產(chǎn)單核細胞李斯特菌分子分型技術的最新研究進展

李文靜，劉凌云，解 媛，史 簡，李 雪，陸書華

（1.濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東濟寧 272067；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，山東濟寧 272000）

產(chǎn)單核細胞李斯特菌(ListeriaMonocytogenes，LM)，是一種食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，食用受該菌污染的食物可導致人類感染并可能引起嚴重的李斯特菌病，該病主要發(fā)生在某些特定人群中，如孕婦、新生兒、免疫功能低下者和患有基礎疾病的老年人，臨床表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、胎兒早產(chǎn)、孕婦流產(chǎn)，甚至導致人類死亡，該病死亡率高達20%～30%[1-2]。李斯特菌病潛伏期長達70天，這使得追蹤其流行病學來源變得十分困難[3]。近年來，分子分型技術作為李斯特菌病流行病學調查的重要工具，在明確LM致病性、遺傳相關性、追蹤污染源、確定傳播途徑、控制疫情暴發(fā)等方面具有重要意義。通過對LM分離株進行分子分型可以建立臨床病例和可疑食物之間的聯(lián)系，有利于污染源的追蹤。目前，LM分子分型技術主要包括兩大類，一類是基于電泳的分型技術，另一類是基于測序的分型技術。本文就LM分子分型技術的最新研究進展進行詳細綜述。

1 基于電泳的分型技術

1.1 脈沖場凝膠電泳( pulsed-field gel electrophoresis，PFGE) PFGE最早是由哥倫比亞大學的SCHWARTZ和CANTOR于1984年開發(fā)的一種用于分離大分子DNA或染色體的方法。該方法靈敏度高、分辨率強、重復性好，在國內外得到廣泛應用，特別是在菌株鑒定和追蹤污染源方面發(fā)揮了重要作用，被認為是細菌分子分型的金標準[4]。PFGE的基本原理是基于酶切產(chǎn)生的大小不等的DNA片段在脈沖電場中遷移速率的不同將DNA片段分離，經(jīng)溴化乙錠（EtBr，EB）染色后在凝膠上出現(xiàn)按DNA大小排列的電泳條帶，根據(jù)可視化條帶的差異進行菌株型別的判斷。PA?IN等[5]人使用限制性核酸內切酶APAI對香腸中分離出的10株LM進行脈沖場凝膠電泳技術（PFGE）分型，結果顯示所有菌株的電泳圖譜之間無條帶差異，菌株亞型無法區(qū)分。SHAKUNTALA等[6]人聯(lián)合使用APAI酶和ASCI酶對印度東北部收集的47株動物源性LM分離株進行PFGE分析，共發(fā)現(xiàn)37種脈沖型，并指出雙酶切的使用可以大幅度地提高PFGE對LM亞型的區(qū)分度。盡管PFGE是LM分子分型的金標準，但它所需的專業(yè)設備昂貴、耗時耗力、對人員要求高、對條帶的解釋帶有主觀性、結果分析需要采用專門的軟件，所以在臨床中未被廣泛應用，主要應用于科研及食品中LM的分型。

1.2 核糖體分型（ribotyping，RT） RT是基于編碼核糖體的高度保守的基因序列，用標記的大腸埃希菌rRNA探針與限制性內切酶切割LM全基因組所產(chǎn)生的DNA片段進行Southern雜交而獲得帶型差異的一種分子指紋技術[7]。該技術靈敏度高、重復性好，但需要用到放射性同位素、實驗步驟繁瑣、分辨力一般，不能有效區(qū)分1/2b和4b型菌株。目前，國際上已有完全自動化的微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（automated ribotyping，AR)，它是基于RT原理，經(jīng)滅活、酶切、雜交、成像等自動化程序，對細菌核糖體進行指紋圖譜分析的自動化設備。DE CESARE等[8]人基于AR研究了15種不同的酶對LM菌株鑒別的適用性，發(fā)現(xiàn)使用EcoRI，PvuII和XhoI三種限制性內切酶不僅對LM菌株有較高的鑒別力，而且可以顯著提高4b型菌株的區(qū)分度。AR排除了人為因素對實驗結果的影響，操作簡單、省時省力、高度標準化、重復性好、結果穩(wěn)定，但由于AR分辨率較低，故其在菌株鑒定和分子分型方面的應用受限，適于大樣本量菌株的初步研究[9]。

1.3 擴增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP又稱選擇性限制片段擴增,它是限制性酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增和電泳后得到不同分子量大小的DNA條帶，通過比較DNA條帶的差異來檢測DNA多態(tài)性的一種技術[10]。目前，國外學者關于AFLP在病原微生物方面的研究比較廣泛，國內尚不多見。LOMONACO等[11]人利用AFLP技術對環(huán)境及食品中的108株LM進行分析，結果顯示AFLP可將LM菌株分成兩個遺傳譜系，包括譜系I（血清型1/2b，4b，3b)和譜系II(血清型1/2a，1/2c，3a)。FONNESBECH VOGEL等[12]人指出，AFLP技術能夠區(qū)分LM和其他李斯特菌種，并對96株LM進行了分型，主要分為2個簇，相似度為82%。其中，I簇包括32種AFLP類型，II簇包括13種AFLP類型，其余為其他李斯特菌種和反硝化菌株。AFLP技術不僅具有重復性好、靈敏度高、分辨率高、DNA用量少等優(yōu)勢，還可以揭示菌株之間的進化關系，適于基因組同源性高的生物群的研究，但由于引物需要同位素標記，對樣品DNA質量要求嚴格、制備和進行凝膠電泳所需時間長以及對帶型的解釋和分析帶有主觀性而受到一定的限制。

1.4 限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragment length polymorphism，RFLP） RFLP是一種利用限制性內切酶特異性識別雙鏈DNA的某一段序列，并在特定位置進行DNA雙鏈切割，進而產(chǎn)生長度大小不等的限制性片段，經(jīng)電泳、轉膜后，比較DNA多態(tài)性的基因分型技術[13]。RIP等[14]人針對LM設計了一種基于hly基因的PCR-RFLP新方法，該方法可將LM區(qū)分為三個譜系組：譜系Ⅰ（血清型1/2b，3b，4b，4d，4e和7）、譜系Ⅱ（血清型1/2a，1/2c，3a和3c）和譜系III（血清型4a和4c），并用其他方法驗證了PCR-RFLP方法的有效性和可靠性，認為該法可作為LM血清型譜系組分類的一種替代方法。RFLP技術操作簡單、無需探針標記、實驗設備比較普及、成本低、不依賴自動化設備，但通量低、部分結果不容易判斷，適于硬性條件不好的實驗室進行低通量的分子檢測。

1.5 多位點串聯(lián)重復序列分型(multilocus variable number of tandem repeat analysis，MLVA) MLVA是通過檢測基因組中特定位點上串聯(lián)重復序列可變拷貝數(shù)之間的差異來推斷菌株間遺傳進化關系的一種分子分型技術[15]。近年來，MLVA已被廣泛應用于LM菌株分型。MARTíN等[16]采用MLVA對從肉制品和肉制品加工廠中分離的113株LM進行分型，共獲得27個不同的MLVA譜，Simpson多樣性指數(shù)為0.907，證實了MLVA是鑒別LM菌株的一種常用的、快速的、可靠的亞型分型方法。MIYA等[17]通過比較MLVA，MLST，PFGE和Ribotyping，發(fā)現(xiàn)這四種技術鑒別能力大小排序為：MLVA＞PFGE＞MLST＞Ribotyping，其中，MLVA對4b型菌株的鑒別能力最高，它可將4b型菌株分為三組(ECI，ECIa和ECII)，結果更容易解釋。MLVA只需常規(guī)的PCR和標準的瓊脂糖凝膠電泳即可完成，結果可在DNA提取后不到8h內獲得，具有簡便、快速、經(jīng)濟、高通量、重復性好、分辨率高等優(yōu)點，不僅能確定基因多態(tài)性，而且能揭示菌株群體遺傳的結構特征，可作為減輕PFGE工作量的一種有用的篩選方法。此外，該技術將檢測結果數(shù)字化，減少了在結果分析過程中的主觀因素，便于不同實驗室間結果的比較[18]。

1.6 隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD) RAPD又稱任意引物PCR，是由WILLIAMS和WELSH于1990年首次提出并發(fā)展起來的一項新的遺傳標記技術，該技術[19]是以PCR為基礎，利用隨機合成的寡核苷酸片段作為引物,在低退火溫度下擴增目的基因組DNA，經(jīng)凝膠電泳分離，分析擴增產(chǎn)物DNA片段多態(tài)性的一種分子生物技術。BYUN等[20]人為了解進口或國產(chǎn)肉類中LM的流行病學特點，利用RAPD技術對54株LM分離株進行分子流行病學研究，發(fā)現(xiàn)用三種引物組合可將LM分為40個類型，并且證實了韓國與美國牛肉分離株、韓國與丹麥豬肉分離株之間的親緣關系，上述結果表明，RAPD不僅可作為LM流行病學研究中一種有效的分型工具，還可以揭示LM菌株間的遺傳進化關系。該技術簡單、快速、靈敏、成本低、DNA用量少，結果易于解釋，但由于它采用的是隨機引物擴增并使用了較低的退火溫度，故它的穩(wěn)定性及重復性較差，可用于少量菌株的快速分型及流行病學追蹤。

2 基于測序的分型技術

2.1 多位點序列分型( multilocus sequence typing，MLST) MLST是參照法國巴斯德研究所的產(chǎn)單核細胞李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，對7個管家基因（abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，hkA）PCR擴增片段進行測序和序列比對分析，確定其序列類型（sequence type，ST）的一種方法[21]。LU等[22]人對2008～2019年從中國患者的血液、腦脊液、胎膜、胎盤等標本中分離出的144株LM進行MLST分型研究，發(fā)現(xiàn)所有菌株被分為23個ST型，ST87(49株，34.0%)最常見，其次為ST1(18株，12.5%)，ST8(10株，6.9%)，ST619(9株，6.3%)，ST7(7株，4.9%)和ST3(7株，4.9%)。ZHANG等[23]人使用MLST技術對2014～2018年中國北京從臨床感染病例中分離出的120株LM進行分型分析，所有菌株被分為25個ST型，ST8最常見，其次是ST87和ST5。CHEN等[24]人利用MLST技術對中國43個代表性城市新鮮蔬菜中分離出的30株LM進行研究，30株LM被分為9個ST型，其中ST87和ST8占優(yōu)勢。CHEN等[25]人報道從中國即食食品和巴氏殺菌乳中分離出的48株LM亦以ST87和ST8為主。綜上所述，ST87，ST8和ST5在中國食品和臨床分離菌中占優(yōu)勢，是引起中國人類李斯特菌病的主要序列型。然而，國外最常見和報道最廣泛的序列型是ST1和ST9[26]。加強上述常見ST型的長期監(jiān)測不僅有利于李斯特菌病的預防與控制，還可以揭示LM菌株的種群結構，從廣泛的地理、時間和流行病學來源推斷菌株之間的進化關系。MLST是一種成熟的、國際通用的、基于群體的菌株分化技術，該技術特異性強、分辨率高、實驗結果可在不同的實驗室間共享。與PFGE相比，MLST更具鑒別力，能夠進一步區(qū)分PFGE無法區(qū)分的類型，被廣泛應用于LM的流行病學調查和暴發(fā)期間特異性菌株的來源追蹤。

2.2 多毒力位點序列分型(multi-virulence-locus sequence typing，MVLST) MVLST是一種基于MLST用進化較快的毒力和毒力相關基因（prfA，inlB，inlC，dal，clpP和lisR）代替管家基因對病原微生物進行分型的一種新技術。ZHANG等[27]人利用LM的3個毒力基因(prfA，inlB，inlC)和3個毒力相關基因(dal，lisR，clpP)對28株LM進行MVLST分析，發(fā)現(xiàn)與MLST相比，MVLST對血清型1/2a和4b的鑒別力更高。ZHANG等[28]人利用MVLST技術對從中國食品中分離出的73株LM進行分析，共確定了18個毒力型，31.5%的分離株屬于流行克隆，包括ECI，ECIV，ECV，ECVI，ECVIII和ECXI，其中以ECV為主。KIM等[29]人對2002～2014年從美國奶牛場中分離出的121株LM進行MVLST分析，共鑒定出59個毒力型，25%的分離株被確定為流行克隆。LM在國內外廣泛流行，相關部門應加強對食品衛(wèi)生的管理與監(jiān)督，盡量避免人類因食用受污染的食物而感染LM。MVLST鑒別能力高，分型能力強，適用于當?shù)囟玖投玖ο嚓P基因進化更快的菌株的流行病學研究。

2.3 全基因組測序（whole genome sequencing，WGS） WGS是在基因水平上對病原菌進行測序并分析其遺傳信息的一種新興技術。WGS作為一種流行病學工具不僅可以識別高度相關的LM，而且還可以用來檢測與高毒力或特定致病模式相關的毒力島的存在，在了解LM的遺傳變異、地理起源、進化狀況、未來監(jiān)測方向、風險評估以及追蹤溯源等方面發(fā)揮了重要作用，越來越多地被應用于疫情的檢測和調查。GUIDI等[30]人使用WGS方法對屠宰場中分離出的122株LM進行研究，共檢出5個CCs: CC1-ST1(21.3%)，CC6-ST6(22.9%)，CC9-ST9(44.2%)，CC121-ST121(10.6%)和CC193-ST193(0.8%)，其中，CC9和CC121被定義為低毒性克隆，CC1和CC6被定義為高毒性克隆，并發(fā)現(xiàn)高毒性克隆CC1和CC6屠宰場中存在的時間更長，這些發(fā)現(xiàn)表明，高毒性LM克隆存在嚴重的食品污染風險，與人類李斯特菌病相關。LI等[31]人應用WGS技術對中國11個省份2013～2019年收集的360株LM臨床分離株進行遺傳多樣性分析，共檢出25個CCs，其中CC87，CC8和CC5是引起人類李斯特菌病的常見克隆復合體，此外，他們還發(fā)現(xiàn)所有臨床分離株LIPI-1，LIPI-3和LIPI-4均為陽性，且LIPI-4陽性菌株中的CC87，ST619，ST382，CC4和CC2已被證明具有高毒力。YIN等[32]人利用WGS分析中國侵襲性李斯特菌病病例中LM分離株的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)ST87在中國占優(yōu)勢，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示從臨床病例和零售食品中分離出的ST87親緣關系十分密切，這說明人類感染李斯特菌很有可能是由食品傳播給人類的，因此，我們應多關注ST87的毒力因素及致病機理，為李斯特菌病的控制和預防打下堅實基礎。WGS具有高度鑒別力，對LM流行菌株的檢測和分析更加準確，現(xiàn)已成為LM分子分型的新的金標準。盡管WGS在疫情調查中具有優(yōu)勢，但由于基礎設施和資源的不足，對許多國家來說，WGS的廣泛應用仍然具有挑戰(zhàn)性。

3 分子血清分型

除以上兩大類分子分型技術外，分子血清分型( molecular serotyping)也是一種經(jīng)典的區(qū)分LM的方法。分子血清分型[34]是利用多重PCR擴增LM血清型目標基因lmo0737，lmo1118，ORF2819，ORF2110和prs，從而對LM進行血清型分型的一種技術。目前，LM已鑒定出14種血清型，其中1/2a，1/2b和4b型與96%以上的人類李斯特菌病有關，1/2a在食物中常見，4b在臨床分離株中常見[33]。SHEN等[35]人利用分子血清分型技術對中國2018～2020年食品中檢測出的81株LM進行分析，研究發(fā)現(xiàn)1/2a占優(yōu)勢，分離物以豬肉為主，這與世界范圍內之前所報道的一致。VALLEJO等[36]人利用分子血清分型技術對西班牙北部某地區(qū)2010～2020年從臨床樣本中分離出的111株LM進行研究，結果顯示4b在臨床感染病例中最常見(53.2%，59株)，其次是1/2b(27%，30株)，1/2a(18.9%，21株)和1/2c(1株)，該數(shù)據(jù)更加印證了4b在臨床分離株中常見這一結論。分子血清分型是最常用和使用最廣泛的分型技術，該技術簡單、快速、重復性較好，特別適合于疫情暴發(fā)時的快速檢測和李斯特菌病的長期監(jiān)測。

4 總結與展望

產(chǎn)單核細胞李斯特菌(LM)作為一種食源性致病菌，嚴重威脅人類的生命健康。分子分型技術作為食源性疾病流行病學調查的重要工具必不可少，上述分型技術各有利弊，在實際應用中，可根據(jù)實驗室條件及研究需求選擇一種或聯(lián)合使用多種分型技術。理想的分型技術應該具有快速、準確、靈敏度強、特異度高、重復性好的特點，WGS對LM遺傳相似的分離株的區(qū)分度更高，已成為LM分子分型的新的金標準，未來隨著測序成本的下降，WGS有可能取代其它分型技術成為細菌分子分型的有力工具，為細菌的致病性、耐藥機制、流行病學監(jiān)測提供有效依據(jù)。