合物同化路徑的研發(fā)，也為CO2的生物利用提供更多的可能，如利用體外多酶途徑將甲醇轉(zhuǎn)化為淀粉[3]。隨著電催化技術(shù)的發(fā)展，CO2生產(chǎn)甲酸技術(shù)日益成熟。甲酸的碳原子活化度更高、在水中溶解度更大，因此近年來(lái)甲酸生物轉(zhuǎn)化成為了生物固碳研究的熱點(diǎn)方向，在甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑、甲酸途徑能量驅(qū)動(dòng)方面取得了較多研究進(jìn)展，有研究者已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌利用甲酸自養(yǎng)生長(zhǎng)。本文從以上幾個(gè)方面總結(jié)該研究方向的最新研究進(jìn)展，分析現(xiàn)有甲酸生物轉(zhuǎn)化的現(xiàn)狀、存在問(wèn)題，并討論了甲酸生物轉(zhuǎn)化未來(lái)努力的方向。

1 甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑

本文作者前期對(duì)6條天然固碳途徑的熱力學(xué)性質(zhì)、固碳酶特性等進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)分析和比較[5]。在6條固碳途徑中，每摩爾碳原子被還原降低一個(gè)化合價(jià)所需的NAD(P)H 均為0.5mol，而所需ATP 的量為0.125～0.7mol，其中最節(jié)能的是Wood?Ljungdahl（WL）途徑。該途徑除可以轉(zhuǎn)化CO2和CO 外，還可以轉(zhuǎn)化甲酸。其中，CO2和CO 生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶為甲酸脫氫酶和一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A（CODH/ACS）合酶，后者蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)氧非常敏感。因此，該途徑僅在厭氧菌丙酮丁酸梭菌（Clostridium acetobutylicum）中實(shí)現(xiàn)了異源重構(gòu)，通過(guò)13C 標(biāo)記分析可以檢測(cè)到微量13C?乙酰輔酶A的生成[6]。WL 途徑能將甲酸轉(zhuǎn)化為一碳供體——亞甲基四氫葉酸，隨后一碳供體能夠通過(guò)宿主菌本身的代謝網(wǎng)絡(luò)或者重構(gòu)的代謝途徑進(jìn)入中心代謝，從而為生物體利用甲酸提供更多可能?；赪L途徑中的甲酸轉(zhuǎn)化模塊具有較高普適性的特點(diǎn)，研究人員先后已嘗試在大腸桿菌、酵母等常用底盤細(xì)胞中將其進(jìn)行途徑重構(gòu)。

為了便于理解，本文將甲酸生物途徑分為上游甲酸同化模塊（甲酸→亞甲基四氫葉酸）和下游亞甲基四氫葉酸代謝途徑（亞甲基四氫葉酸進(jìn)一步生物代謝）兩部分進(jìn)行介紹。

1.1 上游甲酸同化模塊

如圖1所示，甲酸生成亞甲基四氫葉酸的過(guò)程是目前甲酸生物利用體系共有的模塊。該模塊包含的三步反應(yīng)依次被甲酸四氫葉酸連接酶、甲酰四氫葉酸水合酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶催化。甲基扭桿 菌（Methylobacterium extorquensAM1） 和 梭 菌（Clostridium ljungdahlii）中，這三個(gè)酶分別有三個(gè)基因編碼[7?8]；而在其他菌株中后兩個(gè)酶大多由同一基因編碼，如大腸桿菌中存在由folD基因編碼的雙功能蛋白酶，該蛋白催化的是可逆反應(yīng)，生理狀態(tài)下，催化亞甲基四氫葉酸生成甲酰四氫葉酸方向。在大腸桿菌中，為了實(shí)現(xiàn)甲酸生成亞甲基四氫葉酸，研究者嘗試引入了fhs/ftl、fchA、folD/mtdA三基因編碼的途徑[9?11]和fhs/ftl、folD兩基因編碼的途徑[12]，結(jié)果表明三基因編碼的途徑能較快提供亞甲基四氫葉酸。

1.2 下游亞甲基四氫葉酸代謝途徑

目前，利用內(nèi)源或者重構(gòu)的亞甲基四氫葉酸下游代謝途徑主要有三條（圖1中用不同顏色標(biāo)示）：一條是線性途徑（圖1 中藍(lán)色途徑）[9?11]，另外兩條是循環(huán)途徑（圖1中紅色和黃色途徑）[12?13]。

圖1 甲酸同化途徑

上游甲酸同化模塊內(nèi)中間產(chǎn)物不穩(wěn)定或缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，很難通過(guò)測(cè)定酶活性的方式篩選相關(guān)酶，因此研究人員多采用生長(zhǎng)缺陷菌株依賴的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)的方式進(jìn)行表征。研究人員首先構(gòu)建甘氨酸或絲氨酸生長(zhǎng)缺陷菌株，然后導(dǎo)入“甲酸→亞甲基四氫葉酸→甘氨酸/絲氨酸”途徑相關(guān)基因，通過(guò)生長(zhǎng)回補(bǔ)的方式來(lái)評(píng)價(jià)甲酸同化進(jìn)而生成甘氨酸、絲氨酸的能力[9?10]。

下游亞甲基四氫葉酸代謝途徑中，“甲酸→亞甲基四氫葉酸→甘氨酸/絲氨酸→丙酮酸”途徑已逐步在大腸桿菌構(gòu)建成功[9?11]。最初，研究人員在大腸桿菌中引入上游甲酸同化模塊后，利用菌株自身的甘氨酸切割系統(tǒng)，并不能使甘氨酸生長(zhǎng)缺陷的菌株恢復(fù)生長(zhǎng)；通過(guò)過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身的甘氨酸切割系統(tǒng)的基因gcvTHP，在10%CO2情況下，甘氨酸缺陷型菌株的生長(zhǎng)得以回補(bǔ)；繼而以葡萄糖和13C 標(biāo)記CO2及甲酸鈉為碳源，證實(shí)13C 標(biāo)記CO2及甲酸鈉能通過(guò)甲酸同化途徑合成甘氨酸以滿足生長(zhǎng)需求[10?11]。利用大腸桿菌體內(nèi)glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和絲氨酸脫氨酶，可以依次催化甘氨酸和亞甲基四氫葉酸生成絲氨酸，并進(jìn)一步生成丙酮酸。通過(guò)上述改造，在葡萄糖、甲酸和CO2共培養(yǎng)條件下，甲酸線性途徑可以貢獻(xiàn)丙酮酸合成代謝流的10%左右[9?10]。

在循環(huán)途徑中，甲基扭脫桿菌中天然存在“亞甲基四氫葉酸→絲氨酸”循環(huán)，但該菌株生長(zhǎng)較慢[14]。為了克服其菌株缺點(diǎn)，Liao 課題組[13]結(jié)合大腸桿菌的內(nèi)源代謝途徑，構(gòu)建了改良版絲氨酸循環(huán)途徑：用“絲氨酸→丙酮酸”途徑替代原來(lái)的“絲氨酸→2?P?glycerate”途徑，解決羥基丙酮酸還原酶底物非特異性問(wèn)題，乙醛酸和丙氨酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)替代絲氨酸供給氨基反應(yīng)，補(bǔ)給充足氨基供體，保證乙醛酸生成甘氨酸反應(yīng)順利進(jìn)行。研究人員通過(guò)“甘氨酸→草酰乙酸”“絲氨酸→丙酮酸”兩個(gè)模塊疊加的方式，在大腸桿菌中證實(shí)了改良的絲氨酸循環(huán)能夠工作。

Bar?Even 課題組[12]則探索了“亞甲基四氫葉酸→絲氨酸/蘇氨酸”循環(huán)途徑，通過(guò)生長(zhǎng)缺陷型菌株和13C 標(biāo)記的方式，在大腸桿菌內(nèi)證實(shí)該途徑能夠工作。上述兩種循環(huán)途徑轉(zhuǎn)化甲酸的代謝流情況，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 甲酸再生NAD(P)H 和甲酸自養(yǎng)菌株構(gòu)建

由于CO2及甲酸中的碳處于較氧化狀態(tài)，其固定轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)或丙酮酸等化合物均需要凈輸入還原力NAD(P)H及能量ATP。目前用于生物固碳的還原力及能量供給研究主要集中在光能、電能或化學(xué)能利用。天然自養(yǎng)微生物利用光能驅(qū)動(dòng)的較多，為了提高天然生物光系統(tǒng)的光捕獲能力，研究人員縮短藍(lán)藻吸光天線的尺寸，可將太陽(yáng)光吸收效率提高57%[15]。光能轉(zhuǎn)化為生物能是一個(gè)有前景的能量供給方式，吸收光能的光敏材料也引起人們的關(guān)注。研究者[16]創(chuàng)建熱醋穆?tīng)柺暇?硫化鎘（M. thermoacetica?CdS）雜合體系，利用CdS 將光子轉(zhuǎn)化為電子，提供給含有WL途徑的熱醋穆?tīng)柺暇?，利用該電子?qū)動(dòng)固碳途徑生成乙酸。江南大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用自組裝CdS 納米捕光系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)光驅(qū)動(dòng)大腸桿菌封存CO2生產(chǎn)有機(jī)酸[17]。電子除來(lái)自光能之外，也可以直接來(lái)自電極，該想法已得到初步證實(shí)。乙酸梭菌能夠利用從電極上得到的電子，將CO2還原成乙酸和甲烷[18]。目前利用光能和電能提供能量的方式主要集中在天然固碳的宿主菌，在模式生物中提供電子，用于生物固碳還需要很多努力。

在微生物體系中，甲酸是一種常見(jiàn)的電子供體，可以利用甲酸脫氫酶將其分解為CO2和水，同時(shí)再生NADH 或者NADPH，從而為生物體提供還原力。目前，已發(fā)現(xiàn)來(lái)自假絲酵母的甲酸脫氫酶具有較強(qiáng)的NADH 再生活性，因此該甲酸/甲酸脫氫酶的NADH再生系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究[19]和工業(yè)生產(chǎn)[20]。研究者將來(lái)自假絲酵母的甲酸脫氫酶進(jìn)行突變，還得到了可再生NADPH 的突變體[21]。另外，自然界中也存在再生NADPH的甲酸脫氫酶，例如Burkholderia stabilis15516來(lái)源的甲酸脫氫酶[22]。

目前，已有很多研究將甲酸/甲酸脫氫酶NAD(P)H再生系統(tǒng)用于生物固碳。一種情況是甲酸只作為電子供體，比如真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Ralstonia eutrophaH16），其能夠利用甲酸脫氫酶這一功能將甲酸轉(zhuǎn)化為還原力，驅(qū)動(dòng)內(nèi)生的固碳途徑——卡爾文循環(huán)[23]。這一思路也被用于大腸桿菌或酵母菌株的改造，在導(dǎo)入固碳途徑卡爾文循環(huán)（CBB循環(huán)）的大腸桿菌[24]和酵母菌[25]，利用甲酸/甲酸脫氫酶提供還原力NADH，在有氧的情況下，NADH經(jīng)氧化磷酸化生成ATP，從而實(shí)現(xiàn)甲酸提供固碳途徑所需要的還原力和ATP。

另一種情況是甲酸既作為電子供體又作為代謝的碳源。隨著甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑深入研究，研究人員將甲酸再生NAD(P)H 模塊和甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑相結(jié)合，嘗試構(gòu)建甲酸自養(yǎng)型的工程菌株。近期，Liao 課題組[9]將甲酸脫氫酶引入到含有甲酸線性轉(zhuǎn)化途徑的大腸桿菌中，當(dāng)葡萄糖耗盡后，通過(guò)補(bǔ)加甲酸實(shí)現(xiàn)維持菌株的OD值的穩(wěn)定。隨后，該課題組通過(guò)加強(qiáng)固碳模塊并強(qiáng)化NADH氧化磷酸化生成ATP的效率，以甲酸和CO2為碳源，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)工程菌株450h，最終獲得OD值可由1.02提高到7.38 的菌株[26]。類似地，Bar?Even 課題組[27]將甲酸線性轉(zhuǎn)化途徑和甲酸脫氫酶引入大腸桿菌，得到了生長(zhǎng)代時(shí)為70h的工程菌株，并通過(guò)進(jìn)化工程提高了菌株以甲酸和CO2為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的性能，將代時(shí)縮短到7.7h。

3 問(wèn)題與討論

甲酸作為生物可利用的碳源和能源，是一種極具潛力的一碳化合物資源。目前甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑方面，主要以甲酸生成亞甲基四氫葉酸的共有途徑為主要切入口，通過(guò)線性或循環(huán)途徑進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成Cn（n≥2）化合物。目前雖然用生長(zhǎng)缺陷型菌株和13C 標(biāo)記的方式驗(yàn)證甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑已打通(表1)，但其代謝通量還很低，處于“概念驗(yàn)證”階段，其技術(shù)指標(biāo)遠(yuǎn)未達(dá)到規(guī)模化生物制造的需求。

表1 關(guān)于甲酸生物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分子改造研究進(jìn)展

為了提高甲酸生物轉(zhuǎn)化合成化學(xué)品效率，必須加強(qiáng)在該領(lǐng)域的研究部署。一方面需對(duì)現(xiàn)有甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究，找出并突破限速步驟。目前的研究主要依賴營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株偶聯(lián)生長(zhǎng)或者13C 標(biāo)記的形式來(lái)進(jìn)行路徑表征，很少能夠測(cè)定具體酶活，這就不能確定一個(gè)代謝模塊內(nèi)部各個(gè)酶催化反應(yīng)的活性，不能明確具體的限速步驟和分子機(jī)制，限制了代謝路徑通量的提高。針對(duì)這種現(xiàn)狀，尋找新方法/技術(shù)研究單個(gè)關(guān)鍵酶或者某個(gè)模塊的能力可能成為努力的方向。另一方面，天然甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑在大多數(shù)宿主細(xì)胞中非中心代謝途徑，所涉及的酶活性有限，需通過(guò)大數(shù)據(jù)挖掘和計(jì)算設(shè)計(jì)分析，構(gòu)建更加高效的新途徑。

除代謝途徑本身，本文作者認(rèn)為充足的能量和還原力供給對(duì)驅(qū)動(dòng)甲酸生物轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。目前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)供給充足甲酸和氧氣條件下，具有甲酸轉(zhuǎn)化模塊和甲酸供給還原力模塊的大腸桿菌和酵母工程菌也很難實(shí)現(xiàn)菌株生長(zhǎng)，說(shuō)明現(xiàn)有的甲酸轉(zhuǎn)化模塊和能量模塊匹配性還不夠，仍需要更多理性的探索。如Liao課題組改造氧化呼吸鏈，提高菌株生長(zhǎng)，但具體NADH經(jīng)呼吸鏈供給ATP能力有待深入研究。已知甲酸能夠提供能量，那么在甲酸、CO2自養(yǎng)供給體系中，ATP 生成能力、NADH 及NADPH 之間的供給能力、還原力供給與路徑需求之間是否匹配等諸多科學(xué)問(wèn)題亟需解決。

4 結(jié)語(yǔ)

二氧化碳的高效減排、捕集和利用，已經(jīng)成為科研界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的重大課題。目前已發(fā)現(xiàn)6條天然的生物固碳途徑，隨著二氧化碳化學(xué)轉(zhuǎn)化為甲酸技術(shù)的日漸成熟，以甲酸為底物的微生物轉(zhuǎn)化成為生物固碳領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向，包括甲酸生物轉(zhuǎn)化途徑改造和重構(gòu)、與之匹配的還原力供給方式以及甲酸自養(yǎng)型菌株構(gòu)建等方面。近年來(lái)微生物利用甲酸的研究較多，但仍存在諸多挑戰(zhàn)。針對(duì)目前微生物利用甲酸能力有限的現(xiàn)狀，找出甲酸固碳路徑、能量供給等方面的限速步驟成為新的突破口。