基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除約氏瘧原單克隆蟲株的構(gòu)建

曹玉潔，張玲紅，苗昱辰，盧 里，李春草，張 璐，胡 瑞，李江艷，夏 惠，陶志勇，方 強(qiáng),

瘧疾是危害嚴(yán)重的寄生蟲病。據(jù)2021年世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)[1]顯示，2020年全球瘧疾病例2.41億，較2019年增加1 400萬(wàn)。盡管我國(guó)自2017年起已無本土瘧疾病例報(bào)告，且WHO于2021年6月正式宣布中國(guó)消除瘧疾[2]，但輸入性瘧疾及瘧疾再傳播形勢(shì)依然嚴(yán)峻[3]。傳染病最理想的控制手段是有效的疫苗。盡管瘧疾疫苗近年來已取得重大進(jìn)展，首個(gè)瘧疾疫苗獲批上市，在撒哈拉以南非洲地區(qū)和中度至高度惡性瘧原蟲傳播風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的兒童中使用[4]，但其保護(hù)率仍不理想，約30%[5]。瘧疾疫苗研發(fā)仍亟需加強(qiáng)。瘧原蟲的致病僅由紅內(nèi)期瘧原蟲引起，紅外期瘧原蟲并不致病，因而紅外期是預(yù)防性疫苗研制的理想階段。瘧原蟲減毒子孢子可誘發(fā)高效的保護(hù)性免疫[6]，但通過物理化學(xué)方法制備減毒子孢子不易進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，遺傳減毒子孢子疫苗是較為理想的瘧疾預(yù)防性疫苗策略[7-8]，即針對(duì)瘧原蟲紅外期特異性關(guān)鍵發(fā)育基因進(jìn)行敲除，制備遺傳性狀穩(wěn)定的減毒子孢子，子孢子感染宿主后，瘧原蟲發(fā)育停滯于紅外期，可誘發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫。瘧原蟲紅外期特異性關(guān)鍵發(fā)育基因敲除是制備遺傳減毒子孢子疫苗的關(guān)鍵。由于瘧原蟲基因敲除較困難，故遺傳減毒子孢子疫苗發(fā)展較為緩慢。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)在瘧原蟲領(lǐng)域的應(yīng)用[9-10]，遺傳減毒子孢子疫苗迎來新的發(fā)展機(jī)遇。近年來，部分僅在紅外期瘧原蟲表達(dá)的發(fā)育關(guān)鍵基因如UIS[11-13]、P36[14]、P52[15]、SAP1[16-17]、Plasmei2[18]、Lisp2[19]等陸續(xù)被鑒定，并被應(yīng)用于瘧疾減毒子孢子疫苗研究。

有研究[20]發(fā)現(xiàn)瘧原蟲特異的頂質(zhì)體蛋白(plasmodium-specific apicoplast protein plays an important role for liver merozoite formation，PALM)在伯氏瘧原蟲紅外期裂殖子形成中起重要作用，其他瘧原蟲是否具備此特征，尚不清楚。約氏瘧原蟲是一種瘧疾研究中常用鼠瘧原蟲，目前認(rèn)為利用其建立的鼠瘧模型的免疫特征與人類更加接近，是研究瘧疾疫苗的更加理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。構(gòu)建PALM基因敲除約氏瘧原蟲蟲株是了解PALM在約氏瘧原蟲紅外期裂殖子形成中是否也具有重要作用，進(jìn)而利用約氏瘧原蟲小鼠模型深入研究瘧原蟲減毒子孢子疫苗的必要前提。因此，本研究擬采用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建PALM基因敲除的約氏瘧原蟲株，以期為進(jìn)一步研究PALM基因功能及基于PALM的遺傳減毒子孢子疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 瘧原蟲株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XNL)蟲株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)曹雅明教授饋贈(zèng)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室小鼠傳代保種。雌性昆明小鼠(5～6周齡)，SPF級(jí)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證編號(hào)：SCXK(湘)2019-0004]。

1.1.2 主要試劑 T4連接酶，Golden Gate Enzyme Mix,限制性內(nèi)切酶BsaI、BsmBI購(gòu)自NEB公司，高保真PCR酶Gflex購(gòu)自日本Takara公司；電轉(zhuǎn)試劑盒P3購(gòu)自瑞士Lonza公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及血液基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；乙胺嘧啶購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞 DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司，質(zhì)粒 pYCm 為廈門大學(xué)袁晶教授惠贈(zèng)，質(zhì)粒上含乙胺嘧啶和5-氟胞嘧啶抗性基因。本實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，改建為帶有Golden Gate克隆功能和藍(lán)白斑篩選功能的pYCm-golden-blue質(zhì)粒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA與引物設(shè)計(jì) 從瘧原蟲Plasmo DB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載P.yoelii17XNL PALM基因序列，確定敲除區(qū)域以及進(jìn)行同源重組修復(fù)的左、右同源臂長(zhǎng)度。應(yīng)用專用網(wǎng)站(http：//crispr.tefor.net/)設(shè)計(jì)sgRNA， 用NEB Golden Gate 組裝設(shè)計(jì)軟件(https：//goldengate.neb.com/)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增左、右同源臂的上下游引物。

1.2.2 PALM 敲除CRISPR工具質(zhì)粒的構(gòu)建 從P.yoelii17XNL野生型(wild type,WT)基因組中擴(kuò)增PALM左、右同源臂,PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s;55 ℃ 15 s;68 ℃ 20 s;共30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。BsaI酶切pYCm-golden-blue質(zhì)粒，切膠純化PCR產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物；根據(jù)NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2)說明書，用推薦的摩爾比來計(jì)算連接反應(yīng)所需要的DNA量，配置連接反應(yīng)體系。接下來將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將根據(jù)P.yoeliiPALM基因區(qū)域設(shè)計(jì)的sgRNA 退火形成雙鏈。BsmBI酶切pYCm-golden-blue-PALM-LHA-RHA質(zhì)粒，切膠純化載體酶切產(chǎn)物，T4連接酶將退火成雙鏈后的sgRNA與切膠純化產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落，菌液PCR初步驗(yàn)證，測(cè)序確定，最終確保CRISPR工具質(zhì)粒構(gòu)建完成。CRISPR 工具質(zhì)?；蚓庉媹D解及引物設(shè)計(jì)見圖1。所需PCR引物見表1(下劃線部分為BsaI酶識(shí)別點(diǎn))，以上引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3 濃集瘧原蟲和電擊轉(zhuǎn)染 注射1×107個(gè)感染P.yoelii17XNL的紅細(xì)胞至昆明小鼠體內(nèi)，裂殖體密度達(dá)50%時(shí)將小鼠取血到肝素抗凝管中，加入3 mL RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司)，混勻，室溫2 500 r/min離心5 min，棄上清，用1640重懸沉淀；室溫3 100 r/min離心20 min，小心吸取中間層(為濃集后含裂殖子的紅細(xì)胞)加到提前備好的3 mL 50%percoll上；棄上清，沉淀同樣用1640培養(yǎng)基混勻；室溫2 500 r/min離心5 min，棄除上清，沉淀即為濃集后的瘧原蟲所得。將工具質(zhì)粒、裂殖體與電轉(zhuǎn)液混合加入電轉(zhuǎn)杯，使用Lonza Nucleofector電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)后尾靜脈注射昆明小鼠體內(nèi)。次日查血，待鏡檢出現(xiàn)有瘧原蟲出現(xiàn)后每天給予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水，隔天鼠尾采血鏡檢查瘧原蟲，至給藥后第8天取鼠血進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。

1.2.4 有限稀釋法獲得單克隆蟲株 取PCR鑒定基因敲除成功的含蟲鼠血接種至新一只昆明小鼠，待原蟲血癥達(dá)0.2%～1.0%，用0.9%氯化鈉溶液稀釋感染瘧原蟲的紅細(xì)胞至0.7個(gè) iRBC/200 μL，然后尾靜脈注射至12只小鼠體內(nèi)，每只200 μL，進(jìn)行克隆化。鼠尾靜脈注射后第8天，血涂片鏡檢小鼠感染情況，待原蟲生長(zhǎng)至0.2%～1.0%可提基因組DNA采用PALM基因外側(cè)基因組特異性引物P1/P3進(jìn)行PCR鑒定是否獲得陽(yáng)性克隆蟲株。

1.2.5 PALM基因敲除單克隆株生長(zhǎng)分析 將PALM基因敲除的瘧原單克隆株和P.yoelii17XNL，按1×105個(gè)iRBC/200 μL 0.9%氯化鈉溶液的接種量，分別尾靜脈注射小鼠各6只。每2天鼠尾采血，記錄并統(tǒng)計(jì)原蟲血癥。

1.3 倫理學(xué)聲明 本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號(hào)：倫動(dòng)科批字[2022]第196號(hào))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PALM敲除CRISPR工具質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增PALM 左、右游同源臂各約600 bp，片段長(zhǎng)度均符合預(yù)期(見圖2)，將左右游同源臂、sgRNA分步與pYCm-golden-blue質(zhì)粒連接構(gòu)建PALM 敲除CRISPR工具質(zhì)粒。對(duì)PALM 敲除CRISPR工具質(zhì)粒的sgRNA部分測(cè)序(見圖3)，其序列與設(shè)計(jì)序列一致，PALM敲除CRISPR工具質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 電擊轉(zhuǎn)染結(jié)果與基因敲除瘧原蟲的鑒定 PALM敲除CRISPR工具質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)染后感染瘧原蟲的紅細(xì)胞接種7只小鼠，24 h后鏡檢均見瘧原蟲。喂藥篩選后，鏡檢見給藥后2 d原蟲密度最高，后逐漸降低，至6 d降至最低，且僅5只小鼠鏡檢瘧原蟲陽(yáng)性。給藥后第8天，僅2只小鼠鏡檢見瘧原蟲，但原蟲密度顯著回升，7.5%～9.0%(見圖4)；取鏡檢瘧原蟲陽(yáng)性小鼠血，以PALM基因外側(cè)基因組特異性引物P1/P3進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后，在1 246 bp處可見條帶(見圖5A)，用PALM基因內(nèi)部引物P2/P4 PCR擴(kuò)增未見條帶(見圖5B)，而野生株則分別擴(kuò)增出于預(yù)期相符的約2 200 bp和720 bp條帶，提示成功獲得P.yoelii17XNL PALM 敲除瘧原蟲。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，相較于P.yoelii17XNL 標(biāo)準(zhǔn)序列(PY17X_0102700)送測(cè)序列的PALM(954 bp) 完全缺失，進(jìn)一步證實(shí)P.yoelii17XNL PALM基因成功敲除(見圖6)。

2.3 PALM基因敲除瘧原蟲的單克隆鑒定 將含有PALM基因成功敲除瘧原蟲的鼠血采用有限稀釋法接種小鼠進(jìn)行單克隆篩選后第8天，采血鏡檢見12只小鼠中7只瘧原蟲陽(yáng)性。用P1/P3引物對(duì)全部12只小鼠進(jìn)行PCR鑒定，自7只小鼠血液中擴(kuò)增出瘧原蟲陽(yáng)性條帶， 其中2只擴(kuò)增出單一的大小為1 246 bp的PALM基因缺失條帶(見圖7)， PALM基因敲除單克隆約氏瘧原蟲篩選成功。

2.4 PALM基因敲除單克隆株的生長(zhǎng)分析P.yoelii17XNL PALM基因敲除單克隆株和P.yoelii17XNL野生株分別經(jīng)尾靜脈注射感染小鼠后，每2天鼠尾取血染色鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組小鼠原蟲率均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，至觀察終點(diǎn)(感染后第10天)，P.yoelii17XNL野生株組的瘧原蟲血癥為(17.00±1.08)%；P.yoelii17XNL PALM基因敲除單克隆株組的瘧原蟲血癥為(17.42±1.39)%，2組小鼠瘧原蟲血癥差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

遺傳減毒子孢子疫苗由于其遺傳性狀的穩(wěn)定性，在制備過程中無毒力回復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)，是較為理想的減毒子孢子瘧疾疫苗策略。而紅外期特異性表達(dá)的發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定與敲除是研發(fā)遺傳減毒子孢子疫苗關(guān)鍵。PALM是近年來在伯氏瘧原蟲中鑒定出的一種定位于瘧原蟲頂生質(zhì)體，于瘧原蟲紅外期特異性表達(dá)的發(fā)育關(guān)鍵基因。盡管理論上其他瘧原蟲中PALM基因也具備此特征，但尚未有研究證實(shí)。鑒于不同瘧原蟲之間基因表達(dá)調(diào)控盡管大部分類似，但也存在著一些差異，故明晰PALM基因在其他瘧原蟲中的表達(dá)特征與功能是必要的。約氏瘧原蟲是一種實(shí)驗(yàn)室常用的鼠瘧原蟲。約氏瘧原蟲建立小鼠模型僅需10個(gè)甚至更少的子孢子，遠(yuǎn)低于伯氏瘧原蟲，這在生物學(xué)上更接近于惡性瘧原蟲的特點(diǎn)[21]；而且，約氏瘧原蟲的紅外期免疫的建立的特點(diǎn)也更接近于人類瘧原蟲的特征[18]。因而，相對(duì)于伯氏瘧原蟲鼠瘧模型，約氏瘧原蟲鼠瘧模型被認(rèn)為是研究紅外期瘧疾免疫及減毒子孢子瘧疾疫苗更加理想的模型[22-23]。因此，為了利用約氏瘧原蟲鼠瘧模型探討基于PALM基因構(gòu)建遺傳減毒子孢子疫苗的可能性，有必要構(gòu)建約氏瘧原蟲PALM基因敲除株，以進(jìn)一步探討在約氏瘧原蟲紅外期裂殖子發(fā)育中PALM的功能，基因敲除技術(shù)近年來發(fā)展迅速，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，將包括基因敲除在內(nèi)的基因編輯技術(shù)提升至一個(gè)新的高度。與傳統(tǒng)的基因編輯方式相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有更高的遺傳操作效率和可靠性[9]。2014年，CRISPR/Cas9技術(shù)被成功用于瘧原蟲編輯，包括本團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外研究者也已經(jīng)利用CRISPR/Cas9技術(shù)開展了部分工作[24-26]。由于鼠瘧原蟲尚無法體外培養(yǎng)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行鼠瘧原蟲基因編輯必須在小鼠模型體內(nèi)進(jìn)行篩選，難度遠(yuǎn)高于可體外連續(xù)培養(yǎng)的惡性瘧原蟲基因編輯，故采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)鼠瘧原蟲進(jìn)行基因編輯的研究尚不多見。國(guó)內(nèi)袁晶教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了含乙胺嘧啶和5-氟胞嘧啶抗性基因的單質(zhì)粒系統(tǒng)質(zhì)粒 pYCm，使利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)鼠瘧原蟲進(jìn)行基因編輯和篩選更加可行。我們團(tuán)隊(duì)在袁晶教授饋贈(zèng)的質(zhì)粒 pYCm基礎(chǔ)上改建獲得了pYCm-golden-blue質(zhì)粒[27]，增添了重組陽(yáng)性克隆的藍(lán)白斑篩選功能，提高了陽(yáng)性克隆的篩選效率。

本研究中，我們利用改造的 pYCm-golden-blue 質(zhì)粒基于CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行了約氏瘧原蟲P.yoelii17XNL PALM基因敲除，經(jīng)乙胺嘧啶小鼠體內(nèi)篩選后獲得了陽(yáng)性瘧原蟲，經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證表明PALM基因被成功敲除；而且，通過有限稀釋法我們獲得了單克隆化的P.yoelii17XNL PALM基因敲除蟲株。我們比較了PALM基因敲除蟲株和野生株約氏瘧原蟲感染后的小鼠瘧原蟲血癥水平，發(fā)現(xiàn)二者無顯著差異，表明PALM基因敲除對(duì)約氏瘧原蟲紅內(nèi)期生長(zhǎng)發(fā)育無重要影響，是紅內(nèi)期發(fā)育的非必須基因，這與PALM在伯氏瘧原蟲紅內(nèi)期發(fā)育中作用一致，也進(jìn)一步提示PALM基因在約氏瘧原蟲紅外期發(fā)育的作用非?？赡芤才c其在伯氏瘧原蟲紅外期的作用一致，是紅外期發(fā)育的關(guān)鍵基因。這些為后續(xù)深入研究基于PALM基因的遺傳減毒子孢子疫苗提供了基礎(chǔ)。