圈養(yǎng)與散放、野生鳥類腸道菌群差異的Meta分析

王 煥，伍一寧，2，鄒紅菲，王 賀

（1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱，150040）

腸道微生物是指在宿主腸道內(nèi)定殖全部微生物區(qū)系，包括細菌、真菌、古細菌、病毒和原生生物等。腸道微生物與宿主長期協(xié)同進化、密不可分，發(fā)揮著多種多樣的功能，包括物質(zhì)合成與代謝、生物屏障、免疫調(diào)控及宿主防御等［1］。

鳥類的生活史特征多種多樣，如遷徙行為、飛行能力、飲食、交配系統(tǒng)、壽命和生理學等，都可能影響腸道微生物群落［2-4］，Zhang 等［5］總結(jié)了18 種遷徙水鳥的腸道菌群數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高豐度的棒狀桿菌（Corynebacterium）可能有助于候鳥最大限度地積累脂肪，高豐度的梭桿菌屬（Fusobacterium）可能與宿主的食肉性飲食相關(guān)。

目前，對自然條件下野生鳥類胃腸道微生物群落的研究報道較少［2］，鳥類腸道菌群研究主要基于人工圈養(yǎng)環(huán)境下采集的鳥類盲腸提取物或糞便樣品等。動物被置于圈養(yǎng)環(huán)境中，代謝率、身體狀況、激素分泌和其他功能會發(fā)生變化［6］。

本研究利用已發(fā)表的15 篇文獻及本課題組的1項研究共33 組有效數(shù)據(jù)，通過Meta 分析圈養(yǎng)與野生、散放與圈養(yǎng)對鳥類腸道微生物群落組成的影響，為瀕危鳥類人工種群的野化放歸提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 文獻檢索

2021年7月開展研究，文獻主要來自2個電子數(shù)據(jù)庫（Web of Science和CNKI），檢索策略及主要關(guān)鍵詞和短語包括：圈養(yǎng)（captive breeding/ranching/feed in a pen/stable breeding）、野生（wild/uncultivated/feral/wildness）、鳥類（birds/aves/birdlife/avian）和腸道微生物（intestinal microbe/intestinal bacteria/intestinal microflora/gut microbiota）；飼養(yǎng)模式（feeding pattern/yard feeding pattern/feeding patterns/raising model）、鳥類和腸道微生物。在搜索所有候選文章后，依次納入和排除標準進一步篩選。

1.2 文獻選擇

入選文獻需符合標準：全文英文或中文研究文獻；文獻中的研究物種為鳥類；糞便樣本或盲腸提取物等消化道樣本用于腸道菌群分析；16S rRNA 的高通量測序方法；包含野生與圈養(yǎng)或圈養(yǎng)與散放鳥類腸道微生物比較內(nèi)容。

1.3 數(shù)據(jù)提取

確定納入的文獻之后，提取的主要信息有作者、發(fā)表年份、鳥類物種、樣本種類、腸道微生物研究方法、野生與圈養(yǎng)或圈養(yǎng)與散放條件下鳥類腸道微生物群落組成（優(yōu)勢菌門及優(yōu)勢菌屬），提取文獻中已直接發(fā)表的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，圖片數(shù)據(jù)通過Web Plot Digitizer 4.5提取。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Meta分析是將來自不同研究的結(jié)果合并成一個單獨估計值的統(tǒng)計方法［7］。提取腸道優(yōu)勢菌門、菌屬的平均相對豐度，將這些連續(xù)變量表示為平均值±標準偏差（SD），為連續(xù)變量結(jié)果選擇95%置信區(qū)間的加權(quán)平均差（weighted mean difference，WMD）作為效應(yīng)指標。I2統(tǒng)計值和Q檢驗用于評估異質(zhì)性。當統(tǒng)計學異質(zhì)性不顯著時使用固定效應(yīng)模型（I2≤50%，或P＞0.05）進行Meta 分析；當異質(zhì)性顯著時使用隨機效應(yīng)模型分析（I2＞50%，或P≤0.05），獲得匯總估計值。此外，通過逐一剔除納入的研究，再進行效應(yīng)量合并的敏感性分析評估Meta 分析結(jié)果是否穩(wěn)定，尋找異質(zhì)性的來源。如果敏感性分析前后的結(jié)果沒有本質(zhì)上的改變（無改變或者變化不大），說明Meta分析的結(jié)果較為可信，反之則說明存在影響效應(yīng)量的潛在重要因素，在解釋結(jié)果和下結(jié)論時應(yīng)非常慎重［8］。利用R 4.0.4 的Meta 軟件包進行數(shù)據(jù)分析，若置信區(qū)間包含0，說明兩組差異不顯著，若置信區(qū)間全部＞0，說明試驗組豐度顯著增高，反之則說明試驗組顯著減少；采用SigmaPlot 14.0 軟件作圖展示Meta分析的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 選擇研究對象

通過數(shù)據(jù)庫檢索共確定了1 624 項研究，還有9項通過參考文獻反向補充以及1 項本課題組的研究。根據(jù)篩選標準確定了39 項研究，排除數(shù)據(jù)不足文獻后最終將15 篇文獻［9-23］及本課題組的1 項研究納入Meta分析。共提取有效數(shù)據(jù)33組，其中野生與圈養(yǎng)鳥類腸道優(yōu)勢菌門12組，優(yōu)勢菌屬8組；散放與圈養(yǎng)鳥類腸道優(yōu)勢菌門8組，優(yōu)勢菌屬5組。共有15種鳥類被納入研究，包括褐幾維鳥（Apteryxaustralis）、斑頭雁（Anserindicus）、東方白鸛（Ciconiaboyciana）、鴻雁（Ansercygnoides）、丹頂鶴（Grusjaponensis）和多種雞形目（Galliformes）等。

2.2 圈養(yǎng)與野生鳥類腸道菌群的比較

2.2.1 腸道優(yōu)勢菌門的變化

在門水平上，敏感性分析表明所列結(jié)果均穩(wěn)定。Meta 分析結(jié)果表明圈養(yǎng)過程會導(dǎo)致厚壁菌門（Firmicutes）的豐度顯著增加（WMD=0.16［0.03，0.30］，P=0.020）；擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度顯著下降（WMD=-0.07［-0.10，-0.04］，P＜0.001）；綠彎菌門（Chloroflexi）的豐度顯著下降（WMD=-0.10［-0.15，-0.05］，P＜0.001），Meta 分析包含的數(shù)據(jù)較少，結(jié)果不夠穩(wěn)定；變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）的變化沒有統(tǒng)計學差異（圖1A）。

2.2.2 腸道優(yōu)勢菌屬的變化

在屬水平上，敏感性分析結(jié)果穩(wěn)定。Meta 分析結(jié)果表明圈養(yǎng)過程會導(dǎo)致梭菌屬（Clostridium）的豐度顯著下降（WMD=-0.17［-0.26，-0.08］，P＜0.001）；擬桿菌屬（Bacteroides）的豐度顯著下降（WMD=-0.06［-0.08，-0.04］，P＜0.001）；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的豐度顯著下降（WMD=-0.01［-0.02，0.00］，P＜0.001）；糞球菌 屬（Coprococcus，WMD=0.02［0，0.04］，P=0.050）和布勞特氏菌屬（Blautia，WMD=0.07［0.02，0.11］，P=0.005）的豐度顯著增加；乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線菌屬（Actinomyces）和史雷克氏菌屬（Slackia）的變化沒有統(tǒng)計學差異（圖1B）。

圖1 圈養(yǎng)相比野生鳥類腸道菌群組成的變化Fig.1 Comparison of intestinal flora composition between captive and wild birds

2.3 散放與圈養(yǎng)鳥類腸道菌群的比較

2.3.1 腸道優(yōu)勢菌門的變化

在門水平上，擬桿菌門分析中的1組數(shù)據(jù)會造成較高的異質(zhì)性，剔除后I2由99%降為68%，且P值由0.520變?yōu)?.003［9］；放線菌門中剔除一組研究后I2由81%降為0，且P值由0.170變?yōu)?.001［23］。Meta分析結(jié)果表明，散放會顯著增加鳥類腸道優(yōu)勢菌門中擬桿菌門（WMD=0.07［0.02，0.12］，P=0.003）和放線菌門（WMD=0.04［0.02，0.06］，P＜0.001）的豐度，而厚壁菌門、梭桿菌門和變形菌門的豐度沒有顯著變化（圖2A）。

2.3.2 腸道優(yōu)勢菌屬的變化

在屬水平上，乳桿菌屬中研究的1 組數(shù)據(jù)會造成較高的異質(zhì)性，剔除后I2由58%降為0，P值由0.640 變?yōu)?.100，且菌屬數(shù)據(jù)較少，敏感性較高［10］。Meta 分析結(jié)果表明，散放條件下鳥類腸道菌群中Olsenella的豐度顯著低于圈養(yǎng)條件下（WMD=-0.02［-0.04，0］，P=0.020），但Olsenella的包含數(shù)據(jù)較少，結(jié)果不夠穩(wěn)定；Turicibacter、柯林斯氏菌屬（Collinsella）、擬桿菌屬和乳桿菌屬的變化沒有統(tǒng)計學差異（圖2B）。

圖2 散放相比圈養(yǎng)鳥類腸道菌群組成的變化Fig.2 Comparison of intestinal flora composition between free-range and captive birds

3 討論

3.1 圈養(yǎng)與野生鳥類腸道菌群的差異

圈養(yǎng)與野生狀態(tài)下鳥類的優(yōu)勢菌門Meta 分析結(jié)果表明，圈養(yǎng)過程會導(dǎo)致厚壁菌門的豐度顯著增加，而擬桿菌門的豐度顯著下降。擬桿菌門是大多數(shù)脊椎動物胃腸道中的常見細菌，主要參與碳水化合物的代謝和脂質(zhì)的水解，幫助宿主從飲食中獲取營養(yǎng)［24-25］，有助于丙酸鹽、α-淀粉酶和其他負責淀粉和聚合物質(zhì)分解酶的合成［26］，丙酸鹽有助于肝臟中的糖異生，促進飽腹感和降低膽固醇［27］。野生鳥類通過擬桿菌門產(chǎn)生更多的丙酸鹽以促進糖異生和提升飽腹感來應(yīng)對野外食物不夠充足的情況，而圈養(yǎng)條件下鳥類食物充足，不需要更高豐度的擬桿菌門。圈養(yǎng)鳥類腸道中厚壁菌門的增加及擬桿菌門的減少可能與圈養(yǎng)條件下高糖高脂的飲食及鳥類體重的增加相關(guān)。綠彎菌門在圈養(yǎng)環(huán)境中豐度顯著下降，綠彎菌門是一類通過光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)等方式產(chǎn)生能量的細菌，廣泛分布于土壤、湖泊和海洋等環(huán)境中［28］，Wu 等［13］是綠彎菌門Meta 分析中唯一可以評估的文獻，研究的物種東方白鸛是典型的濕地鳥類，推測野生東方白鸛腸道中較高豐度的綠彎菌門可能來自濕地環(huán)境，通過飲食等將該細菌水平傳播至體內(nèi)。

圈養(yǎng)與野生狀態(tài)下鳥類的優(yōu)勢菌屬Meta 分析結(jié)果表明，圈養(yǎng)條件下梭菌屬、擬桿菌屬和雙歧桿菌屬的豐度更低，而糞球菌屬和布勞特氏菌屬的豐度更高。梭菌屬廣泛分布于自然界，其中一些細菌對大多數(shù)脊椎動物具有致病性，黑美洲鷲（Coragyps atratus）以腐肉為食，微生物區(qū)系顯示梭菌屬和梭桿菌門的比例非常高［29］。野生鳥類腸道中梭菌屬的比例較高，具有患病風險，可能是野外環(huán)境水源等污染，而圈養(yǎng)鳥類飲食更加干凈衛(wèi)生，也會定期注射疫苗，所以圈養(yǎng)鳥類腸道中梭菌屬的豐度更低。擬桿菌屬除了具有廣泛的機制利用結(jié)腸中的復(fù)雜多糖以產(chǎn)生對宿主有益的短鏈脂肪酸外［30］，基因組的高度可塑性，經(jīng)常通過基因重排、基因復(fù)制和橫向基因轉(zhuǎn)移進行重組，很容易適應(yīng)不同的生態(tài)位［31］，推測高豐度的擬桿菌屬有助于野生鳥類適應(yīng)復(fù)雜多變的野外環(huán)境。雙歧桿菌屬于放線菌門，產(chǎn)生乳酸作為葡萄糖發(fā)酵的主要產(chǎn)物，對宿主腸道生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生有益影響［32］，通過“雙歧分流”產(chǎn)生醋酸鹽，保護宿主免受腸道致病性感染［33］，野生鳥類腸道中雙歧桿菌屬的豐度更高可能與飲食多樣，活動量大，體型較瘦有關(guān)，而圈養(yǎng)鳥類普遍缺乏足夠的活動量，導(dǎo)致體重增加，抗生素的使用更為頻繁，圈養(yǎng)環(huán)境下的特定壓力（如熱應(yīng)激）等導(dǎo)致腸道內(nèi)雙歧桿菌屬的豐度更低。糞球菌屬在圈養(yǎng)鳥類體內(nèi)豐度更高，圈養(yǎng)條件下高脂高糖的飲食以及缺乏活動量導(dǎo)致體重增加引起了該菌屬在腸道中的富集。布勞特氏菌屬的相對豐度與內(nèi)臟脂肪面積呈顯著負相關(guān)，通過調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPR）41 和43 減少肥胖［34］，圈養(yǎng)鳥類體內(nèi)該菌屬的豐度更高，可能是腸道微生態(tài)系統(tǒng)為了避免圈養(yǎng)鳥類過于肥胖進行的一種微生物的適應(yīng)與調(diào)節(jié)方式。

3.2 散放與圈養(yǎng)鳥類腸道菌群的比較

散放與圈養(yǎng)鳥類腸道菌群優(yōu)勢菌門的比較中，Ocejo 等［9］的圈養(yǎng)肉雞樣本是在一項實驗研究的框架下獲得的，是評估日糧中添加干乳清粉、丁酸鈣或兩者的組合對肉雞生產(chǎn)性能等的影響，推測是這兩種物質(zhì)的組合添加提高了圈養(yǎng)肉雞擬桿菌門的豐度，造成了高異質(zhì)性。Ferrario 等［23］的高異質(zhì)性可能是散放組樣本的來源造成的，散放樣本來自5 只雞，其中3 只母雞來自室外運行的雞舍內(nèi)但緊鄰圈養(yǎng)肉雞，也許是與圈養(yǎng)肉雞的近距離接觸造成了兩種模式的樣本比較接近，形成了高異質(zhì)性。圈養(yǎng)過程導(dǎo)致鳥類腸道菌群中擬桿菌門豐度的顯著下降，但散放模式會顯著增加擬桿菌門的豐度。散放模式下鳥類腸道菌群的擬桿菌門豐度與野生鳥類更為接近，說明散放作為珍稀鳥類野化放歸的過渡階段起到了重要的作用，散放有利于珍稀鳥類的野化放歸。同時，散放也顯著增加了放線菌門的豐度，放線菌門是腸道微生物群的4 個主要門之一，盡管只占很小的比例，但在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用［32］。散放相比圈養(yǎng)增加了鳥類腸道中放線菌門的豐度，可能是散放減輕了鳥類在圈養(yǎng)條件下的應(yīng)激，放線菌門的雙歧桿菌豐度降低與壓力有關(guān)，但在該項Meta 分析中菌屬豐度太小且數(shù)據(jù)較少，無法獲取雙歧桿菌屬在兩種飼養(yǎng)模式下的變化。

散放與圈養(yǎng)鳥類腸道菌群優(yōu)勢菌屬的比較中，其中一組數(shù)據(jù)的異質(zhì)性高可能是由于蛋雞的飲食造成的，散放和籠養(yǎng)蛋雞的日糧都主要為豆粕，含大豆的飲食與籠養(yǎng)環(huán)境的協(xié)同作用可能影響蛋雞乳桿菌屬的豐度［10］。Meta分析結(jié)果表明散放條件下鳥類腸道菌群中Olsenella的豐度顯著低于圈養(yǎng)條件下，由于只有1 組有效數(shù)據(jù)，該項結(jié)果不夠穩(wěn)定。Olsenella是將碳水化合物主要發(fā)酵成乳酸的放線菌類成員［35］，乳酸菌通常被視為各種動物宿主的健康促進菌［36］，幫助消化，維持腸道菌群平衡，降低血清膽固醇和提高免疫力等，可能彌補圈養(yǎng)條件下活動量的不足，適應(yīng)微生物的調(diào)節(jié)。

本研究得到一些關(guān)于圈養(yǎng)與野生、散放與圈養(yǎng)條件下鳥類腸道菌群的變化結(jié)果，但存在一定的局限性。宿主遺傳和飲食被認為是影響腸道微生物群落的兩個關(guān)鍵因素［37］，由于鳥種不同，食性習性的差異導(dǎo)致腸道菌群的每項研究結(jié)果存在差異，在數(shù)據(jù)整合分析上受到限制，導(dǎo)致樣本量較小，散放與圈養(yǎng)條件下雙歧桿菌屬的Meta 分析結(jié)果無法評估，鳥種的不同是異質(zhì)性的主要原因。Meta分析的樣本量有限，很多結(jié)果無法使用漏斗圖評估發(fā)表偏倚，但仍然可以提供科學證據(jù)。

本研究證實了圈養(yǎng)與野生鳥類在腸道菌群組成上存在較大差異；散放會消除一部分圈養(yǎng)的影響，與野生鳥類腸道菌群更加接近，但也存在一定差異，可能與人工輔助有關(guān)，此結(jié)果為珍稀鳥類的人工種群野化放歸前益生菌的合理選擇提供了依據(jù)。