BnABCI8影響甘藍型油菜葉綠體發(fā)育

陳曉漢 王麗琴 汪華棟 肖 清 陶保龍 趙 倫 文 靜 易 斌 涂金星 傅廷棟 沈金雄

影響甘藍型油菜葉綠體發(fā)育

陳曉漢 王麗琴 汪華棟 肖 清 陶保龍 趙 倫 文 靜 易 斌 涂金星 傅廷棟 沈金雄*

華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室 / 國家油菜工程技術研究中心, 湖北武漢 430070

成熟葉綠體是高等植物光合作用的重要場所, 是影響作物產(chǎn)量的重要器官。BnABCI8是ABC轉運蛋白I亞族的成員, 在甘藍型油菜中有2個功能拷貝, 分別是和, 其氨基酸序列在不同物種中是非常保守的。表達模式分析發(fā)現(xiàn),在油菜植株各個組織中均有表達, 且在葉和花中表達量較高; 亞細胞定位證明, BnABCI8能夠定位在葉綠體中; 表型鑒定發(fā)現(xiàn),和的同時突變及的單突變均會導致黃色的子葉和褪綠的真葉, 且雙突變體褪綠更為嚴重; 透射電鏡結果顯示, 雙突變體中葉綠體不能夠形成正常的類囊體膜;的敲除導致葉綠素合成途徑相關基因的表達下調(diào), 且葉片中積累了大量的Fe離子。這些結果表明,的突變造成葉綠體結構異常, 葉綠素合成受阻, 葉片中Fe離子大量積累, 而Fe離子的積累又可能會引發(fā)一系列的反應如活性氧積累, 細胞死亡和葉綠素降解等, 最終導致了葉色突變。

甘藍型油菜;; ABC轉運蛋白; 葉綠體發(fā)育; 葉綠素合成; 雜色突變體

葉綠體是高等植物最重要的質(zhì)體之一, 是植物進行光合作用的場所, 它能將光能轉化為化學能以維持植物體的正常生命活動。葉綠體由藍藻通過內(nèi)共生系統(tǒng)整合到宿主真核細胞中, 并不斷進化發(fā)育而來, 因此葉綠體含有自己的基因組。經(jīng)過漫長的內(nèi)共生過程后, 許多基因轉移到了細胞核基因組中, 這一過程使得葉綠體基因組嚴重減少, 而核基因組的復雜度大大增加[1]。葉綠體除了進行光合作用外, 還是葉綠素、血紅素以及其他四吡咯生物合成的場所[2]。其中, 葉綠素的生物合成是由核基因與葉綠體基因共同調(diào)控的, 大約有20多種不同的酶參與這個過程[3], 從谷氨酰-tRNA開始到葉綠素、葉綠素合成結束, 該途徑中任何基因的突變均會導致葉綠素合成受阻, 而導致葉色發(fā)生改變。例如玉米中尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase, UROD)的突變使得玉米葉片葉綠素含量減少且暴露在光下時會壞死病變[4]; 水稻中基因, 編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶(protochlorophyllide oxidoreductase, POR), 它的功能缺失導致葉片褪綠[5];編碼葉綠素合成酶(chlorophyll synthase, CS), 該基因的突變會導致前期葉片黃色后期轉綠[6]。除葉綠素合成途徑受損會導致葉片顏色改變外, 葉綠體發(fā)育相關基因功能的喪失也會導致葉色的變化。編碼葉綠體延長因子G, 擬南芥中突變體表現(xiàn)出白色的子葉[7]。水稻中基因的突變, 導致葉綠類囊體膜形成受阻, 最終導致水稻葉片白化[8]。

ATP結合盒(ABC)轉運蛋白家族是一類古老而龐大的轉運蛋白家族, 其功能主要是進行物質(zhì)的跨膜轉運。植物中ABC轉運蛋白非常豐富, 擬南芥和水稻中分別有130個和128個ABC轉運蛋白[9-10], 而油菜中ABC轉運蛋白數(shù)量更多, 達到314個[11]。但在這眾多轉運蛋白中, 只有小部分被研究報道。這些ABC轉運蛋白不僅參與激素、脂質(zhì)、金屬等運輸, 還參與植物的抗病以及離子通道調(diào)節(jié)等[12-14], 多樣的蛋白功能表明ABC轉運蛋白在植物內(nèi)的分子機制具有一定的復雜性, 有待更進一步探究。根據(jù)序列的相似性及進化分析, 將ABC轉運蛋白家族分成8個主要的亞族并以A～H來表示[15]。此外, 在植物內(nèi)存在一類特殊的細菌類型ABC轉運蛋白, 被命名為ABCI亞族, 與典型的ABC轉運蛋白結構相比, ABCI亞族成員不同時具有NBD和TMD結構域[16]。擬南芥中AtABCI8是一種參與光敏色素a信號通路的遠紅光特異信號因子[17], 此外, AtABCI8能夠與AtABCI6和AtABCI7形成復合物, 參與葉綠體中鐵硫簇的組裝[18]。參與調(diào)節(jié)質(zhì)體內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)[19]。這些研究表明, 擬南芥中的ABCI成員具有多種功能, 包括光信號轉導、鐵硫簇組裝和金屬穩(wěn)態(tài)等。

甘藍型油菜是世界上主要的油料作物之一, 在世界范圍內(nèi)種植面積很廣[20]。由于甘藍型油菜是異源四倍體, 在甘藍型油菜中一個基因可能存在2個到6個功能冗余的拷貝, 因此較難研究油菜基因的功能。最近, CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術與泛基因組序列的不斷完善為研究多倍體作物基因功能提供了極大便利。更重要的是, 目前尚未有任何油菜ABCI亞族成員的功能報道。是ABC轉運蛋白I亞族的成員, 在油菜中的功能未知。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)建了的敲除突變體, 并對突變體進行了表型、細胞學的觀察和葉綠體發(fā)育相關基因的表達分析, 為進一步研究油菜的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和生長條件

本研究以甘藍型油菜6-102B作為轉基因受體材料, 按照本室之前報道的方法進行遺傳轉化[21]。用特異性引物擴增甘藍型油菜6-102B中和的gDNA和cDNA序列用于后續(xù)的研究。亞細胞定位所用的材料為本氏煙草。試驗所涉及的材料在華中農(nóng)業(yè)大學試驗田或溫室中進行種植。溫室溫度為21～23℃、濕度為30%～60%、16 h光照/8 h黑暗。

1.2 結構域和系統(tǒng)進化分析

從甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(http://cbi.hzau.edu. cn/bnapus/index.php)獲得BnABCI8的全長氨基酸序列, 并在NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)中進行BLAST檢索, 批量下載擬南芥、水稻、小麥、大豆、黃瓜、甘藍、白菜、葡萄、煙草、棉花、柑橘中同源蛋白序列。使用MEGA7軟件進行蛋白序列的比對以及系統(tǒng)進化樹的構建并用GeneDoc軟件進行美化。用NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對BnABCI8的蛋白質(zhì)結構域進行預測。

1.3 qRT-PCR分析

取甘藍型油菜6-102B的根、莖、子葉、真葉、蕾、花、角皮、種子進行表達模式的研究。取野生型、單突變體和雙突變體30 d相同葉位的葉片進行以及葉綠素合成途徑相關基因表達水平的檢測。采集的樣品迅速在液氮中冷凍, 并存放于-80℃冰箱。使用Eastep Super總RNA提取試劑盒(LS1040, 上海普洛麥格)提取總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒(AE311, 北京全式金生物技術有限公司)進行反轉錄。使用SYBR Green I (AQ601, 北京全式金生物技術有限公司)和CFX384熒光定量PCR儀檢測基因的相對表達量。反應體系為10 μL, 包含50×稀釋的cDNA產(chǎn)物4.2 μL、正向和反向引物各0.4 μL (10 μmol L–1)、2× Green qPCR SuperMix 5 μL, 按相應的程序進行PCR。以作為甘藍型油菜內(nèi)參基因, 按照2–ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。所用引物見附表1。

1.4 Bn.ABCI8的亞細胞定位

用特異性引物擴增不含終止密碼子的的CDS序列, 并重組到瞬時表達載體pMDC83-35S- GFP中, 得到C端融合GFP的融合產(chǎn)物。將重組的載體轉化到農(nóng)桿菌GV3101中, 利用農(nóng)桿菌將外源基因?qū)氲綗煵萑~片中進行表達。以葉綠體自發(fā)熒光作為標記。使用FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1.5 CRISPR/Cas9載體構建及轉基因植株編輯情況檢測

本研究所用的基因編輯載體為陳其軍實驗室的雙靶點載體, 按照所報道的方法進行載體構建[22]。利用CRISPR-P 2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/cgi- bin/CRISPR2/CRISPR)網(wǎng)站進行靶點的設計, Cas9引物用于轉基因陽性植株的鑒定, 利用Hi-TOM高通量測序技術對轉基因陽性植株進行編輯情況檢測[23]。

1.6 葉綠素含量測定

分別取3株野生型和T1代雙突變體30 d和56 d的葉片, 除去葉脈并剪成小碎片, 稱重約0.3 g放入到50 mL離心管中, 并倒入20 mL (丙酮∶乙醇=8∶1, v/v), 在黑暗中放置48 h, 期間多次搖晃。然后將樣品3000′離心10 min, 用比色皿收集上清在分光光度計(UV-1800, Mapada, 上海)中進行測量。測量波長為470 nm、646 nm和663 nm下的吸光度值, 按Arnon公式計算: 葉綠素濃度Ca = 12.21A663-2.81A646; 葉綠素濃度Cb=20.13A646-5.03A663; 類胡蘿卜素和葉黃素濃度C = (1000A470–3.27Ca– 104Cb)/229。葉綠素含量(mg g–1) = C′V/ 1000A; 其中C為葉綠素濃度(mg L–1), V為提取液總體積(mL), A為葉片鮮重(g)。

1.7 葉片F(xiàn)e離子含量測定

分別取3株野生型和T1代突變體30 d的葉片, 150℃殺青30 min, 然后在80℃條件下干燥48 h, 用研缽磨樣, 避免接觸金屬, 精確稱量粉末0.10 g放入10 mL試管中并記錄, 添加2 mL硝酸過夜, 將過夜后的離心管放入100℃水浴鍋水浴2 h, 待冷卻后加入蒸餾水至總體積為10 mL, 利用鐵離子標準液配置0、2、4、6、8、10和12 μg mL–1的鐵離子溶液, 使用火焰原子吸收光譜儀測量鐵離子含量。

1.8 葉綠體超微結構觀察

取野生型和T1代突變體56 d的葉片, 用剪刀剪成1 mm′2 mm的矩形小塊, 并放入2.5%戊二醛中固定, 抽真空使得葉片下沉為止, 固定2 h以上后送華中農(nóng)業(yè)大學電鏡平臺進行處理和葉綠體超微結構的觀察。

2 結果與分析

2.1 結構域和系統(tǒng)進化分析

在甘藍型油菜中主要有2個功能拷貝, 分別是和。其中與白菜中的高度相似,與甘藍中的高度相似。因此,可能是來自于二倍體祖先白菜的,可能來自于二倍體祖先甘藍的(圖1-A)。與擬南芥、水稻、小麥、大豆、黃瓜的氨基酸序列相比, BnABCI8的N端是不保守的。另外根據(jù)預測BnABCI8還含有一個SUFBD結構域, 這個結構域在這些物種中是非常保守的(圖1-B)。

2.2 BnABCI8以組成型模式表達且BnABCI8蛋白定位在葉綠體上

為探索的時空表達模式, 設計特異引物檢測了和在不同組織中的表達水平。定量結果分析顯示,和的表達模式相似, 在各個組織中均有表達, 且在根和莖中表達量較低, 在花和葉中表達量較高(圖2)。

圖1 植物中ABCI8同源蛋白之間的進化關系

A: BnABCI8及其同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。分支上的數(shù)字是1000次重復的引導值(%)。B: BnABCI8及其5種同源蛋白的氨基酸序列。

A: the phylogenetic tree of the sequence of BnABCI8 and its putative orthologs in different species. Numbers on branches are bootstrap values for 1000 replications. B: the amino acid sequences of BnABCI8 and putative orthologs in five species.

圖2 BnABCI8的表達模式

數(shù)值表示為±SD (= 3)。Values are means ± SDs (= 3).

為研究BnABCI8蛋白的亞細胞定位情況, 本研究將、的全長CDS去終止密碼子后重組在pMD-C83載體GFP的N端, 在本氏煙草中進行蛋白的瞬時表達, 通過激光共聚焦顯微鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)融合蛋白的綠色熒光能夠與葉綠體自發(fā)熒光重疊, 表明BnA09.ABCI8和BnC09. ABCI8定位于葉綠體(圖3)。進一步說明該蛋白主要行使功能的部位在葉綠體, 可能參與維持葉綠體的正常功能。

2.3 BnABCI8功能分析

為進一步研究在甘藍型油菜的功能, 本研究利用CRISPR/Cas9技術對的兩個功能拷貝進行了敲除。的全長CDS為1659 bp, 編碼552個氨基酸。的全長CDS為1650 bp, 編碼549個氨基酸。兩者都包含2個外顯子和1個內(nèi)含子(圖4-A), 且它們的CDS序列高度相似。經(jīng)過T0代陽性植株檢測, 共計得到10株陽性植株(圖4-B), 然后進行二代測序檢測編輯情況。

經(jīng)高通量測序結果顯示T0代得到的突變體均是雜合突變類型。為獲得穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料, 挑選T0代雜合突變體進行了自交加代, 分離得到了、均被編輯的純合雙突變體及被編輯的純合單突變體(圖5-A)。隨后選取了部分雙突變體、單突變體以及野生型植株進行了相對表達量的鑒定。qRT-PCR結果顯示, 與野生型葉片相比,和在雙突變體中表達顯著降低。在的單突變體中,的表達量明顯下降, 而的表達似乎也受到了影響, 部分單株表達顯著降低(圖5-B), 可能這2個拷貝在甘藍型油菜中以二聚體的形式發(fā)揮作用。表明經(jīng)CRISPR/ Cas9系統(tǒng)編輯不僅影響了的翻譯產(chǎn)物而且影響該突變基因的轉錄水平。

圖3 BnABCI8的亞細胞定位

A, E: P35S::BnaA09.ABCI8:GFP和P35S::BnaC09.ABCI8:GFP轉化煙草后的綠色熒光圖像; B, F: 葉綠體在煙草中的紅色熒光圖像; C, G: 明場下的圖像; D, H: 分別由A～C和E～G的合并圖像。

A, E: green fluorescence signals of transformed tobacco with the P35S::BnaA09.ABCI8:GFP and P35S::BnaC09.ABCI8:GFP constructs, respectively. B, F: red fluorescence of chloroplasts in tobacco. C, G: the image under bright field. D, H: the merged images from (A–C) and (E–G), respectively.

圖4 BnABCI8的基因結構和CRISRP陽性植株鑒定

A:和的基因結構; B: 轉基因陽性植株電泳鑒定。Marker大小分別為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、200 bp, 目的條帶大小為686 bp。

A: gene structure ofand;B: the electrophoretic identification of CRISPR-edited positive plants. The marker bands are 2 kb, 1 kb, 750 bp, 500 bp, and 200 bp, respectively, and the target band is 686 bp.

圖5 T1代突變體的鑒定

A: 部分植株的編輯情況。黃色標記表示PAM位點以及插入的堿基, 紅色破折號表示缺失。B: 突變體中的相對表達量。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

A: the editing of some plants. The yellow mark indicates the PAM site and the inserted base, and the red dash indicates the deletion. B: the relative expression levels ofin mutants. * and ** mean significant differences at< 0.05 and< 0.01, respectively.

選取單突變體、、和雙突變體、、進行了表型的考察。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn), 單突變體與雙突變體均表現(xiàn)出黃色的子葉, 子葉邊緣較白, 新生的真葉為綠色, 后期真葉慢慢褪綠為雜色(圖6)。雙突變體褪綠較快且嚴重, 雜色更明顯, 且發(fā)白, 綠色部分非常少, 生長非常緩慢、長勢弱。單突變體真葉褪綠較緩慢, 存在較多綠色部分, 生長速度和長勢與野生型相比較弱(圖7)。

接著分別取了雙突變體30 d和56 d的葉片進行了觀察并測定葉綠素含量。結果顯示, 與野生型相比, 在幼苗生長前期, 雙突變體出現(xiàn)輕微雜色, 葉綠素和葉綠素含量下降, 而葉綠素和葉綠素的比值上升。在生長后期, 葉色褪綠更為明顯, 葉綠素和葉綠素含量下降更為明顯, 葉綠素和葉綠素的比值上升更加顯著(圖8)。

2.4 葉綠素合成途徑相關基因表達分析

突變體葉片葉綠素含量的降低可能與葉綠素的合成受阻或者葉綠素降解加快等原因有關, 為探究葉色的改變是否由葉綠素的合成受阻導致的, 本研究對雙突變體當中葉綠素合成途徑的相關基因的表達水平進行了檢測。結果表明, 葉綠素合成途徑中的關鍵基因如、、等都明顯的下調(diào)表達(圖9)。說明的突變影響了甘藍型油菜葉綠素的生物合成, 對于是否會影響葉綠素的降解過程有待進一步研究。

圖6 突變體子葉的表型觀察

A～C: 野生型幼苗10 d齡; D～F: 單突變體10 d齡; G～I: 雙突變體10 d齡; J～L: 雙突變體17 d齡。

A–C: 10-day-old wild type; D–F: 10-day-old single mutants; G–I: 10-day-old double mutants; J–L: 17-day-old double mutants.

圖7 突變體的表型觀察

A: 野生型56 d齡; B: 單突變體56 d齡; C: 雙突變體56 d齡。

A: 56-day-old wild type; B: 56-day-old single mutants; C: 56-day-old double mutants.

圖8 雙突變體真葉表型觀察及葉綠素含量測定

A, C: 30 d雙突變體和野生型的真葉和葉綠素含量比較圖; B, D: 56 d的雙突變體和野生型的真葉和葉綠素含量比較圖。數(shù)值表示為±SD (= 3)。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

A, C: the comparison of true leaves and chlorophyll contents between double mutant and WT at 30 days old; B, D: the comparison of true leaves and chlorophyll contents between double mutant and WT at 56 days old. Values are presented as mean ± SD (= 3). * and ** mean significant differences at< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.5 突變體葉片F(xiàn)e離子含量測定

在擬南芥中的同源基因為,作為葉綠體中SUF系統(tǒng)的支架參與到葉綠體鐵硫簇的組裝[18], 甘藍型油菜的與擬南芥的高度同源, 并且都具有參與SUF系統(tǒng)的SUFBD結構域, 預示著也可能參與到葉綠體鐵硫簇的組裝, 可能對維持甘藍型油菜葉綠體中鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用。為此, 測定了雙突變體以及單突變體葉片中Fe離子含量。根據(jù)結果顯示, 單突變體Fe離子的含量是野生型的1.5倍左右, 而雙突變體中Fe離子的含量是野生型的3倍左右(圖10)。說明的突變會導致葉片中Fe含量的積累,可能參與到維持甘藍型油菜葉片中Fe的穩(wěn)態(tài)。

2.6 雙突變體真葉的葉綠體超微結構觀察

葉綠體是葉綠素、血紅素以及其他四吡咯生物合成的場所。葉綠體發(fā)育異常也會影響到葉綠素的代謝從而導致葉色的改變。為了解的突變是否會對葉綠體的發(fā)育造成影響, 本研究取野生型和雙突變體56 d的真葉進行了透射電鏡觀察。結果顯示, 在雙突變體真葉中, 細胞中葉綠體數(shù)目較少且發(fā)育不良, 不飽滿, 且葉綠體內(nèi)部缺乏類囊體膜。相比之下, 野生型真葉中葉綠體數(shù)目多發(fā)育正常且飽滿, 能夠明顯的觀察到類囊體膜結構(圖11)。說明的突變使得葉綠體不能夠正常形成類囊體膜, 葉綠體的發(fā)育受到了影響。

圖9 葉綠素合成途徑相關基因的相對表達量

數(shù)值表示為±SD (= 3)。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

Value is mean ± SD (= 3). * and ** mean significant differences at< 0.05 and< 0.01, respectively.

圖10 葉片中Fe的含量

表示突變的單突變體;表示和突變的雙突變體。數(shù)值表示為±SD (= 3)。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

represents single mutants of the;represents double mutants of theand. Value is mean ± SD (= 3). * and ** mean significant differences at< 0.05 and< 0.01, respectively.

3 討論

3.1 BnABCI8在葉綠體發(fā)育過程中起重要作用

植物中許多葉色突變與葉綠體發(fā)育之間存在某種因果關聯(lián), 葉色突變體的葉綠體結構往往表現(xiàn)出異常。擬南芥中編碼PD1蛋白基因的突變使得突變體PEP依賴性轉錄顯著受損, 造成葉綠體沒有類囊體結構, 幼苗無法積累色素[24]; 甘藍型油菜黃色子葉突變體中,的突變影響了質(zhì)體基因轉錄 , 造成類囊體膜形成受阻, 葉綠素和葉綠素含量顯著下降[25]; 甘藍型油菜黃化突變體中, 編碼TPR蛋白基因的突變, 導致葉綠體發(fā)育不良, 類囊體減少, 葉綠素和葉綠素含量下降[26]。在本研究中,編碼葉綠體定位的ABC轉運蛋白, 該基因的突變造成甘藍型油菜子葉變黃, 真葉褪綠, 葉綠素和葉綠素含量顯著下降, 同時伴隨著葉綠體結構異常, 尤其是類囊體膜結構受損嚴重。

圖11 野生型和雙突變體的葉綠體超微結構

A～C: 野生型葉綠體結構; D～F: 雙突變體葉綠體結構; Cp: 葉綠體; Tm: 類囊體膜。

A–C: the chloroplast structure of wild type; D–F: the chloroplast structure of double mutant; Cp: chloroplast; Tm: thylakoid membrane.

葉綠素的含量與葉色有著直接的聯(lián)系, 葉色突變體在生長過程中往往表現(xiàn)出光合效率低, 長勢與野生型相比較弱, 嚴重可能致死的情況。如黃綠白菜型油菜突變體, 其葉綠體基粒類囊體數(shù)目較少,總葉綠素含量顯著降低, 植株矮小[27]; 玉米黃綠葉突變體不能產(chǎn)生雄穗, 長勢明顯弱于野生型[28]; 擬南芥中PD1基因的突變使得突變體白化和幼苗致死[24]。本研究中的突變體表現(xiàn)出植株長勢弱于野生型的現(xiàn)象, 該現(xiàn)象可能由葉片葉綠素含量下降, 光合效率低不能夠提供充足的能量供生長發(fā)育所致。

綜上所述,在葉綠體發(fā)育過程中起著重要的作用, 該基因的突變會導致葉綠體發(fā)育異常, 葉綠素含量減少, 株高降低等現(xiàn)象。

3.2 BnABCI8維持甘藍型油菜葉片F(xiàn)e穩(wěn)態(tài)

在進化過程中, 真核宿主細胞與藍藻共生而產(chǎn)生葉綠體作為光合作用的細胞器, 因此葉綠體內(nèi)有過渡金屬, 包括鐵、銅和錳, 它們具有氧化還原能力,對于光合電子傳遞是必需的, 一些過渡金屬穩(wěn)態(tài)受到破壞會影響葉綠體的正常功能。已有研究表明, 在擬南芥中定位于葉綠體的鐵轉運蛋白基因被敲除后, 植株表現(xiàn)出嚴重的褪綠現(xiàn)象[29-31]; 水稻中的缺陷型突變體表現(xiàn)出較高的Mn含量和較低的Cu含量, 葉綠體類囊體結構被破壞, 葉片黃化[10];缺陷型突變體表現(xiàn)出較高的Fe含量和Ni含量, 葉綠體發(fā)育異常, 葉片白化[32]。在本研究中, 通過火焰原子吸收光譜儀檢測發(fā)現(xiàn), 突變體葉片中Fe離子含量顯著增加, 因此我們認為參與調(diào)節(jié)甘藍型油菜葉片中Fe穩(wěn)態(tài),被敲除后, Fe離子穩(wěn)態(tài)受到破壞, 葉綠體正常功能受到了影響, 葉色發(fā)生了改變。

在擬南芥的同源基因為,作為葉綠體中SUF系統(tǒng)的支架參與葉綠體鐵硫簇的組裝[18], 基于甘藍型油菜和擬南芥ABCI8蛋白序列的保守性, 我們同樣也可以推測, 在甘藍型油菜中可能參與葉綠體鐵硫簇的組裝。由于葉綠體中許多蛋白質(zhì)需要鐵硫簇作為輔因子, 其次葉綠素的生物合成也需要鐵硫簇。葉綠素很不穩(wěn)定, 容易受到各種因素影響而導致降解。因此該基因突變之后, 造成葉綠體結構異常和鐵水平的增加, 引起葉綠素的生物合成和降解紊亂, 導致甘藍型油菜葉色突變。

4 結論

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向敲除基因構建了甘藍型油菜葉色突變體。在葉中高量表達, 其編碼的蛋白定位在葉綠體中。該基因的突變造成葉綠體結構異常, 葉綠素合成受阻, 植株葉綠素含量下降, 長勢弱, 并且葉片中鐵離子的穩(wěn)態(tài)遭到破壞。研究結果表明,對于甘藍型油菜葉綠體的正常發(fā)育是至關重要的。

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附表1 本研究中用到的引物

Table S1 Primers used in this study

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence (5'-3')作用Function C83-A09FcttgcatgcctgcaggtcgacATGGCGTCTCTCCTCGCG亞細胞定位Subcellular localization assay C83-A09RtctaccggtacccggggatccGAACCCACTGATCCTTCAAGCTT C83-C09FFcttgcatgcctgcaggtcgacATGGCGTCTCTCCTCGCG C83-C09RRtctaccggtacccggggatccGAACCCACTGATCCTTCAAGCTT C83FATTTCATTTGGAGAGGACCTCG C83RTGTGCCCATTAACATCACCATC QA09FATCCAGGTTAAGAATCCATCAGCGqPCR分析qPCR analysis QA09RTCTGCAGAACCCTGAGATCATCG QC09FATCCAGGTTAAGAACCCATCAGCC QC09RTCTGCAGAACCCAGAGATCATTG QHEMA1FTCCGAGGAACAACAACAGAACCAG QHEMA1RTGTATATCTGTCGGGTGCAGAGT QHEMCFCGGTTCCGTCTCCGTCAT QHEMCRGGCATTAGGTGCGGATTCAG QHEME2FCGAAATCTTCCCGGTCAATTCGTTG QHEME2RAGAGGCTCAGTGGTTGCAGAG QCHLHFGCACGCTTGGTTTGCATCCTATT QCHLHRCATGTGACTTCCCTGTTCTAGGGTCA QCHLDFGATTGCTATTTCAGGTCGTAGAGG

(續(xù)附表1)

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence (5'-3')作用Function QCHLDRGTTCGTCTTCCCACTCATCAG QCHLMFGCGACGATCGTTTCCTTGAC QCHLMRAAATACTCCCTCACCACCTCCTT QDVRFTCCAGTGGATACATACAACCAATGGCT QDVRRATTGGTTTGGAAGGTGGAAGCGAGA QPORCFCCGACAAGATCTCCATCAAGGAG QPORCRCGGCGATGCTTCGTTCGAT QCHLGFCGAGTTGGAGCACTCTCTCTCCA QCHLGRCTCTTCCCAGAAGAGTTGGAGTCC QCAOFGTCTATTGTCTTCCTTCTTCCTC QCAORTCCTTTCACTCCCTTCTTTCTG actionQ3FCTATCCTCCGTCTCGATCTCGC actionQ3RCTTAGCCGTCTCCAGCTCTTGC HA09-1-FggagtgagtacggtgtgcACAGTACTTCCAAAACCTAGACTACGACHi-tom分析Hi-tom analysis HA09-1-RgagttggatgctggatggGCCGAGCTTGTCGAAATACTCGA HA09-2-FggagtgagtacggtgtgcCCGCTTTGAACTCAGCTGTGT HA09-2-RgagttggatgctggatggCTTCGTGACGAAATTATAAATCCCTCCT HC09-1-FggagtgagtacggtgtgcGCAATACTTCCAAAACCTAGACTACGAC HC09-1-RgagttggatgctggatggGCCGAGCTTGTCGAAGTAGTCAA HC09-2-FggagtgagtacggtgtgcCTGCTCTGAACTCCGCCG HC09-2-RgagttggatgctggatggGTGACGAAATTGTAGATCCCTCCCTTC F-1ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttGCGTtggagtgagtacggtgtgc F-2ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttGTAGtggagtgagtacggtgtgc F-3ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttACGCtggagtgagtacggtgtgc F-4ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttCTCGtggagtgagtacggtgtgc F-5ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttGCTCtggagtgagtacggtgtgc F-6ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttAGTCtggagtgagtacggtgtgc F-7ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttCGACtggagtgagtacggtgtgc F-8ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttGATGtggagtgagtacggtgtgc F-9ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttATACtggagtgagtacggtgtgc F-10ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttCACAtggagtgagtacggtgtgc F-11ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttGTGCtggagtgagtacggtgtgc F-12ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcttACTAtggagtgagtacggtgtgc R-AGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtGCGTtgagttggatgctggatgg R-BGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtGTAGtgagttggatgctggatgg R-CGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtACGCtgagttggatgctggatgg R-DGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtCTCGtgagttggatgctggatgg R-EGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtGCTCtgagttggatgctggatgg R-FGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtAGTCtgagttggatgctggatgg R-GGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtCGACtgagttggatgctggatgg R-HGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctgtGATGtgagttggatgctggatgg 5UDI427AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTTCAAACACTCTTTCCCTACACGACGC 5UDI428AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGAACCTACACTCTTTCCCTACACGACGC 7UDI427CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCACGAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTT

(續(xù)附表1)

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence (5'-3')作用Function 7UDI428CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTAGCCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTT Cas9FCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCG基因編輯Gene editing Cas9RAGTTGCCCCTAGCGAGTGGG U626-IDFTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC U629-IDRAGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC crp1-BsF-ABCI8ATATATGGTCTCGATTGACTCCTTCACAATCCCCAAGTT crp1-F0-ABCI8TGACTCCTTCACAATCCCCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC crp2-R0-ABCI8AACCGTGTTCTTGGGGATATAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC crp2-BsR-ABCI8ATTATTGGTCTCGAAACCGTGTTCTTGGGGATATAGCAA

affects chloroplast development of

CHEN Xiao-Han, WANG Li-Qin, WANG Hua-Dong, XIAO Qing, TAO Bao-Long, ZHAO Lun, WEN Jing, YI Bin, TU Jin-Xing, FU Ting-Dong, and SHEN Jin-Xiong*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center of Rapeseed, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Mature chloroplast is an important place for photosynthesis of higher plants and important organs that affects crop yield. BnABCI8 is a member of the ABC transporter I subfamily, and there are two functional copies ofandin. Their amino acid sequences are very conserved in different species. The relative expression patterns showed thatwas expressed in all tissues of, and the relative expression level in leaves and flowers was higher. Subcellular localization indicated that BnABCI8 was located in chloroplast. Phenotypic identification showed that the double mutation ofandand the single mutation ofboth resulted in yellow cotyledons and chlorotic true leaves, among which double mutant was more severe chlorosis. Transmission electron microscope demonstrated that the chloroplasts in the double mutants could not form normal thylakoid membranes. The knock-out ofresulted in the decrease of the relative expression level of related genes in the chlorophyll synthesis pathway, and significantly increased the iron content in mutant leaves. These results indicated that the mutation ofresulted in abnormal chloroplast structure, hindered the synthesis of chlorophyll, and significantly increased the iron content in the leaves. In addition, the accumulation of iron ion might lead to a series of reactions such as accumulation of reactive oxygen species, cell death and chlorophyll degradation, and eventually led to mutation of leaf color.

;gene; ABC transporter; chloroplast development; chlorophyll synthesis; variegated mutant

10.3724/SP.J.1006.2023.24065

本研究由國家自然科學基金項目(31930032)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31930032).

沈金雄, E-mail: jxshen@mail.hzau.edu.cn

E-mail: 809365931@qq.com

2022-03-23;

2022-07-21;

2022-08-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220811.1912.004.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).