馬勃油膏對兔大腸桿菌感染性創(chuàng)面NLRP3/Caspase-1炎癥通路及炎癥因子表達的影響*

楊愛龍，韓雪，于波，闞成國，喻少雷

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

中醫(yī)學認為創(chuàng)面愈合是一個“正邪相爭，腐去肌生，煨膿長肉”的過程[1-2]。近年來諸多學者在研究應用外用中藥促進創(chuàng)面愈合方面作了許多工作，尤其是在感染性創(chuàng)面愈合方面進行了大量研究。中醫(yī)藥在促進創(chuàng)面愈合方面療效確切[3-4]。創(chuàng)面感染常見致病菌主要為金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，其中大腸桿菌感染多與腹腔消化道相關，研究相對較少，但其對肛腸疾病術后創(chuàng)面的愈合意義重大[5]。馬勃屬真菌類中藥，最早載于《名醫(yī)別錄》。馬勃味辛，性平，具有清肺利咽、止血等功效，外用治療創(chuàng)傷出血、惡瘡效果較佳。研究證實，馬勃藥材對于大腸桿菌具有明確的抑制作用[6]。馬勃具有明顯的抗炎、抑菌、止血、抗氧化、促進創(chuàng)面愈合等藥理活性[7]，臨床常用于壓瘡、褥瘡、凍瘡、糖尿病壞疽等難治性創(chuàng)面的修復[8]?；诖耍邶埥嗅t(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院將其制成油膏劑，用于肛腸病術后感染性創(chuàng)面的外敷治療，效果顯著。為進一步驗證其療效并探討其抗炎、抑菌的作用機制，故本實驗基于NLRP3/Caspase-1炎癥通路探討馬勃油膏對兔大腸桿菌感染性創(chuàng)面愈合情況及炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 馬勃藥材（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：2020142），由王爽主任藥師鑒定藥材為正品；紫草生肌搽劑（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院院內制劑，批準文號：黑藥制字Z20110185）。IL-1β ELISA檢測試劑盒（批號：WL210530）、TNF-α ELISA檢測試劑盒（批號：WL201104）、HE染色試劑盒（批號：WL200428）均購自沈陽萬類生物科技有限公司；組織裂解液（批號：202004311）、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（批號：20210307）均購自上海翌圣生物科技股份有限公司；BCA總蛋白定量測定試劑盒（批號：20200972）購自南京建成生物工程研究所；兔抗NLRP3 抗體（批號：ab205084）、兔抗Caspase-1抗體（批號：ab205316）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：ab210372）均購自英國Abcam公司。

1.2 實驗儀器 XDW-6J型中藥超微粉碎機（濟南達微機械有限公司）；BKQ-Z501型高壓蒸汽滅菌器（山東博科消毒設備有限公司）；Labtrip RZ-40型離心機（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；Stuart SHM2型組織勻漿器（英國Bibby-Stuart公司）；DH36001型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司）；BX53型顯微鏡（日本OLUMPUS公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；Multiskan FC型其酶標儀（美國BIOTEK公司）；SDS-PAGE凝膠電泳儀（美國Bio-rad公司）；NW10LVF型超純水系統(tǒng)（香港healforce公司）。

1.3 實驗動物 新西蘭大白兔24只，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2018-003，實驗動物生產許可證號：SCXK-（黑）2019-0011。6個月齡，雌雄各半，體質量為（2.50±0.25）kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)條件：單籠喂養(yǎng)，溫度為18～22 ℃，濕度為40%～70%，每12 h晝夜交替循環(huán)，自由飲水、攝食。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批通過，倫理批號：20170514-23。

1.4 馬勃油膏的制備 取馬勃藥材適量，以中藥超微粉碎機粉碎成約為300目的馬勃超微粉，將凡士林隔水加熱融化后倒入無菌空玻璃瓶中，在60 ℃加熱狀態(tài)下，少量多次加入馬勃超微粉，并用攪拌匙充分攪拌，至全部藥粉與凡士林油充分融合，即得馬勃油膏（馬勃超微粉與凡士林的質量比為1∶5），熱壓滅菌（115 ℃，67 kPA）30 min后進行后續(xù)研究。

1.5 感染性創(chuàng)面模型制備與分組 將24只兔隨機分為空白對照組、模型組、馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組，每組6只。大各組給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剃凈兔背部毛，面積大約20 cm×15 cm，碘伏常規(guī)消毒，在距兔脊柱旁開2 cm處，用直徑1.5 cm打孔器切割圓形創(chuàng)面3個，深達皮下深筋膜，傷口厚度約0.3 cm，壓迫充分止血?？瞻讓φ战M創(chuàng)面涂1 mL生理鹽水，其余3組在創(chuàng)面涂配制好的大腸桿菌PBS溶液（1×109CFU/mL）1 mL，以凡士林敷料、膠帶固定預防創(chuàng)面干燥，實驗動物自由飲水、攝食，48 h后去除覆蓋物，觀察見瘡緣周圍紅腫，表面膿苔附著，紅外線測溫儀測試局部溫度明顯升高，則為造模成功[9]。

1.6 給藥方法 各組兔自造模成功后第2天開始用藥，馬勃油膏組兔每日換藥時先用生理鹽水清洗創(chuàng)面，再以馬勃油膏1 mL外敷，用敷料包扎固定，每日換藥1次；紫草生肌搽劑組兔每日先用生理鹽水清洗創(chuàng)面，再以浸潤紫草生肌搽劑的紗條1塊外敷，用相同敷料包扎固定，每日換藥1次；空白對照組和模型組兔每日僅用生理鹽水清洗創(chuàng)面1次，用相同敷料包扎固定，每日換藥1次。連續(xù)給藥14 d。

1.7 觀察指標

1.7.1 創(chuàng)面形態(tài) 每日換藥時觀察兔的創(chuàng)面大小、顏色、有無滲出、有無紅腫及結痂、出血情況。

1.7.2 創(chuàng)面愈合率 分別于造模后第3、7、14天使用滌綸投影膜描出創(chuàng)面形態(tài)并裁剪創(chuàng)面紙，創(chuàng)面紙用電子分析天平稱量，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=[（原始創(chuàng)面紙片質量-愈合創(chuàng)面紙片質量）/原始創(chuàng)面紙片質量]×100%。

1.7.3 創(chuàng)面組織病理變化 于造模后第3、7、14天分別切取兔創(chuàng)面組織，經(jīng)包埋切片、脫蠟至水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水返藍、伊紅染色、梯度酒精脫水、透明、封片等步驟處理后，置顯微鏡下觀察各組兔創(chuàng)面組織的病理形態(tài)變化。

1.7.4 創(chuàng)面組織中的白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量 造模后第3、7、14天，在1%利多卡因局部麻醉后，在無菌條件下沿兔每個創(chuàng)面外緣約0.1 cm處切下少量創(chuàng)面組織，精密稱量后剪碎，放入5 mL小燒杯內，加入預冷的0.9%氯化鈉溶液適量，以組織勻漿器勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上層勻漿液，采用ELISA法測定創(chuàng)面組織勻漿液中IL-1β、TNF-α含量，參照ELISA試劑盒說明書嚴格操作。

1.7.5 創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達 采用Western blotting檢測創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達。造模后第3、7、14天分別切取兔創(chuàng)面組織，以PBS溶液清洗干凈，剪碎，加入足量新鮮配制的組織裂解液，4 ℃下勻漿30 min使組織充分裂解，4 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕法轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗滌1次×10 min，滴加稀釋的NLRP3、Caspase-1一抗（1∶500），4 ℃過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，滴加HRP標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，ECL顯色、曝光、定影，采用Image J凝膠成像分析軟件分析膠片，以NLRP3、Caspase-1蛋白與內參GAPDH的光密度比值表示蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，以“均數(shù)±標準差”（±s）表多組比較，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。重復測量計量資料采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 創(chuàng)面觀察 各組兔的精神狀態(tài)尚可、進食情況正常、無死亡。空白對照組兔創(chuàng)面紅腫較輕，隨時間消退最快，滲血、滲液較少，肉芽組織生長旺盛，創(chuàng)面結痂、愈合速度最快；模型組兔創(chuàng)面紅腫明顯，隨時間消退緩慢，滲血、滲液較多，后期可見明顯化膿，肉芽組織生長緩慢，創(chuàng)面未見結痂，愈合速度最慢；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面紅腫較輕，隨時間消退較快，滲血、滲液較少，未見化膿，肉芽組織生長旺盛，創(chuàng)面結痂、愈合的速度較快。（見表1）

表1 各組兔創(chuàng)面的一般情況

2.2 各組兔創(chuàng)面愈合率比較 所有兔創(chuàng)面愈合率在不同時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，4組均如此；4組兔創(chuàng)面愈合率均呈逐漸升高趨勢（P＜0.05）。4組兔創(chuàng)面愈合率總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在分組效應；在第3、7、14天，模型組、馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面愈合率均明顯低于空白對照組（P＜0.05）；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面愈合率均明顯高于模型組（P＜0.05）；馬勃油膏組兔創(chuàng)面愈合率與紫草生肌搽劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。時間因素與分組因素存在交互效應（P＜0.05），各組兔的創(chuàng)面愈合率均隨時間延長呈現(xiàn)增高趨勢。（見表2、圖1）

表2 各組兔創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

表2 各組兔創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

注：F時間主效應=10.387，P時間主效應=0.000；F分組主效應=225.176，P分組主效應=0.000；F交互效應=106.547，P交互效應=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

圖1 創(chuàng)面愈合率交互效應輪廓圖

2.3 各組兔創(chuàng)面組織病理學突發(fā)情況 HE染色結果顯示：造模后第3天，空白對照組可見新生表皮及少量肉芽組織生長，皮下組織炎癥細胞浸潤較少；其余各組皮下組織均可見大量炎癥細胞浸潤，新生表皮及肉芽組織均不明顯。造模后第7天，空白對照組可見創(chuàng)面新生表皮增厚及少量增生，皮下炎癥細胞浸潤較之前減少，創(chuàng)面內可見大量新生肉芽組織、纖維細胞及小血管規(guī)則排列；模型組皮下組織仍可見大量炎癥細胞浸潤，少量肉芽組織生成并伴小膿腫；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組均可見表皮增厚及增生，皮下炎癥細胞明顯減少，肉芽組織及毛細血管生長明顯，創(chuàng)面表面可見少量炎性滲出物。造模后第14天，空白對照組表皮基本接近正常上皮，皮下纖維細胞及小血管排列整齊；模型組皮下炎癥細胞增多，表皮膿腫及滲出較之前更明顯；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組創(chuàng)面新生表皮較正常稍厚，皮下炎癥細胞較少見，粗大纖維細胞增多?？梢?，隨著時間的延長，模型組創(chuàng)面的炎癥細胞浸潤程度逐漸嚴重，其余各組均明顯減輕。（見圖2）

圖2 各組兔創(chuàng)面組織HE 染色圖（200×）

2.4 各組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量比較 所有兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量在不同時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，4組均如此；模型組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量呈逐漸升高趨勢（P＜0.05），其余3組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量呈先升高再降低趨勢（P＜0.05）。4組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在分組效應；在第3、7、14天，模型組、馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量均明顯低于模型組（P＜0.05）；馬勃油膏組兔創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量與紫草生肌搽劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。時間因素與分組因素存在交互效應（P＜0.05）。（見表3～4、圖3～4）

圖3 創(chuàng)面組織中IL-1β 含量交互效應輪廓圖

表3 各組兔創(chuàng)面組織中IL-1β 含量的比較（±s，ng/L）

表3 各組兔創(chuàng)面組織中IL-1β 含量的比較（±s，ng/L）

注：F時間主效應=44.083，P時間主效應=0.000；F分組主效應=365.407，P分組主效應=0.000；F交互效應=267.152，P交互效應=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

表4 各組兔創(chuàng)面組織中TNF-α 含量的比較（±s，ng/L）

表4 各組兔創(chuàng)面組織中TNF-α 含量的比較（±s，ng/L）

注：F時間主效應=23.076，P時間主效應=0.000；F分組主效應=189.722，P分組主效應=0.000；F交互效應=125.301，P交互效應=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

圖4 創(chuàng)面組織中TNF-α 含量交互效應輪廓圖

2.5 各組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達比較 所有兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達在不同時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，4組均如此；模型組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達呈逐漸升高趨勢（P＜0.05），其余3組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達呈逐漸降低趨勢（P＜0.05）。4組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在分組效應；在第3、7、14天，模型組、馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；馬勃油膏組和紫草生肌搽劑組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達均明顯低于模型組（P＜0.05）；馬勃油膏組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達與紫草生肌搽劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。時間因素與分組因素存在交互效應（P＜0.05）。（見表5～6、圖5～7）

圖5 各組兔創(chuàng)面組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達Western blotting圖

表5 各組兔創(chuàng)面組織中NLRP3 蛋白表達比較（±s）

表5 各組兔創(chuàng)面組織中NLRP3 蛋白表達比較（±s）

注：F時間主效應=32.405，P時間主效應=0.000；F分組主效應=283.152，P分組主效應=0.000；F交互效應=185.076，P交互效應=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

圖6 創(chuàng)面組織中NLRP3 蛋白表達交互效應輪廓圖

表6 各組創(chuàng)面組織中Caspase-1 蛋白表達比較（±s）

表6 各組創(chuàng)面組織中Caspase-1 蛋白表達比較（±s）

注：F時間主效應=37.102，P時間主效應=0.000；F分組主效應=266.052，P分組主效應=0.000；F交互效應=153.471，P交互效應=0.000；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與第3天比較，cP＜0.05；與第7天比較，dP＜0.05

圖7 創(chuàng)面組織中Caspase-1 蛋白表達交互效應輪廓圖

3 討 論

肛門直腸疾病在臨床上多以手術為主要治療方式，切口一般為開放性創(chuàng)面，加之術后腸道菌群的失衡及糞便刺激，易導致創(chuàng)面切口發(fā)展為慢性感染創(chuàng)面，影響創(chuàng)面的愈合[10]。在肛腸術后創(chuàng)面愈合的過程中，最為常見的細菌感染是大腸桿菌感染，由其引發(fā)的創(chuàng)面炎癥反應會進一步加劇創(chuàng)面感染，導致切口愈合緩慢[11]。針對感染性創(chuàng)面，徹底清潔創(chuàng)面、及時給予藥物治療干預、有效抗感染，避免細菌對傷口的進一步破壞對于促進創(chuàng)面早日愈合尤為關鍵[12-13]。近年來，中藥外用在促進感染性創(chuàng)面愈合方面越來越體現(xiàn)出其價值和優(yōu)勢[14-15]。

中醫(yī)學認為，感染性創(chuàng)面多為外感邪毒入里化熱，熱盛肉腐成膿而來，正如《靈樞·癰疽》所云：“營氣稽留于經(jīng)脈之中，則血泣而不行，不行則衛(wèi)氣從之而不通，壅遏而不得行，故熱。大熱不止，熱勝則腐肉，肉腐則為膿”。故治療應以外治祛毒為主，兼以內治調理正氣。馬勃屬于真菌類中藥，具有清肺利咽、止血療瘡等功效。《中華人民共和國藥典》中記載馬勃為治療創(chuàng)傷的直接外用中藥之一[16]。馬勃用于治療惡瘡的記載最早見于《名醫(yī)別錄》：“味辛，平，無毒。主惡瘡、馬疥。”[17]《本草從新》謂之：“外用敷諸瘡、良。”[18]馬勃已逐漸成為臨床治療各種外傷出血、鼻衄、咽喉腫痛、惡瘡、潰瘍的常用藥物。臨床實踐證實，馬勃在壓瘡、臁瘡、凍瘡的治療中，治愈率均在90%以上[7,19-20]。其在創(chuàng)傷愈合方面的應用研究愈來愈受到重視。然而，馬勃作為直接外用治療創(chuàng)面的天然藥物，其在肛腸科術后創(chuàng)面愈合中的作用研究較為少見，尤其是對大腸桿菌引起的感染性創(chuàng)面的修復作用及其作用機理研究?；诖耍狙芯繑M制備兔大腸桿菌感染性創(chuàng)面模型，以馬勃油膏進行干預，探討馬勃油膏治療大腸桿菌感染性創(chuàng)面的效果，并基于NLRP3/Caspase-1炎癥通路進一步探索其可能的作用機制。

炎癥反應是感染性創(chuàng)面的形成與發(fā)展過程中最為重要的病理環(huán)節(jié)[21]。NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是一種重要的細胞內多蛋白復合體，由NLRP3、凋亡相關顆粒樣蛋白（ASC）及半胱氨酸蛋白水解酶前體（pro-Caspase-1）等共同構成[22-23]。在創(chuàng)面的持續(xù)感染下，NLRP3炎癥小體可被激活，并促進Caspase-1及下游IL-1β、TNF-α等促炎性細胞因子的釋放，激發(fā)機體的免疫炎癥反應，造成炎癥損傷的進一步擴大，導致創(chuàng)面久不愈合[24-25]。以NLRP3炎性小體為治療靶點，靶向干預NLRP3、Caspase-1蛋白及其下游炎癥信號因子的生成、釋放，抑制其活性及過度表達，以調控炎癥反應，有望成為感染性創(chuàng)面損傷修復的新策略[26-27]。

本實驗選取兔作為研究對象，以創(chuàng)面組織中的NLRP3、Caspase-1蛋白表達及創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α含量作為評價兔大腸桿菌感染性創(chuàng)面炎癥程度的指標。每只兔身上取3個創(chuàng)面，可以保證實驗不受單個因素免疫力的影響，減少實驗結果偏倚。模型組兔造模后創(chuàng)面組織中的IL-1β、TNF-α含量及NLRP3、Caspase-1蛋白表達均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；給予馬勃油膏干預后，馬勃油膏組兔創(chuàng)面組織中的IL-1β、TNF-α含量及NLRP3、Caspase-1蛋白表達均明顯低于模型組（P＜0.05），且創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05）。表明馬勃油膏能促進兔大腸桿菌感染性創(chuàng)面愈合，作用機制可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1炎癥通路激活以降低創(chuàng)面炎癥因子表達。然而，創(chuàng)面愈合是一個復雜的多因素共同促進的結果，創(chuàng)面組織毛細血管的重建、機體的免疫系統(tǒng)情況等因素均可能影響馬勃油膏促進創(chuàng)面愈合的效果。未來關于馬勃油膏是否通過促進血管生成及增強機體免疫力來影響創(chuàng)面愈合，還需進一步的研究。