甘草查爾酮A通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞周期阻滯

范曉麗，王 娟，王梨明

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541100；2桂林醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，廣西 桂林541001

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤的首位［1］。在新發(fā)病例中，約85%的病人診斷為非小細(xì)胞肺癌［2］（NSCLC），主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌，其中肺鱗癌約占30%［3］。目前，對(duì)于肺鱗癌的治療，仍以外科手術(shù)切除為主，其次為細(xì)胞毒性化療和免疫治療。近年來(lái)，驅(qū)動(dòng)基因表皮生長(zhǎng)因子受體、間變性淋巴瘤激酶的靶向治療取得了非常好的效果［4,5］。但是，由于缺乏相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，靶向治療對(duì)于肺鱗癌患者受益很少［6］。肺鱗狀細(xì)胞癌總體預(yù)后較差,存在較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，只有約18%的患者存活五年或更長(zhǎng)時(shí)間［7］。因此，開(kāi)發(fā)新的藥物或者治療方法仍是亟待解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，在傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)很多有效成分，成為腫瘤治療的新策略。甘草查爾酮A（LCA）是一種從甘草中分離出來(lái)的類黃酮物質(zhì)，具有抗炎［8］，抗氧化［9,10］和抗腫瘤［11］等多種藥理活性，在體外抗腫瘤中的作用日益明顯。研究表明，LCA在胃癌［12］、肝癌［13］，乳腺癌［14］，前列腺癌［15］以及骨肉瘤［16］等多種細(xì)胞系中具有抗腫瘤作用。LCA在肺癌中的研究很少，有課題組發(fā)現(xiàn)，LCA可以通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞A549 和H460 增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用［17］，在肺癌細(xì)胞株H292 中還可以通過(guò)上調(diào)mir-144-3p 引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［18］。由于肺腺癌和鱗癌的病理類型不同，藥物作用的機(jī)制也可能有很大不同。因此，探究LCA 在肺鱗癌中的作用很有意義。

PI3Κ/Akt信號(hào)通路是大多數(shù)人類腫瘤中最常激活的途徑之一，在肺癌的發(fā)生和進(jìn)展中起到非常重要的作用［19］，PI3Κ/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞增殖相關(guān)，其激活可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)變［20］。有研究表明，許多藥物可通過(guò)抑制PI3Κ/Akt信號(hào)通路抑制腫瘤的生長(zhǎng)［21］。前期研究表明，LCA可能通過(guò)抑制PI3Κ/AΚT/mTOR信號(hào)通路在體外抑制腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移以及誘導(dǎo)自噬［22］。本研究中，我們檢測(cè)了LCA在肺鱗癌H226細(xì)胞和異種移植模型中的抗腫瘤作用，并探究與PI3Κ/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，以期為甘草查爾酮A用于臨床治療肺鱗癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人肺鱗癌細(xì)胞系H226購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所，用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（0.1%DMSO的培養(yǎng)液）、不同濃度的LCA溶液（10、20、40 μmol/L）。先將LCA溶解在DMSO中配制成120 mmol/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2 藥物與試劑

LCA（MCE），胎牛血清、RMPI 1640 培養(yǎng)基（GIBCO），胰蛋白酶和青鏈霉素、PBS及MTT試劑（索萊寶），RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天），CDΚ2、CDΚ4、CyclinD1、Akt、p-Akt、PI3Κ（110 000）以及p-PI3Κ（85 000）抗體（abcam），GAPDH（Proteintech），鼠二抗、兔二抗（北京依瑪博科技有限公司）。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將H226細(xì)胞接種在96孔板中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入不同濃度的LCA溶液（0、2、5、10、20、30 μmol/L）培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μL的DMSO，避光在搖床混勻10 min，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A值）。通過(guò)細(xì)胞抑制率計(jì)算48 h的半數(shù)抑制濃度。細(xì)胞增殖抑制率=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.4 PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以4×105/孔接種于6孔板，過(guò)夜貼壁后，加入終濃度為0、10、20 以及40 μmol/L 的LCA 處理48 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用70%的乙醇固定過(guò)夜，使用前，2000 r/min離心10 min，棄去70%冰乙醇，預(yù)冷的PBS洗滌1次，用0.5 mL RNase懸浮細(xì)胞后，37 ℃水浴30 min，最后加入PI避光染色30 min，300目篩網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在7 cm培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)濃度的LCA溶液（0、10、20、40 μmol/L），48 h后收集細(xì)胞，用碧云天的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量。定量20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫下，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。通過(guò)化學(xué)發(fā)光液顯色，通過(guò)Image Lab 6.0 軟件分析蛋白灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

無(wú)胸腺裸鼠（BALB/c-nu）購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可證：SCXΚ（湘）2019-0004，裸鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，本實(shí)驗(yàn)使用雄鼠，4周齡，共8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組。LCA用含20%SBE-β-CD的生理鹽水溶解。將1×107H226細(xì)胞種植入小鼠右側(cè)腋下，大約7 d瘤體長(zhǎng)徑長(zhǎng)至0.8 cm時(shí)，給予藥物治療，對(duì)照組小鼠注射含20%SBEβ-CD的生理鹽水（200 μL），實(shí)驗(yàn)組小鼠注射15 mg/kg的LCA溶液（200 μL），注射1次/d，連續(xù)24 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，脫頸處死裸鼠，取腫瘤觀察每組腫瘤大小，并稱量腫瘤的質(zhì)量。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（GLMC202103038）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。通過(guò)GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCA處理H226細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度

不同劑量的LCA處理48 h后，H226細(xì)胞活力明顯受到抑制，隨著濃度的增加，其抑制作用越來(lái)越顯著（圖1B）。在LCA濃度為2、5、10、20及30 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力分別為（90.54±2.99）%、（86.31±3.33）%、（73.15±2.78）%、（60.56±2.45）%、（44.86±3.67）%，當(dāng)LCA 濃度高于5 μmol/L 時(shí)，可以有效的抑制H226 細(xì)胞活力（P＜0.05）。LCA處理48 h，IC50為28.3 μmol/L。因此，我們選擇10、20以及40 μmol/L的濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長(zhǎng)至密度大約40%左右，向培養(yǎng)皿中加入終濃度為0、10、20以及40 μmol/L的LCA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化（圖1C），隨著LCA濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

圖1 LCA抑制肺鱗癌H226細(xì)胞增殖Fig.1 LCA inhibits proliferation of H226 cells.A:Chemical structure of LCA.B:Viability of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h(Mean±SD,n=3).C:Morphology of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h.

2.2 LCA對(duì)H226細(xì)胞周期的影響

我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度LCA對(duì)H226細(xì)胞周期的影響（圖2），對(duì)照組及LCA（10、20、40 μmol/L）處理組G1 期的細(xì)胞百分率分別為（23.53±0.50）%、（26.93±0.67）%、（27.70±1.97）%、（32.20±2.07）%。與對(duì)照組相比，LCA處理組細(xì)胞周期G1期的比例明顯升高（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴性，說(shuō)明LCA可以使細(xì)胞阻滯在G1期。

圖2 LCA對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of LCA on cell cycle of H226 cells.A: Flow cytometry of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h.B:Quantitative analysis of the cell percentages in different phases(Mean±SD,n=3).*P＜0.05,**P＜0.01 vs control.

2.3 LCA對(duì)H226細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，LCA可以降低細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、CDΚ2以及CDΚ4的蛋白表達(dá)水平，CDΚ2的相對(duì)表達(dá)量從2.39降低到0.44，CDΚ4的相對(duì)表達(dá)量從2.14降低到0.17，同時(shí)cyclinD1的相對(duì)表達(dá)量從3.25降低到0.18，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 LCA對(duì)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDΚ2和CDΚ4表達(dá)的影響Fig.3 Effect of LCA on expressions of cyclin D1,CDK2 and CDK4 proteins in H226 cells detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).**P＜0.01 vs control.

2.4 LCA對(duì)Akt，p-Akt，PI3Κ以及p-PI3Κ蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot檢測(cè)PI3Κ和Akt的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)LCA 濃度依賴性的降低p-PI3Κ 和p-Akt 的磷酸化水平，p-PI3Κ的相對(duì)表達(dá)量從1.41降低到0.11，p-Akt的相對(duì)表達(dá)量從1.08降低到0.18，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4），但是對(duì)總的PI3Κ和Akt的表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖4）。

圖4 LCA對(duì)AΚT，p-AΚT，PI3Κ以及p-PI3Κ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of LCAon expressions of Akt,p-AKT,PI3K and p-PI3K proteins in H226 cells detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).**P＜0.01 vs control.

2.5 LCA在體內(nèi)抑制H226細(xì)胞增殖

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射LCA后腫瘤體積明顯縮小(圖5A)。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線的分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠的平均體積為1270.85 mm3，LCA處理組小鼠的平均體積為841 mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5B），說(shuō)明注射LCA后腫瘤體積明顯受到抑制。通過(guò)解剖稱量腫瘤的濕重，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠的平均濕重為0.69，LCA處理組小鼠的平均濕重為0.46，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖5C），LCA處理后腫瘤的質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）。Western blot顯示對(duì)照組中p-PI3Κ/PI3Κ 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.95，LCA處理組為0.24，對(duì)照組中p-AΚT/AΚT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.59，LCA處理組為0.19，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5D、E）。

圖5 LCA體內(nèi)抑制H226腫瘤生長(zhǎng)Fig.5 LCA suppresses growth of H226 xenografts in mice.A: Representative image of the tumors.B:Average tumor volume(mm3).C:Weight of wet tumor.D,E:Expressions of Akt,p-AKT,PI3K and p-PI3K protein in tumor xenograft tissues measured by Western blotting.Data are presented as Mean±SD(n=4).*P＜0.05 vs control.

3 討論

甘草查爾酮A是一種常見(jiàn)的具有抗炎和抗菌作用的天然藥物，既往研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外具有很好的抗腫瘤作用，作用機(jī)制主要與抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，但是在肺鱗癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究甘草查爾酮A對(duì)肺鱗癌增殖的影響及可能的機(jī)制。MTT結(jié)果表明，隨著LCA濃度的升高，肺鱗癌H226細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低，說(shuō)明LCA可以抑制H226細(xì)胞增殖。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LCA腹腔注射后，腫瘤的體積和重量都明顯減小，說(shuō)明LCA從體內(nèi)水平抑制了H226細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期的關(guān)系是近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖是癌癥治療的一個(gè)重要策略。研究表明LCA不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［23］，還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯［13,24］。為了進(jìn)一步揭示LCA在肺鱗癌中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明，LCA處理H226細(xì)胞48 h后，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且呈劑量依賴性。說(shuō)明LCA可引起細(xì)胞周期G1期阻滯。細(xì)胞周期中大多數(shù)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因事件發(fā)生在G1期，因此G1/S期過(guò)渡在細(xì)胞周期進(jìn)程中起到非常重要的作用。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白如CyclinD1［25］以及相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白激酶CDΚ2及CDΚ4是細(xì)胞周期進(jìn)程中從G1期進(jìn)入S期非常重要的蛋白［26］，因此，我們通過(guò)Western blot探究了不同濃度LCA對(duì)CyclinD1、CDΚ2及CDΚ4 的表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，LCA 可以下調(diào)cyclinD1、CDΚ2及CDΚ4的表達(dá)，且呈濃度依賴性。

PI3Κ可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄和血管發(fā)生等多種細(xì)胞過(guò)程［27］，AΚT是PI3Κ的主要下游效應(yīng)因子，可被PI3Κ激活，并磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子［28］。有文獻(xiàn)證明，PI3Κ/AΚT信號(hào)通路通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程［29,30］。而且研究還發(fā)現(xiàn)，許多藥物都可以通過(guò)靶向PI3Κ/AΚT信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用［31-33］。為了進(jìn)一步探究LCA對(duì)肺鱗癌H226細(xì)胞的抑制作用是否通過(guò)靶向PI3Κ/AΚT信號(hào)通路，我們研究了不同濃度LCA對(duì)p-PI3Κ、PI3Κ、p-AΚT、AΚT表達(dá)的影響，Western blot的結(jié)果顯示，PI3Κ和AΚT的表達(dá)幾乎無(wú)變化，而p-PI3Κ和p-AΚT的表達(dá)明顯降低，且呈濃度依賴性，這個(gè)結(jié)果表明，LCA抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)周期阻滯的作用可能與抑制PI3Κ/AΚT信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，LCA可以有效的抑制H226細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，并引起細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDΚ2和CDΚ4表達(dá)降低。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)也表明LCA可以在體內(nèi)抑制肺鱗癌的生長(zhǎng)。其作用機(jī)制可能與抑制PI3Κ/AΚT信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。本研究初步揭示了LCA作為抗肺鱗癌治療藥物的可能作用機(jī)制，為L(zhǎng)CA將來(lái)用于肺鱗癌的治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。