間充質(zhì)干細胞移植治療缺血性腦卒中基礎(chǔ)研究進展

孫楷航 巴特 王婧 郝婷 王琦 桑博默 趙曉峰

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心)

缺血性腦卒中(IS)是指因腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織缺血性壞死或軟化。由于其高發(fā)病率、患病率、死亡率和致殘率而成為造成全世界疾病負擔(dān)的重要原因之一。臨床治療主要采用急性期溶栓及腦神經(jīng)保護等措施減少腦組織功能損傷，針對組織損傷后的功能恢復(fù)缺乏理想手段。近年來，干細胞移植療法被認(rèn)為在IS治療領(lǐng)域有獨特的優(yōu)勢。干細胞具有自我更新、分化的能力，可分化為各類型組成神經(jīng)系統(tǒng)所需的細胞，在損傷腦組織局部通過替代等作用恢復(fù)受損神經(jīng)功能，發(fā)揮治療作用。干細胞種類多樣，其中間充質(zhì)干細胞(MSCs)因其具有便于獲取的廣泛來源、低免疫原性及較好的安全性備受關(guān)注。

目前，多項臨床試驗已逐步開展。然而，一些多中心大樣本臨床試驗結(jié)果顯示干細胞移植未能達到理想臨床療效〔1,2〕，可能與移植策略的選擇有關(guān)。干細胞移植過程復(fù)雜，選擇不同干細胞來源、移植途徑、移植時間、移植劑量參數(shù)均會影響移植效果，本文由臨床回歸基礎(chǔ)實驗，探討MSCs移植的療效、機制、操作參數(shù)、增效策略等方面，對近年來研究成果進行綜述，以期推動干細胞療法的臨床轉(zhuǎn)化。

1 MSCs移植的療效與機制

大量研究表明，MSCs移植在IS動物模型中療效明顯，主要依據(jù)行為學(xué)、組織學(xué)方面的改善情況進行評價〔3～6〕。在行為學(xué)方面，常采用移除黏附物能力測試評價自體感覺缺失情況、轉(zhuǎn)軸測試評價運動功能、肢體放置測試評價運動感覺完整性、平衡木行走測試評價大鼠的運動協(xié)調(diào)功能及神經(jīng)功能損傷評分評價神經(jīng)功能缺損程度等，相關(guān)實驗顯示MSCs移植后可見神經(jīng)功能改善明顯〔3,5,6〕；在組織學(xué)方面，通過磁共振成像或TTC染色觀察腦梗死體積，各項研究中MSCs治療組與模型組對比常可見梗死體積明顯縮小〔3,4〕。

MSCs移植通過多種機制改善神經(jīng)功能，減少腦神經(jīng)損傷。研究表明MSCs治療機制主要涉及幾個方面：(1)免疫調(diào)節(jié)：移植的MSCs可介導(dǎo)免疫抑制作用〔7〕，通過缺氧環(huán)境下干細胞高表達的一種抗炎因子CD200調(diào)節(jié)炎癥細胞因子和小膠質(zhì)細胞活化水平〔8〕，另通過減少小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的數(shù)量〔9〕，或誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向抑制炎癥反應(yīng)的M2型極化〔10〕，從而減輕腦卒中大鼠的神經(jīng)損傷。(2)細胞凋亡：鈣調(diào)磷酸酶是一種蘇氨酸/磷酸酶，在神經(jīng)穩(wěn)態(tài)中起重要作用，IS誘導(dǎo)鈣調(diào)磷酸酶的過度激活進而觸發(fā)凋亡信號，MSCs移植可通過降低神經(jīng)元鈣調(diào)磷酸酶表達，抑制細胞凋亡〔11〕。干細胞移植也可通過抑制炎癥減少繼發(fā)性細胞死亡〔12〕。(3)神經(jīng)元損傷：神經(jīng)元損傷可由多種機制引起，鈣超載、氧化應(yīng)激等機制在IS引起的神經(jīng)元損傷中起重要作用。移植的MSCs可通過上調(diào)主要定位于高爾基體的鈣泵SPCA1的表達減輕鈣超載〔13〕，通過上調(diào)一種抗氧化酶UBIAD1來減少線粒體功能障礙和增強抗氧化作用〔14〕，另外，MSCs通過影響損傷后蛋白清除途徑，抑制泛素-蛋白酶體途徑向自噬途徑轉(zhuǎn)化〔15〕，起到限制神經(jīng)元損傷的作用。(4)神經(jīng)營養(yǎng)：MSCs可誘導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子〔16〕、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子〔17〕等細胞因子的表達，營養(yǎng)神經(jīng)，提高梗死區(qū)神經(jīng)元存活率，促進神經(jīng)保護作用發(fā)揮。(5)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生：移植的MSCs可通過增加趨化因子、多聚唾液酸酶的表達，增加內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞遷移〔18〕，可促進內(nèi)源性少突膠質(zhì)祖細胞增殖，促進髓鞘形成〔19〕，可觸發(fā)神經(jīng)細胞形成、增強神經(jīng)元功能〔20〕，可下調(diào)抑制軸突生長、神經(jīng)元再生的抑制因子Nogo-A等〔21〕促進神經(jīng)發(fā)生。(6)分化替代：移植的MSCs可向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化〔16〕，可能替代、補充受損的神經(jīng)細胞恢復(fù)神經(jīng)功能。(7)促進血管再生：移植的MSCs可通過向微血管宿主細胞轉(zhuǎn)移功能完整的線粒體，改善大腦微血管線粒體功能，促進血管生成〔22〕，通過誘導(dǎo)血管生成〔23〕，改善腦血流循環(huán)，促進神經(jīng)組織修復(fù)。(8)血腦屏障：移植的MSCs可通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路下調(diào)內(nèi)皮細胞的細胞間黏附分子-1，減少中性粒細胞浸潤，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的上升，減少血腦屏障破壞〔24〕。(9)功能連接：移植的MSCs可通過增強胼胝體在兩側(cè)大腦運動皮層間解剖學(xué)連接，促進神經(jīng)功能恢復(fù)〔25〕。

2 MSCs移植相關(guān)參數(shù)

2.1干細胞來源 MSCs來源廣泛，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，可從多種組織中提取培養(yǎng)，根據(jù)其組織來源不同，分為骨髓源MSCs(BM-MSCs)、脂肪源MSCs(AD-MSCs)、臍帶源MSCs(UC-MSCs)、臍血源MSCs、牙髓源MSCs、牙周膜源MSCs、嗅黏膜源MSCs等，根據(jù)供體不同，又可分為自體移植MSCs、同種異體MSCs、異種MSCs。是否自體移植、干細胞來源于供體的部位及供體生理病理狀態(tài)，均可對MSCs療效產(chǎn)生影響。對于同為異體來源的干細胞，供體的種屬不論同種、異種對療效影響不大，Gutiérrez-Fernández等〔26〕研究顯示同種異體(大鼠)與異種(人)來源AD-MSCs在促進功能恢復(fù)和減少缺血性腦損傷方面表現(xiàn)出相同的效果。然而是否為自體移植則會對療效產(chǎn)生明顯影響，Yu等〔27〕研究表明，自體來源AD-MSCs與同種異體AD-MSCs相比，在體內(nèi)有更好的生存能力、遷移能力和分化潛能及有更低的凋亡率，更能促進大鼠功能恢復(fù)，減少梗死體積。干細胞來源于供體的部位也會影響其療效，Ikegame等〔28〕比較AD-MSCs與BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)AD-MSCs除獲取更簡單安全外，在分泌VEGF等細胞因子，減少腦梗死、水腫面積，減少神經(jīng)損害等方面也有明顯優(yōu)勢。Abiko等〔29〕則認(rèn)為顱骨源BM-MSCs比髂骨源BM-MSCs表達更多BDNF和神經(jīng)生長因子，并引起更好的功能恢復(fù)作用。比較成人甚至老年人牙齒中最常見的牙髓源與牙周膜源干細胞，Wu等〔30〕認(rèn)為牙周膜源MSCs更能促進神經(jīng)功能恢復(fù)，可作為臨床應(yīng)用的理想候選細胞。關(guān)于供體生理、病理狀態(tài)對移植療效的影響，供體年齡是一個影響因素，Yamaguchi等〔31〕對人MSCs的研究表明，來源于年輕供體的MSCs移植組有更好的神經(jīng)恢復(fù)和腦萎縮預(yù)防作用。然而，供體是否存在腦缺血可能不會對干細胞療效產(chǎn)生影響，Tsai等〔32〕比較來自腦缺血大鼠與正常大鼠BM-MSCs的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種來源干細胞治療效果無明顯差別。

2.2移植途徑 MSCs可經(jīng)多種途徑移植進入體內(nèi)，其中較為常見的有顱內(nèi)〔10〕、動脈〔11〕、靜脈〔25〕、鞘內(nèi)移植〔33〕，也有實驗通過鼻內(nèi)注射〔4〕給藥。由于注射方式不同，產(chǎn)生的治療效果存在差異。大部分研究表明，動脈注射方式相較于其他方式，可見更為明顯的療效，Zhang等〔34〕將BM-MSCs通過動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、腦內(nèi)(3×106、3×106、5×105)三種方式給藥，三種方式均明顯改善神經(jīng)功能，其中動脈注射組改善最迅速且最明顯，并明顯增強梗死側(cè)胼胝體區(qū)髓鞘的重建。Shim等〔35〕通過鼠頸動脈、尾靜脈注射(各2×105)經(jīng)超順磁氧化鐵標(biāo)記的MSCs，磁共振成像活體示蹤MSCs分布，結(jié)果顯示兩組干細胞均可見于梗死灶周圍，而動脈移植組在注射后早期有更多聚集。Du等〔36〕同樣以頸動脈、尾靜脈為注射途徑(各2×106)注射人BM-MSCs(hBM-MSCs)，發(fā)現(xiàn)動脈注射安全且具有更好的治療效果，可繞過肺系統(tǒng)更有效地將細胞導(dǎo)向大腦的缺血部位。治療后大鼠大腦的功能、灌注和代謝得到改善，提示經(jīng)動脈注射hBM-MSCs治療可能是治療腦卒中的合適方法。然而也有研究表明動脈注射與靜脈注射相比有可能增加腦損傷的風(fēng)險，且未能明顯改善神經(jīng)功能〔37〕。比較顱內(nèi)注射與靜脈注射方式，Noh等〔38〕研究結(jié)果表明，卒中亞急性階段或慢性階段靜脈注射人VC-MSCs(hUC-MSCs)療效甚微，顱內(nèi)注射方式則可表現(xiàn)出明顯療效。關(guān)于鞘內(nèi)注射，Lim等〔33〕對比鞘內(nèi)注射與尾靜脈注射hUC-MSCs，較高注射劑量(1×106)時兩組均顯著改善運動功能并減少了缺血性損傷，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異，而在較低劑量注射時(5×105)鞘內(nèi)注射組細胞存活并更廣泛地遷移到缺血區(qū)域，分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，顯著減少了缺血性損傷，而靜脈注射組沒有，所以可見相較于靜脈注射，鞘內(nèi)注射產(chǎn)生療效對劑量的需求更低。目前，何種途徑為既安全又有效的最適移植途徑，還需進一步實驗探索。

2.3移植時間 造模后干細胞移植時間點不同會影響干細胞分布、腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)情況。Wang等〔39〕認(rèn)為BM-MSCs在3 h、24 h移植而不是7 d時移植可顯著減少病變體積，改善運動功能。Toyoshima等〔40〕研究表明與1、6、48 h組相比，24 h組改善改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分與梗死體積效果最明顯，伴隨有干細胞存活率高、遷移能力強的特點。Nam等〔41〕實驗則表明，比較hBM-MSCs(2×106)于造模后1 h、1 d、3 d移植，超早期移植(1 h)能產(chǎn)生更明顯的神經(jīng)恢復(fù)和減少梗死體積作用。Lee等〔42〕比較1 d、4 d、7 d移植，結(jié)果表明早期MSCs移植(1 d)與更好的功能恢復(fù)相關(guān)，這可能與早期移植組MSCs優(yōu)先向皮質(zhì)遷移有關(guān)。Kawabori等〔43〕研究在1 w或4 w進行BM-MSCs顱內(nèi)立體定位移植，1 w時低劑量移植與高劑量移植均引起顯著功能恢復(fù)，而4 w時只有高劑量移植引起明顯的治療效果，表明早期移植只需要較少的干細胞即可產(chǎn)生有益的效果。Ishizaka等〔44〕于1 d、4 d、7 d頸動脈移植人MSCs，觀察干細胞分布，結(jié)果1 d組干細胞分布于梗死核心及周圍，4 d組分布于梗死灶周圍，7 d組則觀察到很少的細胞，表現(xiàn)出依賴于移植時間的細胞分布和卒中后功能恢復(fù)差異。由此可見，早期移植療效較優(yōu)，多數(shù)研究表明造模后24 h移植療效最佳，然而也存在實驗結(jié)果表明相對于24 h移植，更早移植(1 h)〔41〕或更晚移植(7 d)〔45〕可產(chǎn)生更好效果，實驗結(jié)果差異可能由于選用的干細胞來源、移植劑量等其他因素不同所致，確定最適移植時間點還需細化影響因素設(shè)計實驗來進一步研究。另外，Komatsu等〔46〕于7 d、14 d、28 d靜脈注射MSCs，雖然顯示早期(7 d)治療可更明顯的限制腦損傷體積，然而腦缺血1個月(28 d)后給予MSCs仍可發(fā)揮有益作用，可能與其促進血管生成有關(guān)，表明MSCs應(yīng)用于永久性大腦中動脈阻塞模型改善功能預(yù)后的治療時間窗至少為1個月。

2.4注射劑量及注射安全性 在一定范圍內(nèi)提高MSCs注射劑量有助于提高治療效果，但超過一定劑量則會引起相關(guān)不良反應(yīng)，影響MSCs移植安全性。以動脈注射為例，大劑量注射有可能引起細胞造成栓塞的危險。Fukuda等〔47〕比較低劑量(1×104)、高劑量(1×106)動脈注射人MSCs的有效性及安全性，結(jié)果雖然高劑量組MSCs在大鼠皮層和紋狀體中分布較廣，但血管內(nèi)細胞聚集程度和大鼠死亡率明顯較高，相比之下低劑量減少了栓塞并發(fā)癥的副作用，且足以產(chǎn)生抗炎作用并使腦卒中后功能恢復(fù)。Yavagal等〔48〕比較5×104、1×105、2×105、5×105、1×106的動脈注射劑量，通過測量與造模、注射同側(cè)的大腦中動脈上平均激光多普勒血流信號變化百分比確定最大耐受劑量，結(jié)果表明1×105時不影響大腦中動脈流量，被認(rèn)為是最大耐受劑量，且24 h而不是1 h時注射可顯著提高神經(jīng)缺損評分，降低平均梗死體積。對于靜脈注射途徑的研究，He等〔49〕分低(5×104)、中(5×105)、高(2×106)劑量組注射BM-MSCs，中、高劑量均明顯縮小了梗死體積，增大了軟腦膜血管和基底動脈的直徑，增加了大腦皮層梗死周圍區(qū)毛細血管面積，提高了梗死周圍區(qū)堿性成纖維細胞生長因子的表達及血清VEGF水平，所以結(jié)合安全性考慮可選擇其中療效相似的較小劑量5×105作為干細胞移植的適當(dāng)劑量。關(guān)于血管內(nèi)注射引起的血管阻塞，除受注射劑量影響外，注射細胞大小也是導(dǎo)致血管阻塞和中風(fēng)的重要原因。Ge等〔50〕認(rèn)為使用較小直徑的MSCs可能增加血管內(nèi)移植的安全性。另外注射速度也是影響移植安全性的因素，Janowski等〔51〕實驗顯示，注射速度超過1 ml/min?？梢l(fā)腦卒中。

3 MSCs移植其他策略

干細胞在臨床應(yīng)用中顯示有很好的應(yīng)用前景，但沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的臨床療效，為增強療效提高臨床應(yīng)用價值，大量基礎(chǔ)實驗對移植策略進行改良。干細胞靶向遷移能力差、植入率低制約了其治療效果。通過各種方式，增強細胞存活、遷移、增殖、分化，促進歸巢，誘導(dǎo)營養(yǎng)因子釋放，可進一步改善缺血局部神經(jīng)損傷，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。

3.1細胞預(yù)處理 部分實驗在制備干細胞制劑時對干細胞進行注射前預(yù)處理，改變細胞部分特性，從而提高干細胞移植療效。Hu等〔52〕研究表明，缺氧預(yù)處理增加BM-MSCs的趨化因子受體(CXCR)4表達，促進移植后細胞向梗死區(qū)周圍歸巢，抑制細胞凋亡，促進神經(jīng)元的再生和功能恢復(fù)。Li等〔53〕以川芎提取物四甲基吡嗪預(yù)處理方式增強了BM-MSCs遷移和歸巢能力，促進血管生成，改善神經(jīng)功能。Sun等〔54〕使用一種揮發(fā)性麻醉劑異氟醚預(yù)處理干細胞，通過誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1、CXCR4表達，增加BM-MSCs存活率和功能，提高向缺血腦組織內(nèi)歸巢能力，促進腦卒中小鼠的功能恢復(fù)。Yamauchi等〔55〕以血小板裂解液、粒細胞集落刺激因子進行干細胞預(yù)處理，處理后干細胞表現(xiàn)出更強的增殖能力。Hou等〔56〕實驗表明在大鼠腦卒中模型中，與單純使用hBM-MSCs相比，白細胞介素-8刺激hBM-MSCs中VEGF的生成，使用白細胞介素-8預(yù)處理的hBM-MSCs可降低缺血邊界區(qū)梗死體積，增加血管新生。

3.2細胞改造 通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等手段，對細胞進行改造，可促進干細胞發(fā)揮治療作用。Huang等〔57〕將趨化因子受體CCR2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至MSCs，使CCR2在MSCs過表達，增強了干細胞向缺血半球的定向遷移，提高治療效果。Zong等〔58〕通過腺病毒介導(dǎo)VEGF基因轉(zhuǎn)染BM-MSCs，將干細胞移植到大鼠缺血大腦局灶區(qū)后，VEGF和BDNF的表達和分泌增加，微管相關(guān)蛋白2水平升高，微血管密度增加，大鼠行為功能改善，BM-MSCs存活率提高。Zhang等〔59〕移植BDNF轉(zhuǎn)染的BM-MSCs后，與未轉(zhuǎn)染組相比表現(xiàn)出更好的神經(jīng)功能改善。

3.3聯(lián)合干預(yù) 在干細胞移植治療的同時，選擇聯(lián)合其他干預(yù)措施協(xié)同治療，可通過輔助干細胞起效機制發(fā)揮作用，或同時整合干預(yù)措施本身的治療效果，是一種綜合提高療效的策略。Morimoto等〔60〕在干細胞移植后使用電刺激器刺激右側(cè)額葉硬膜外間隙，結(jié)果顯示大鼠移植BM-MSCs的遷移能力增強，腦梗死體積減少，行為改善明顯。Kim等〔61〕通過MSCs移植聯(lián)合百會、大椎穴電針，兩種干預(yù)都是神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激因子，可促進BDNF、神經(jīng)營養(yǎng)因子4等因子的表達，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子與缺血腦的神經(jīng)發(fā)生有關(guān)，實驗結(jié)果聯(lián)合療法比單一治療更好地調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生引起更明顯的神經(jīng)功能改善。Kim等〔62〕實驗表明當(dāng)歸提取物協(xié)同MSCs可通過增強血管新生提高治療作用，這種混合應(yīng)用方式為治療包括腦卒中、創(chuàng)傷和脊髓損傷在內(nèi)的多種疾病提供了新的方案。Choi等〔63〕認(rèn)為血腦屏障是限制干細胞療效的重要結(jié)構(gòu)，體外實驗表明替莫唑胺、甘露醇聯(lián)合使用可增加血腦屏障通透性，因此在腦卒中模型造模28 d后使用替莫唑胺、甘露醇聯(lián)合hUC-MSCs移植，結(jié)果證實對慢性腦卒中大鼠模型聯(lián)合應(yīng)用比hUC-MSCs單獨應(yīng)用治療更有效，可改善大鼠行為缺陷。雖然在兩組大鼠腦內(nèi)均未檢測到hUC-MSCs，但與單純使用干細胞治療相比，聯(lián)合使用干細胞、甘露醇、替莫唑胺可增加干細胞產(chǎn)生微囊泡的腦內(nèi)遞送，以此促進神經(jīng)再生和血管生成來減少行為缺陷。

綜上，大量基礎(chǔ)實驗證明MSCs移植療法在IS應(yīng)用中的可行性、有效性，并從多種機制闡述了其作用機制。然而，由于干細胞移植過程較為復(fù)雜，可供選擇的移植參數(shù)眾多，何種方式移植可以在保證安全性的前提下使干細胞移植達到最佳療效，且消耗較少的干細胞資源，是當(dāng)前仍需解決的重要問題。這個問題影響著臨床試驗的設(shè)計，掌握高效的干細胞移植策略成為臨床應(yīng)用推廣的一個重要前提。由于移植參數(shù)多樣復(fù)雜，干細胞來源、移植劑量、移植途徑、移植時間等各方面的選擇均會影響治療的有效性及安全性，為確定最佳移植方式，未來還需大量系統(tǒng)、巧妙、合理設(shè)計的實驗和后期大樣本重復(fù)的實驗驗證。另外機制的探討、挖掘有助于在常規(guī)干細胞移植方法基礎(chǔ)上改良策略。聯(lián)合療法、預(yù)處理、細胞改造等方式可通過干預(yù)干細胞治療機制，提高治療有效性，降低不良事件發(fā)生，為IS治療提供新的有效方案?？傊琈SCs移植療法在IS臨床應(yīng)用中前景廣闊，相信不久的將來會在臨床中體現(xiàn)出不可替代的作用。