一碳化合物生物利用和轉(zhuǎn)化研究進展

姚倫，周雍進

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)研究部，遼寧 大連 116023）

人類對化石資源的使用引起了全球變暖和氣候變化，進而導(dǎo)致如干旱、洪澇、高溫等極端天氣以及海平面上升、土壤荒漠化、生物多樣性減少等，嚴(yán)重威脅了人類的生存和發(fā)展。因此，迫切需要改變對化石資源的依賴。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對生物系統(tǒng)進行改造，已經(jīng)實現(xiàn)利用糖、淀粉、木質(zhì)纖維素等原料合成各種能源燃料、大宗化學(xué)品、材料、藥物等產(chǎn)品，能夠部分取代目前依賴化石資源的能源和化學(xué)品的生產(chǎn)。

第一代生物制造以糖、淀粉等為原料，主要來源于玉米、甘蔗、高粱等，存在“與人爭糧、與糧爭地”等問題。以燃料乙醇為例，2021 年全球產(chǎn)量達273 億加侖（1 加侖=3.78541L），主要以玉米（美國）和甘蔗（巴西）為原料生產(chǎn)[1]，其中，僅美國就有51.5億蒲式耳（1.31億噸）玉米用于燃料乙醇生產(chǎn)，占其全部玉米產(chǎn)量的34%[2]。近期的研究表明，由于美國《可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)》的實施，燃料乙醇大量生產(chǎn)，使得玉米價格上漲30%左右，同時帶動了其他糧食價格上漲，如大豆、小麥等價格提高20%左右；此外，玉米的大量需求使得其種植面積增加8.7%，進而帶來額外的土地開墾（690 萬英畝，1 英畝=4046.864798m2）、化肥的生產(chǎn)和使用、水體污染等，間接導(dǎo)致了額外的CO2排放，使得生物乙醇與傳統(tǒng)汽油相比，反而產(chǎn)生更高CO2排放（24%）[3]。

第二代生物制造以木質(zhì)纖維素為主要原料，包括農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物等。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要經(jīng)過預(yù)處理、酶解等過程才能被微生物利用，因此，仍然面臨效率低、成本過高的困境[4]。其中，預(yù)處理過程（氣爆、酸處理、堿處理等）能耗高、成本高，占全部設(shè)備成本的30%～50%和運行成本的20%～25%；此外，預(yù)處理過程還容易產(chǎn)生呋喃醛、酸類、酚類等對細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，影響后續(xù)微生物發(fā)酵過程。酶解過程需要大量使用纖維素酶，占全部成本的30%，目前纖維素酶存在穩(wěn)定性差、壽命短、活性低等缺陷，致使酶解過程效率偏低，成本過高[5]。

一碳化合物（CO2、CO、甲烷、甲醇、甲酸等）來源廣泛、生產(chǎn)量大、價格相對低廉，除了以傳統(tǒng)化石資源為原料，利用成熟技術(shù)大量生產(chǎn)外，也能夠利用多種可再生資源制備（圖1），是較為理想的新一代生物制造原料。自然界中存在多種能夠利用一碳化合物的微生物，對大腸桿菌、釀酒酵母等模式微生物進行改造，也能構(gòu)建合成型一碳利用微生物，并實現(xiàn)一碳資源到多種產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化[6]。因此，基于一碳化合物的生物制造有望實現(xiàn)能源和化學(xué)品的綠色、可持續(xù)生產(chǎn)，對于實現(xiàn)碳減排、碳達峰和碳中和具有重要意義。

圖1 一碳化合物原料來源

1 一碳化合物原料來源

一碳化合物有氣態(tài)（CO2、CO和甲烷）和液態(tài)（甲醇和甲酸等）兩種類型，自然界和許多工業(yè)生產(chǎn)過程均產(chǎn)生大量的一碳?xì)怏w。其中，CO2資源最為豐富，來源廣泛，大氣中的CO2體積分?jǐn)?shù)約為0.041%?；Y源的利用過程會釋放大量的CO2，這也是造成全球氣候變化的主要原因。根據(jù)國際能源署（IEA）報告，2021 年全球與能源和工業(yè)過程相關(guān)的CO2排放量達363 億噸，達歷史最高水平，其中煤炭、石油和天然氣導(dǎo)致的CO2排放分別為153 億噸、107 億噸和75 億噸，CO2排放主要來源于電力和供熱、鋼鐵冶煉、交通運輸以及建筑等行業(yè)[7]。2021年，中國的CO2排放量達119億噸，是最大的碳排放國[7]。近年來，利用CO2加氫、光催化、電催化等制備還原性一碳化合物（CO、甲烷、甲酸、甲醇）取得快速進展，為CO2的資源化利用和還原性一碳化合物的可持續(xù)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[8]。

CO 和甲烷來源也非常廣泛?；剂系牟煌耆紵掍摰裙I(yè)生產(chǎn)過程均會排放大量的CO。另外，CO 也是合成氣的主要成分之一，合成氣是重要的化工原料，既可由煤、焦炭等固體燃料氣化產(chǎn)生，又可由天然氣、煤層氣、頁巖氣和石腦油等輕質(zhì)烴類制取，還可由重油經(jīng)部分氧化法生產(chǎn)[9]。甲烷是天然氣、沼氣的主要成分，也是造成溫室效應(yīng)的第二大氣體。國際能源署（IEA）報告顯示，2021年全球能源領(lǐng)域的甲烷排放量高達1.35億噸，甲烷排放主要來源于包括煤炭和油氣開采、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物質(zhì)燃燒、垃圾填埋等[10]。生物質(zhì)作為儲量最大的可再生原料，通過氣化獲得含有CO、CO2、氫氣、甲烷等的混合氣體[11]，可實現(xiàn)一碳?xì)怏w的可持續(xù)供應(yīng)。

液態(tài)一碳原料中，甲醇是重要的基礎(chǔ)化工原料，來源穩(wěn)定，價格相對低廉。甲醇主要以天然氣和煤為原料經(jīng)合成氣制備，技術(shù)成熟度較高。2020年，全球甲醇產(chǎn)能達到1.27 億噸，產(chǎn)量約8000 萬噸，我國是最大的甲醇生產(chǎn)國，年產(chǎn)量超過6000 萬噸[12]。可再生的甲醇制備主要有兩條線路：一是以生物質(zhì)為原料，通過氣化然后制備甲醇，潛在的主要原料包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢棄物、城市固體廢棄物、垃圾填埋場和污水產(chǎn)生的沼氣等；二是利用CO2加氫（可再生能源發(fā)電生產(chǎn)的氫氣）生產(chǎn)甲醇[13]。其中，中國科學(xué)院大連化學(xué)物研究所李燦院士團隊研發(fā)的“液態(tài)陽光”技術(shù)已完成千噸級綠色甲醇合成示范工程，目前正在開展十萬噸級綠色甲醇合成工業(yè)示范[14]。甲酸的可持續(xù)供應(yīng)與甲醇類似，除CO2還原外，也可由生物質(zhì)氧化制備[15?16]。

2 一碳化合物的生物利用途徑

一碳化合物中，CO2是碳的最高氧化態(tài)，而甲烷的還原度最高。微生物細(xì)胞中，還原態(tài)的一碳化合物（甲烷、甲醇、甲醛、甲酸和CO）均可發(fā)生氧化反應(yīng)，最終生成CO2，為細(xì)胞提供能量和還原力。甲烷可發(fā)生氧化反應(yīng)生成甲醇，甲醇發(fā)生氧化反應(yīng)生成中間代謝物甲醛，甲醛可以進入同化途徑，包括核酮糖單磷酸途徑（ribulose monophosphate pathway，RuMP）、木酮糖單磷酸途徑（xylulose monophosphate pathway，XuMP） 和 絲 氨 酸 循 環(huán)（serine cycle），也可以進一步被氧化生成甲酸。甲酸再被甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）徹底氧化生成CO2。CO 能發(fā)生氧化反應(yīng)生成CO2，為細(xì)胞提供能量，也可經(jīng)Wood?Ljungdahl途徑進入中心代謝[17]。CO2則經(jīng)卡爾文循環(huán)（Calvin?Benson?Bassham cycle，CBB cycle）等碳固定途徑進入中心代謝（圖2）。

圖2 微生物中一碳化合物代謝途徑

2.1 CO2固定

自然界中存在多條CO2固定途徑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 條天然CO2固定途徑，即卡爾文循環(huán)、Wood?Ljungdahl 途 徑、 二 羧 酸/4?羥 基 丁 酸 循 環(huán)［dicarboxylate/4?hydroxybutyrate （DC/HB） cycle］、3?羥基丙酸/4?羥基丁酸循環(huán)［3?hydroxypropionate/4?hydroxybutyrate（HP/HB）cycle］、3?羥基丙酸雙循環(huán)（3?HP bicycle）、還原三羧酸循環(huán)（reductive TCA cycle，rTCA）和還原甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）[18]。Liu 等[19]對這些途徑進行詳細(xì)的總結(jié)和闡述。

卡爾文循環(huán)是光能自養(yǎng)微生物、化能自養(yǎng)微生物等多種微生物固定CO2的途徑，卡爾文循環(huán)可分為三個階段。① 羧化：核酮糖1,5二磷酸（RuBP）在核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose?1,5?bisphosphate carboxylase/oxygenase， RuBisCO） 的作用下與CO2結(jié)合，隨后分解為2分子3?磷酸甘油酸。② 還原：3?磷酸甘油酸首先在磷酸甘油激酶催化下被ATP磷酸化形成1,3?二磷酸甘油酸，再由甘油醛磷酸脫氫酶催化被NADPH還原形成3?磷酸甘油醛。③ RuBP的再生：3?磷酸甘油醛經(jīng)過一系列反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)??磷酸核酮糖，再由磷酸核酮糖激酶催化進行磷酸化形成RuBP。整個過程需要消耗7個ATP，固定3分子CO2并生成一分子丙酮酸，因此卡爾文循環(huán)被認(rèn)為是能量利用效率最低的碳固定途徑[20]。

卡爾文循環(huán)中的RuBisCO是決定碳同化速率的關(guān)鍵酶，也是光合作用的主要限速步驟之一，其催化效率較低，催化常數(shù)kcat為1～12s?1[21]。RuBisCO既能催化RuBP 與CO2的羧化反應(yīng)，也能以氧氣為底物，使RuBP進入光呼吸途徑，消耗光合作用合成的有機物，從而抑制RuBisCO的羧化酶活性[22]。微藻、藍細(xì)菌等光合微生物中存在CO2濃縮機制（CO2concentrating mechanism，CCM），通過在羧酶體內(nèi)濃縮CO2提高其濃度，從而提高RuBisCO催化CO2羧化反應(yīng)的效率，減少RuBisCO 加氧酶的活性和光呼吸，進而增加光合作用效率。由于RuBisCO的合成需要復(fù)雜的分子伴侶系統(tǒng)協(xié)助其折疊和組裝，對其進行直接改造提高活性難度較大，目前研究主要集中于挖掘新的更高效的RuBisCO 酶[23?25]。Matsumura 等[26]將水稻中的RuBisCO 小亞基替換為來源于C4植物高粱的RuBisCO 小亞基，得到的雜合型的RuBisCO相較于水稻野生型RuBisCO具有更高的催化速率（kcat），與CO2的親和力提高，而與氧氣的親和力降低。Lin 等[25]利用來源于不同茄科植物的RuBisCO 構(gòu)建了其系統(tǒng)進化樹，并預(yù)測RuBisCO的進化過程和祖先酶，將不同RuBisCO祖先酶在大腸桿菌中表達，篩選得到了具有更優(yōu)催化特性的RuBisCO。

還原甘氨酸途徑是最近在硫酸鹽還原菌（Desulfovibrio desulfuricans）中被證實天然存在的CO2固定途徑[18]，在該途徑中，CO2首先被還原生成甲酸，然后經(jīng)過還原和環(huán)化形成5,10?亞甲基四氫葉酸，然后經(jīng)核心固碳酶甘氨酸裂解體系（glycine cleavage system，GCS）催化與CO2和氨生成甘氨酸，甘氨酸經(jīng)過甘氨酸還原酶復(fù)合體、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶催化生成乙酰輔酶A，整個過程固定2 分子CO2。還原甘氨酸途徑常被用來在模式微生物中構(gòu)建CO2和甲酸的同化途徑[17]。

2.2 CO的氧化和同化

CO氧化首先由關(guān)鍵酶一氧化碳脫氫酶（carbon monoxide dehydrogenase，CODH） 催 化 生 成CO2，為細(xì)胞提供能量。CODH 有兩種形式：① 單功能酶，催化CO 氧化生成CO2；② 雙功能酶，不僅能夠?qū)O2還原為CO，還參與催化甲基、CO 和輔酶A 生成乙酰輔酶A。CODH 可分為兩大類：一類為存在于需氧微生物中的Mo?Fe?黃素CODH，該類酶對氧氣不敏感；另一類為存在于厭氧微生物中的Ni?Fe CODH，對氧氣敏感。在這兩類金屬酶中，位于活性中心起關(guān)鍵作用的金屬分別是鉬（Mo）和鎳（Ni），因此這兩類酶分別被稱為Mo?CODH和Ni?CODH，而Ni?CODH 的催化活性遠高于Mo?CODH[27?28]，其中，來源于產(chǎn)氫一氧化碳嗜熱菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）的ChCODH?Ⅱ是目前報道的催化活性最高的CODH[27]，但是由于ChCODH?Ⅱ的氧氣敏感性，限制了其實際應(yīng)用。近期，Kim 等[29]通過將ChCODH?Ⅱ與氧氣相對不敏感但催化活性較低的ChCODH?Ⅳ進行結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)了ChCODH?Ⅱ氣體通道的關(guān)鍵氨基酸（A559），對該氨基酸進行突變能夠大幅改善ChCODH?Ⅱ的氧氣敏感性，而不影響其催化活性。

CO 的同化經(jīng)由Wood?Ljungdahl 途徑完成。該途徑又稱還原乙酰輔酶A 途徑（reductive acetyl?CoA pathway），是產(chǎn)乙酸菌和一些古細(xì)菌（如產(chǎn)甲烷菌）的固碳途徑，以CO 或者氫氣氧化提供能量。Wood–Ljungdahl 途徑由甲基分支和羰基分支組成。在甲基分支中，CO2由甲酸脫氫酶催化還原生成甲酸，隨后由甲基四氫葉酸合成酶催化生成甲酰四氫葉酸，最后由甲基轉(zhuǎn)移酶將其甲基轉(zhuǎn)移形成甲基類咕啉鐵硫蛋白（Methyl?CoFeS）；羰基分支中，以CO為碳源時，CO分子能夠被直接同化進入羰基分支，以CO2為碳源時，CO2首先由一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶復(fù)合體（CODH/ACS）催化形成CO。最后在CODH/ACS催化下，甲基基團、羰基基團和輔酶A共同合成乙酰輔酶A[30]。

2.3 甲烷代謝

甲烷的代謝過程首先由甲烷單加氧化酶（methane monooxygenase，MMO）催化氧化生成甲醇。甲烷單加氧化酶包括兩種類型，即存在于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性甲烷單加氧化酶（soluble MMO，sMMO）以及與膜結(jié)合、顆粒狀的甲烷單加氧化酶（particulate MMO，pMMO）。sMMO由3個蛋白組成，即羥化酶（hydroxylase，MMOH）、還原酶（reductase，MMOR）和調(diào)節(jié)蛋白（regulatory protein，MMOB），其中羥化酶MMOH 負(fù)責(zé)甲烷的氧化。顆粒狀的甲烷單加氧化酶由三個亞基組成（pmoB、pmoA 和pmoC），該酶依賴銅離子發(fā)揮活性，對甲烷具有更強的親和性[31]。甲烷氧化生成甲醇后，再被甲醇氧化酶（methanol dehydrogenases，MDH）氧化生成甲醛，然后通過RuMP途徑或絲氨酸循環(huán)被同化進入中心代謝。

2.4 甲醇代謝

甲醇代謝起始于其氧化生成甲醛，該反應(yīng)由甲醇脫氫酶/醇氧化酶（MDH/AOX）催化，是甲醇代謝的關(guān)鍵酶。目前已發(fā)現(xiàn)三類甲醇脫氫酶/氧化酶：① 吡咯喹啉醌（PQQ）依賴的甲醇脫氫酶（MDH），該酶依賴細(xì)胞色素c介導(dǎo)電子傳遞；② 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的甲醇脫氫酶；③氧依賴的醇氧化酶（AOX）[32]。前兩者存在于甲醇細(xì)菌和甲烷氧化菌中，氧依賴的AOX 則存在于甲醇酵母中，AOX 氧化甲醇生成甲醛和過氧化氫，過氧化氫再被細(xì)胞中的過氧化氫酶分解生成水和氧氣。甲醇酵母的甲醇氧化過程在過氧化物酶體中完成，因此能夠一定程度上降低甲醛和過氧化氫的細(xì)胞毒性[33]。在這三類MDH中，NAD+依賴的MDH應(yīng)用最為廣泛，甲醇氧化得到的電子能夠儲存于NADH，可直接用于后續(xù)產(chǎn)物合成，然而，該類MDH 酶對甲醇的親和性較低[34]。Wu 等[35]對來源于鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）的甲醇脫氫酶進行定點飽和突變和高通量篩選，獲得了對甲醇親和性大幅度提高的MDH，其催化甲醇氧化的kcat/Km值提高了6倍。Roth等[36]利用甲醛響應(yīng)系統(tǒng)開發(fā)了噬菌體輔助的非連續(xù)進化技術(shù)，利用該技術(shù)對甲醇芽孢桿菌的甲醇脫氫酶（MDH2）進行定向進化和篩選，使酶的最大反應(yīng)速率Vmax提高3.5倍。

甲醛可進入異化途徑或同化途徑。在異化途徑中，甲醛首先被甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH）氧化成甲酸，進而被甲酸脫氫酶徹底氧化生成CO2。甲醛同化途徑則使其進入中心代謝，甲基營養(yǎng)微生物中主要有三條同化途徑：存在于酵母中的XuMP途徑，以及存在于細(xì)菌中的RuMP 途徑和絲氨酸循環(huán)。XuMP 途徑中，甲醛首先由二羥丙酮合酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）催化后與5?磷酸木酮糖縮合生成3?磷酸甘油醛和二羥丙酮。二羥丙酮進一步被二羥丙酮激酶（DAK）催化磷酸化生成磷酸二羥丙酮，最后經(jīng)由1,6?二磷酸果糖和6?磷酸果糖生成3?磷酸甘油醛和5?磷酸木酮糖[33]。

RuMP 途徑可分為固定、水解和重排三個過程。在固定過程中，甲醛與5?磷酸核酮糖在3?己酮糖?6?磷酸合酶的催化下縮合形成6?磷酸己酮糖；水解過程由磷酸果糖激酶（PFK）催化6?磷酸果糖形成1,6?二磷酸果糖，進而分解形成3?磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮；在重排過程中，6?磷酸果糖和磷酸丙糖重新形成5?磷酸核酮糖，用于后續(xù)甲醛同化[37]。

在絲氨酸循環(huán)途徑中，甲醛可通過兩條途徑進入絲氨酸循環(huán)。在第一條途徑中，甲醛直接與四氫葉酸結(jié)合形成亞甲基四氫葉酸；在第二條途徑中，甲醛首先經(jīng)一系列反應(yīng)生成甲酸，然后再形成亞甲基四氫葉酸。亞甲基四氫葉酸再與甘氨酸縮合形成絲氨酸，該步驟由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase）催化。絲氨酸經(jīng)過多步反應(yīng)生成乙醛酸和乙酰輔酶A，乙醛酸則用于甘氨酸再生，而乙酰輔酶A通過乙基丙二酰輔酶A途徑被細(xì)胞利用。

2.5 甲酸代謝

甲酸的異化途徑由甲酸脫氫酶催化甲酸氧化生成CO2，為細(xì)胞提供還原力。甲酸的同化需要對其進行還原，甲酸首先與四氫葉酸形成甲?；臍淙~酸，該反應(yīng)由甲酸四氫葉酸連接酶催化，同時需要消耗ATP，然后甲酰基四氫葉酸被還原生成亞甲基四氫葉酸，然后可進入絲氨酸循環(huán)、Wood?Ljungdahl 途徑和還原甘氨酸途徑。亞甲基四氫葉酸也可進一步被分解，生成甲醛，然后經(jīng)過XuMP和RuMP被同化進入中心代謝[38]。

3 一碳化合物的微生物利用和轉(zhuǎn)化

自然界中廣泛存在能夠天然利用一碳化合物的微生物，對這些利用微生物進行改造，已經(jīng)實現(xiàn)利用各種一碳化合物為原料合成多種燃料和化學(xué)品，Jiang等[17]已對相關(guān)代謝工程改造策略進行了詳細(xì)的總結(jié)和討論。各種一碳化合物利用微生物、代表物種、宿主特性、遺傳操作和產(chǎn)物合成等見表1。

表1 一碳利用微生物及相關(guān)產(chǎn)物合成

3.1 CO2

CO2的生物利用首先需要進行固碳，由于CO2是碳的最高氧化態(tài)，因此CO2的固定均需要能量輸入。不同的微生物利用不同的能量來源進行CO2固定。微藻、藍細(xì)菌等光能自養(yǎng)微生物利用光能通過光合作用進行CO2固定，化能無機自養(yǎng)微生物通過氧化還原態(tài)的無機物如氫、CO、銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫等提供能量進行CO2固定。

植物、微藻和藍細(xì)菌等光能自養(yǎng)生物能夠通過光合作用利用光能，生成NADPH 和ATP，通過卡爾文循環(huán)固定CO2，并合成各種糖類等有機物，是地球最主要的碳固定者，為地球生態(tài)系統(tǒng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。許多微藻如小球藻（Chlorella）、隱甲藻（Crypthecodinium）、筒柱藻（Cylindrotheca）等能夠在細(xì)胞中積累三酰甘油（triacylglycerides，TAGs），通常占細(xì)胞干重的20%～50%，最高可達80%[39]，尤其在缺氮、缺磷、缺硫、高鹽等脅迫條件下，細(xì)胞中的三酰甘油會大量積累，可用于合成生物柴油[40]。目前，大部分微藻缺乏成熟的遺傳操作工具，改造相對困難，只有少數(shù)微藻能夠進行遺傳操作，如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、微擬球藻（Nannochloropsis）等[41]。

藍細(xì)菌是能夠進行光合作用的原核微生物，由于其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳改造相對容易，成為熱門的光合微生物底盤細(xì)胞，用于構(gòu)建光合細(xì)胞工廠。典型菌株如集胞藻PCC6803（Synechocystissp. PCC6803）、聚球藻PCC7942（Synechococcus elongatusPCC7942）、聚球藻PCC7002（Synechococcussp. PCC7002）等，均具有相對清晰的遺傳背景和成熟的遺傳操作工具[42]。對藍細(xì)菌的代謝途徑進行改造，已實現(xiàn)了利用光能和CO2直接合成多種能源和化學(xué)品，如乙醇、乙烯、丁醇、異丁醇、長鏈脂肪酸和脂肪醇等[43?44]。

利用光能自養(yǎng)微生物合成生物基產(chǎn)品普遍面臨能量轉(zhuǎn)化效率有限的難題，研究表明，光合作用系統(tǒng)中光能到生物質(zhì)的理論最高能量利用效率為8%～10%，實際效率則低于3%[74]。多種因素限制了光合作用的能量利用效率，例如光合作用系統(tǒng)只吸收波長400～700nm 的太陽光，僅占太陽光總能量的45%，因此可對葉綠素進行改造，拓寬光合作用的有效利用光譜，使其具有更高的太陽能捕獲效率[75]。

鉤蟲貪銅菌（C.necator，又稱Ralstonia eutropha）能夠分別以氫氣和CO2為能源和碳源進行生長，通過卡爾文循環(huán)固定CO2，此外C.necator也能利用甲酸或有機碳為碳源和能源生長，因此屬于兼性化能無機自養(yǎng)微生物。C. necator利用氫氣與CO2的混合氣生長時氫氣的氧化依賴細(xì)胞中的氫化酶（hydrogenase），以氧氣或硝酸鹽為電子受體，C. necator中也發(fā)現(xiàn)了類似于藻類細(xì)胞中的CCM 相關(guān)的酶，能夠提高細(xì)胞中CO2濃度，供RuBisCO進行碳固定[69]。

C.necator能夠在細(xì)胞中天然積累大量PHB，最高可達細(xì)胞干重的80%[70]，因此，可用于生產(chǎn)可降解塑料。該菌株具備相對成熟的遺傳操作體系[71?72]。通過引入外源合成途徑，同時敲除細(xì)胞內(nèi)源PHB 合成途徑，能夠?qū)⑻荚匆肫渌衔锏暮铣桑绠惐迹ㄗ罡弋a(chǎn)量達9.8g/L）[73,76]、異丁醇、異戊二烯類化合物[77]，糖類[78?79]和脂肪酸及其衍生物等[80?81]。C. necator也被用于微生物電合成系統(tǒng)的構(gòu)建，利用體外電子實現(xiàn)CO2的固定和轉(zhuǎn)化，模擬光合作用系統(tǒng)，該人工光合作用系統(tǒng)理論能量利用效率可達18%，實際效率達10%（利用純CO2），以大氣濃度的CO2培養(yǎng)時能量利用效率可達3%～4%[71]。

3.2 CO

自然界存在多種能夠利用CO 的微生物，包括許多細(xì)菌和古菌，這些微生物被稱作一氧化碳自養(yǎng)菌（carboxydotrophs）。根據(jù)CO 代謝時電子受體的不同，可以分為需氧和厭氧兩種類型。需氧的一氧化碳自養(yǎng)菌其CO 氧化以氧氣為最終電子受體。厭氧型一氧化碳自養(yǎng)菌種類繁多，包括產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌等，厭氧的CO 代謝能夠產(chǎn)生多種燃料分子和化學(xué)品，如氫氣、甲烷、乙醇和多種有機酸等，有很大的潛在應(yīng)用價值。一氧化碳自養(yǎng)菌也能夠利用合成生長，對合成氣的利用沒有嚴(yán)格的氣體純度和成分比例的要求，且能耐受氣體中其他污染物，因此一氧化碳自養(yǎng)菌在處理工業(yè)（水泥生產(chǎn)、火力發(fā)電、煉鋼冶煉等）廢氣（含有CO、CO2、氫氣等）用于合成燃料和化學(xué)品方面具有應(yīng)用前景。

需氧的一氧化碳自養(yǎng)菌通過氧化CO提供能量，利用卡爾文循環(huán)固定CO2，也能以氫氣氧化為細(xì)胞提供能量，用于CO2固定。這類微生物遺傳操作工具相對匱乏[45]，目前，僅有少數(shù)菌株實現(xiàn)了遺傳改造[46?47]。代表菌株食羧寡養(yǎng)菌（Oligotropha carboxidovorans）和類黃色氫嗜菌（Hydrogenophaga pseudoflava）是被研究最為廣泛的兩株需氧型一氧化碳自養(yǎng)菌。食羧寡養(yǎng)菌屬兼性化能無機自養(yǎng)微生物（chemolithoautotrophic），除了能夠以CO 為唯一碳源和能源生長，也能以氫氣和CO2的混合氣生長，此外，還能利用乙酸、乳酸、丙酮酸等進行異養(yǎng)生長。自養(yǎng)生長時生長速率較低，倍增時間較長，以CO為碳源和能源時倍增時間約20h，以氫氣和CO2為能源和碳源倍增時間約7h[82]，利用合成氣時倍增時間為40～50h[47]。近期，Siebert 等[45]建立了食羧寡養(yǎng)菌穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化、基因敲除、基因表達等遺傳操作系統(tǒng)，為該菌的后續(xù)研究和改造奠定了基礎(chǔ)。類黃色氫嗜菌是另外一株被廣泛研究的需氧型一氧化碳自養(yǎng)菌，其以CO 為唯一碳源和能源生長時倍增時間約12h，利用氫氣和CO2培養(yǎng)時倍增時間約7h，該菌株已被成功進行代謝工程改造，利用合成氣合成α?紅沒藥烯[46]。

產(chǎn)乙酸菌（acetogens）是被廣泛研究的厭氧CO利用微生物，除CO外，產(chǎn)乙酸菌還能利用合成氣、氫氣和CO2的混合氣體、甲醇、甲酸、乙醇等進行生長。產(chǎn)乙酸菌通過Wood?Ljungdahl 途徑進行碳固定，能夠利用一碳化合物天然合成乙醇、乙酸、乳酸、丁醇、2,3?丁二醇等，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。其中，以一碳?xì)怏w為原料，利用野生型產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum，C. autoethanogenum）生產(chǎn)乙酸、乙醇和2,3?丁二醇已實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)[48]。以不同碳源為原料進行發(fā)酵時，產(chǎn)乙酸菌能夠合成不同的產(chǎn)物，例如Eubacterium limosum在一碳?xì)怏w（H2/CO2/CO）為碳源和能源發(fā)酵時，主要產(chǎn)物為乙酸，而不合成丁酸；當(dāng)以甲醇為碳源發(fā)酵時，能夠大量積累丁酸[53]，顯示產(chǎn)乙酸菌具有很強的代謝可塑性。

厭氧梭狀芽孢桿菌（Clostridium，又稱食氣梭菌）是產(chǎn)乙酸細(xì)菌中的重要類群，代表菌株包括永達爾梭菌（C. ljungdahlii）、產(chǎn)乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌（C.carboxidivorans）等，是目前合成氣發(fā)酵中研究最多的菌株，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。另外，伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii，A. woodii）也是產(chǎn)乙酸菌的模式菌株，被廣泛研究。目前，大部分產(chǎn)乙酸菌都缺乏成熟穩(wěn)定的遺傳操作工具，少數(shù)能夠進行遺傳改造的菌株包括C. ljungdahlii、C. autoethanogenum、A. woodii等。近年來，啟動子、核糖體結(jié)合位點、復(fù)制質(zhì)粒、CRISPR 系統(tǒng)、DNA 轉(zhuǎn)化、同源重組系統(tǒng)等逐漸被開發(fā)和完善，為后續(xù)產(chǎn)乙酸菌的研究和改造提供了便利[49]。除乙酸、乙醇等天然合成的產(chǎn)物外，通過對產(chǎn)乙酸菌進行代謝工程改造，成功合成了其他多種能源和化學(xué)品。通過引入丙酮合成途徑，在C. ljungdahlii和A. woodii實現(xiàn)了以一碳?xì)怏w為原料丙酮的合成[50,83]；通過構(gòu)建PHB的合成途徑，實現(xiàn)了在Clostridium coskatii中PHB的合成[84]；在產(chǎn)乙酸菌中構(gòu)建的其他產(chǎn)物合成途徑包括乳酸[52]、丁酸[51]、異戊二烯和甲羥戊酸等[85]。

3.3 甲烷

甲烷氧化菌（methanotroph）能以甲烷為唯一碳源和能源生長，包括好氧甲烷氧化菌和厭氧甲烷氧化菌，在自然界中廣泛分布。好氧甲烷氧化菌以氧氣為電子受體進行甲烷氧化，厭氧甲烷氧化菌以硫酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽以及金屬離子（Fe3+、Mn4+）等為電子受體氧化甲烷[86]。相關(guān)研究主要集中在好氧甲烷氧化菌，根據(jù)碳同化途徑的不同，可以將好氧甲烷氧化菌分為三類：第Ⅰ類通過核酮糖單磷酸途徑對甲烷進行碳同化，屬于γ變形菌；第Ⅱ類通過絲氨酸循環(huán)對甲烷進行碳同化，屬于α變形菌；第Ⅲ類主要由嗜熱、嗜酸菌組成，通過卡爾文循環(huán)固定CO2實現(xiàn)碳同化，屬于疣微菌門[86]。

目前，關(guān)于甲烷氧化菌代謝途徑的研究和利用主要集中在第Ⅰ類和第Ⅱ類甲烷氧化菌。甲烷氧化菌能夠天然利用甲烷積累多種化合物，如PHB、四氫嘧啶、谷氨酸、糖類、脂類等，另外利用甲烷氧化菌以廉價的甲烷或沼氣為原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白也一直被廣泛研究[54]。通過代謝工程改造，也在甲烷氧化菌中實現(xiàn)了多種其他化合物的合成，包括短鏈有機酸（乳酸、3?羥基丙酸、丁烯酸、琥珀酸）、長鏈脂肪酸、醇類（異丁醇、2,3?丁二醇、1,4?丁二醇）、萜類（異戊二烯、檸檬烯、法呢烯、蝦青素）等[54?55]。

利用甲烷氧化菌合成甲醇也受到廣泛關(guān)注。甲醇是甲烷氧化的直接產(chǎn)物，通過抑制甲醇脫氫酶（MDH）可實現(xiàn)甲醇的積累。Xin 等[87]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)體系中存在CO2時，甲烷氧化菌Methylosinus trichosporiumIMV 3011 能夠通過分解體內(nèi)積累的PHB提供能量，用于固定CO2生成甲醇。由于沼氣中含有一定量的CO2，以沼氣為原料進行甲烷氧化菌發(fā)酵也能實現(xiàn)甲醇的積累，研究還發(fā)現(xiàn)，沼氣中的CO2對于MDH 有抑制作用，因此有助于中間產(chǎn)物甲醇的積累[88]。

3.4 甲醇

自然界中存在多種能夠以甲醇為唯一碳源和能源的微生物，包括原核的甲醇細(xì)菌（扭脫甲基桿菌、甲醇芽孢桿菌等）和真核的甲醇酵母（巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、博伊丁假絲酵母等），廣泛分布于廢水、土壤和植物表面。由于甲醇是甲烷代謝的中間產(chǎn)物，因此甲烷氧化菌也能夠利用甲醇為底物生長。

扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）是目前研究最為詳細(xì)的甲醇細(xì)菌，屬于兼性甲基營養(yǎng)菌，不僅能以還原性的一碳化合物（甲醇、甲胺等）為底物生長，也能以乙酸、琥珀酸等二碳和多碳化合物為底物生長[57,89]。扭脫甲基桿菌利用PQQ 依賴型的甲醇脫氫酶氧化甲醇，其甲醇氧化過程位于細(xì)胞周質(zhì)空間。細(xì)胞中含有兩類甲醇脫氫酶，一類為依賴鈣離子的甲醇脫氫酶（MxaFI），另一類為近年來發(fā)現(xiàn)的依賴鑭系金屬的甲醇脫氫酶（XoxF）[90]。甲醇芽孢桿菌（Bacillus methanolicus）是另一株被廣泛研究的嗜熱甲醇細(xì)菌，最適生長溫度為50～53℃[58]。甲醇芽孢桿菌通過RuMP 進行一碳固定，具有優(yōu)良的氨基酸合成能力，野生型菌株MGA3在以甲醇為碳源條件下，能夠積累0.4g/L 的L?賴氨酸、12g/L的L?丙氨酸和60g/L的L?谷氨酸[91]。

甲醇細(xì)菌尤其是在模式菌扭脫甲基桿菌中，已建立了相對成熟的遺傳操作體系，包括基因表達、基因敲除、轉(zhuǎn)座子突變以及基于CRISPR/Cas9的基因編輯和基因調(diào)控等工具[59?60,92?94]，為甲醇細(xì)菌的深入研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。通過代謝工程改造，已在甲醇細(xì)菌中實現(xiàn)了甲醇到多種能源和化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化，包括聚羥基脂肪酸酯類化合物（PHAs）、氨基酸及其衍生物、有機酸類化合物以及各種精細(xì)化學(xué)品等[61,95]。

甲醇酵母的甲醇代謝位于過氧化物酶體，能夠區(qū)隔中間代謝物甲醛和過氧化氫，降低其細(xì)胞毒性。巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）和多形漢遜酵母（Ogataea polymorpha）是兩株代表性菌株，除甲醇外，還能利用葡萄糖和甘油等多種碳源。兩株甲醇酵母中均建立了相對完善的基因表達、同源重組、CRISPR/Cas9基因敲除等遺傳操作體系[62?63,66,68]。利用甲醇酵母為宿主，通過代謝工程改造實現(xiàn)了利用甲醇合成乳酸和蘋果酸等小分子有機酸以及長鏈脂肪酸及其衍生物等[64?65,67,96?98]，相關(guān)綜述已在這方面作了詳細(xì)的總結(jié)和闡述[99]。

3.5 甲酸

甲酸的微生物利用分為需氧和厭氧兩種類型。在需氧的甲酸代謝中，甲酸被氧化生成CO2，為細(xì)胞提供能量并用于CO2固定。C. necator除了能利用氫氣和CO2的混合氣體生長外，也能以甲酸為唯一碳源和能源生長，是研究最多的甲酸利用微生物之一，其甲酸代謝以氧氣為電子受體。C. necator利用相對耗能的CBB循環(huán)進行CO2固定，所以以甲酸為碳源和能源進行細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)物合成時得率較低。Claassens 等[100]嘗試通過將C. necator中的碳固定途徑由卡爾文循環(huán)替換為更高效的還原甘氨酸途徑，最終以甲酸為碳源生長時細(xì)胞生物量得率接近野生型菌株，雖然沒有檢測到生物量得率的進一步提高，但是為后續(xù)改造提供了思路。

厭氧的甲酸利用微生物主要為產(chǎn)乙酸菌，這些產(chǎn)乙酸菌能夠直接同化甲酸進入Wood?Ljungdahl途徑最終生成乙酰?CoA。除甲酸外，甲醇也能通過該途徑被直接同化，而不經(jīng)過中間代謝物甲醛。近期，Moon 等[101]挖掘了模式產(chǎn)乙酸菌A. woodii甲酸利用的關(guān)鍵酶（甲?；?四氫葉酸合酶和甲酸轉(zhuǎn)運蛋白），這兩個基因的敲除使細(xì)胞甲酸利用速率大幅降低。該作者又詳細(xì)研究了A. woodii的甲酸利用特性，結(jié)果顯示，利用甲酸培養(yǎng)時，細(xì)胞會大量積累乙酸，而以氫氣和CO2培養(yǎng)時，細(xì)胞會暫時積累甲酸，然后又被重新利用，而甲?；?四氫葉酸合酶和甲酸轉(zhuǎn)運蛋白的雙敲除突變體無法重新利用前期積累的甲酸。

4 合成型一碳化合物利用體系

與模式微生物相比，能夠天然利用一碳化合物的微生物遺傳背景不夠清晰，缺乏完善的合成生物學(xué)工具，許多菌株難以進行遺傳操作（如大部分微藻、產(chǎn)乙酸菌等），因此利用模式微生物如大腸桿菌、釀酒酵母等為宿主，通過引入一碳化合物代謝途徑，構(gòu)建合成型一碳化合物利用微生物成為近年來的研究熱點。其中，大腸桿菌是最常用的宿主，通過分別構(gòu)建卡爾文循環(huán)、還原甘氨酸途徑、POAP 循環(huán)、FORCE 途徑、RuMP 途徑、絲氨酸循環(huán)等，使得大腸桿菌能夠同化CO2、甲酸、甲醇等多種碳源。在釀酒酵母、解脂耶氏酵母和谷氨酸棒桿菌中分別引入甲醇代謝途徑（XuMP 途徑、RuMP 途徑），使得這些微生物具備了甲醇同化能力（表2）。

表2 合成型一碳化合物利用體系

合成型一碳化合物利用微生物雖然具備一定的一碳化合物同化能力，然而，這些微生物普遍面臨一碳化合物利用速率慢、異源一碳代謝途徑與宿主內(nèi)生代謝途徑不匹配等問題，導(dǎo)致菌株無法生長或生長緩慢。因此，在菌株構(gòu)建時，除了理性設(shè)計和代謝模型輔助設(shè)計合成型一碳利用途徑外，適應(yīng)性進化也是解決合成型一碳化合物利用菌株生長緩慢的有效途徑。Gleizer等[102]通過在大腸桿菌中引入卡爾文循環(huán)和甲酸氧化途徑，嘗試構(gòu)建以甲酸氧化提供能量固定CO2的自養(yǎng)型大腸桿菌，然而初期得到的菌株以甲酸和CO2培養(yǎng)時無法生長，該作者通過數(shù)月的適應(yīng)性進化，成功得到了能夠自養(yǎng)生長的菌株，進一步研究表明，進化后的菌株在糖代謝、氨基酸合成、核苷酸合成和脂類合成等許多途徑發(fā)生突變，說明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)需要建立新的平衡才能有效利用一碳底物。

另外，構(gòu)建體外酶催化體系也是實現(xiàn)一碳底物有效利用和轉(zhuǎn)化的途徑之一。體外酶催化體系易于控制，能夠避免活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，克服活細(xì)胞代謝和生長易受毒副產(chǎn)物抑制等難題，具有催化專一性高、副產(chǎn)物少、便于后續(xù)產(chǎn)物分離純化等優(yōu)點，因此在一碳化合物利用和轉(zhuǎn)化方面越來越受到重視。最近，馬延和研究員團隊[134]通過多酶催化體系的模塊化組裝，利用C1模塊（甲醛合成）、C3模塊（3?磷酸甘油醛合成）、C6模塊（葡萄糖6?磷酸合成）和Cn模塊（淀粉合成），構(gòu)建了高效合成淀粉的多酶催化系統(tǒng)，結(jié)合CO2人工甲醇合成，實現(xiàn)了以CO2為原料人工合成淀粉的重大突破，其效率可達到植物天然淀粉合成途徑的8.5 倍。然而，體外酶催化體系需要克服酶的高效和低成本分離純化、提高酶的穩(wěn)定性、輔因子高效再生等難題。

5 結(jié)語和展望

一碳化合物作為下一代生物制造原料，其高效轉(zhuǎn)化和利用對于推動低碳、綠色、可持續(xù)的發(fā)展具有重要意義，也是實現(xiàn)“碳達峰、碳中和”目標(biāo)的重要途徑之一。雖然一碳化合物生物利用和轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究正取得快速進展，并已實現(xiàn)微生物和體外酶催化系統(tǒng)利用一碳原料合成多種能源燃料、大宗化學(xué)品和精細(xì)化學(xué)品，然而一碳化合物的生物轉(zhuǎn)化涉及代謝途徑設(shè)計、菌株構(gòu)建、過程優(yōu)化等多方面內(nèi)容仍然面臨諸多難題有待解決，需要進一步開展研究。

（1）一碳化合物利用微生物的遺傳背景、一碳代謝途徑及其調(diào)控等普遍缺乏深入了解，缺乏高效的合成生物學(xué)工具，限制了一碳化合物利用微生物開發(fā)和利用。

（2）關(guān)鍵酶的篩選與改造，一碳化合物代謝的許多關(guān)鍵酶催化效率偏低，需要挖掘新的高催化活性的酶，或者對已有的酶進行改造，RuBisCO、一氧化碳脫氫酶、甲醇脫氫酶等的篩選和改造為這方面研究提供了思路[35?36,135]。

（3）CO、甲酸等一碳化合物還原度低，其氧化提供的能量有限，導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化時得率低，可通過與其他高還原度的化合物（甲烷、氫氣等）共培養(yǎng)，利用這些化合物的氧化提供額外電子。

（4）一碳?xì)怏w水溶解度低，培養(yǎng)時傳質(zhì)效率低，是氣體發(fā)酵的限速步驟，因此需要對相關(guān)氣體反應(yīng)器進行優(yōu)化設(shè)計[136]。