強(qiáng)心安神方對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 及機(jī)制探討*

卿媛媛，李茹，王芳婷，陶源，張婷，莊紅，顏旭

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410006

心力衰竭（ChronicHeartFailure，CHF）是心血管疾病進(jìn)展至末期的病理表現(xiàn)。我國(guó)目前的心衰患者高達(dá) 890 萬(wàn)，而且有30%～35%的住院病人同時(shí)伴有CHF，心衰的再住院率占心血管事件的16.7%，雖然目前心衰患者死亡率呈明顯下降趨勢(shì)，但再住院率仍在增加[1-2]。因此改善心衰患者的預(yù)后及降低再住院率是極期重要的臨床工作。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心安神方可抑制神經(jīng)內(nèi)分泌因子及腎素-血管緊張素系統(tǒng)過(guò)度激活、改善心肌細(xì)胞線粒體呼吸功能與COX活性，改善心肌細(xì)胞能量代謝有關(guān)，可能存在其他作用機(jī)制[3-6]。本實(shí)驗(yàn)以強(qiáng)心安神方對(duì)心衰大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，觀察大鼠心臟彩超左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）值、左室收縮率（LVFS）值及心肌細(xì)胞凋亡情況，觀察心肌細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白CHOPmRNA、GRP78mRNA表達(dá)的差異，探索其治療心力衰竭的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心Wistar雄性大鼠共60只，平均體質(zhì)量約200g左右。

2 主要儀器與試劑

熒光PCR儀（型號(hào)：CFX Connect?實(shí)時(shí)，廠家：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）小動(dòng)物超聲影像（型號(hào)：Vevo2100，廠家：VisualSonics）微型離心機(jī)（型號(hào)：D1008E，SCJLOGEX）；旋渦混合器（型號(hào)：XH-C，廠家：常州越新儀器制造有限公司）等。鹽酸阿霉素購(gòu)于深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：1812E1）；卡托普利購(gòu)于華中藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：20161101）；湖南春光九匯有限公司提供強(qiáng)心安神方超微顆粒（炙黃芪 10g，酸棗仁15g，黃連3g，肉桂2g，阿膠6g，五加皮10g，制首烏10g，葶藶子5g，三七3g）；UltraSYBR Mixture出自CWBIO 康為世紀(jì)（生產(chǎn)批號(hào)：CW0957M）；蘇木素染液（生產(chǎn)批號(hào)：ZLI-9610，品牌：中衫金橋）；伊紅染色液出自Solarbio品牌（生產(chǎn)批號(hào)：G1100）；Scott藍(lán)化液出自Solarbio品牌（生產(chǎn)批號(hào)：G1865）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 模型制備 參照文獻(xiàn)[7]報(bào)道采用鹽酸阿霉素（ADR）腹腔注射進(jìn)行造模，第1～3周按照3mg/kg 劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，第4～6周則按2mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，1次/周；按1周1次的頻率給藥，每天觀察大鼠的精神狀態(tài)及行為學(xué)改變情況，給藥連續(xù)6周后，根據(jù)大鼠心臟超聲結(jié)果以及NT-proBNP水平，以判斷造模是否成功。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將60只Wister大鼠分為正常對(duì)照組9只，造模組51只，從造模成功后的大鼠中隨機(jī)抽取36只并隨機(jī)分為CHF 模型組（等量滅菌蒸餾水，Model）、卡托普利組（2.7mg/kg，Captopril）、強(qiáng)心安神方小劑量組（0.16g/kg，Small dose）、強(qiáng)心安神方大劑量組（0.64g/kg，Large dose），每組大鼠各9只。各組括號(hào)內(nèi)藥物劑量按照人體與動(dòng)物等效劑量系數(shù)換算得出，每組按照每天一次的頻率灌胃給藥，4周后可觀察一般情況，用于后期心臟彩超、心肌細(xì)胞凋亡情況及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性蛋白GRP78、CHOP的檢測(cè)。

4 觀察指標(biāo)

4.1 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL 法） 取大鼠左心室游離壁中間的心室肌肉，浸入 4%多聚甲醛溶液中，固定 24 h后，經(jīng)過(guò)各級(jí)乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，放入石蠟和二甲苯按照1：1配制的混合液中15min，再依次放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟50min左右，予以石蠟包埋繼而切片后進(jìn)行烤片，然后進(jìn)行脫蠟、水化處理后，放入蘇木精水溶液中染色3min，鹽酸乙醇分化液分化15s，稍行水洗后，返藍(lán)液返藍(lán)15s，流水沖洗5min，再置入伊紅染色3min，繼續(xù)用流水沖洗5min，再次進(jìn)行脫水、透明、封片后鏡下檢測(cè)觀察病理情況。

4.2 心臟功能檢測(cè) 應(yīng)用小動(dòng)物超聲影像測(cè)量大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室收縮率（LVFS）。

4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性基因GRP78、CHOP mRNA檢測(cè) 在濕度55%，溫度21℃的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，采用Real Time-PCR法，TRIZOL 法提取總RNA，按Fermetas 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，退火溫度分別為：58.2℃、58.6℃、56.5℃，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照并對(duì)DNA目條帶掃描處理，基于GAPDH內(nèi)參分析各基因與之相對(duì)應(yīng)的表達(dá)水平。見(jiàn)表1。

表1 引物信息表

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差數(shù)（LSD）法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌組織病理學(xué)

正常組心肌排列有序，組織有輕微腫脹充血，模型組心肌排列紊亂，肌漿呈凝固性壞死或空泡，細(xì)胞核固縮甚至破裂，與模型組比較強(qiáng)心安神方小劑量組、強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組心肌排列整齊致密，其中強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組效果更好。見(jiàn)圖1。

圖1 心肌組織HE染色結(jié)果（HE×400）

2 心功能超聲檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比，模型組、強(qiáng)心安神方小劑量組、強(qiáng)心安神方大劑量組及卡托普利組的EF、FS均顯著降低，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠彩超結(jié)果比較

3 RT-PCR檢測(cè)GRP78 mRNA、CHOP mRNA比較

與正常對(duì)照組相比，模型組、強(qiáng)心安神方小劑量組、 強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組GRP78 mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05）；與模型組相比，強(qiáng)心安神方大劑量組GRP78 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；與正常對(duì)照組相比，模型組、強(qiáng)心安神方小劑量組、 強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組CHOPmRNA表達(dá)升高（P＞0.05）；與模型組、對(duì)照組相比，卡托普利CHOPmRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組RT-PCR檢測(cè)GRP78 mRNA、CHOP mRNA

討 論

“慢性心力衰竭”可歸屬于中國(guó)古代醫(yī)學(xué)的“喘證”“水腫”“胸痹”等范疇，其主要病機(jī)可概括為“虛”“瘀”“水”，病位在心，與它臟均密切相關(guān)，病理產(chǎn)物主要為“瘀血”“痰濁”“水飲”，臨床上以“益氣養(yǎng)陰溫陽(yáng)”法治其本，“活血利水”法治其標(biāo)可取得良好療效[8]?！皬?qiáng)心安神方”以炙黃芪為君藥，取其補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、行滯通痹之功效，方中制首烏補(bǔ)肝腎、益精血，二藥合用益氣養(yǎng)陰溫陽(yáng)，使陰陽(yáng)相交，共奏強(qiáng)心安神之效；取三七活血消腫、大黃逐瘀利濕通腑之效，葶藶子善入肺經(jīng)而平喘并利胸脅之水協(xié)同五加皮利水消腫，共為臣藥以化瘀利水；黃連、肉桂配伍以交通心腎，阿膠養(yǎng)血生津，加之酸棗仁四藥可除煩熱、安心神。以上藥物組成可益氣養(yǎng)陰溫陽(yáng)，強(qiáng)心安神。

心力衰竭的不斷進(jìn)展以心室重構(gòu)為生理病理基礎(chǔ)，而心肌細(xì)胞的過(guò)度凋亡是心室重構(gòu)的典型表現(xiàn)，其貫穿于心衰發(fā)生發(fā)展的始終。細(xì)胞凋亡是在內(nèi)在基因調(diào)控下的細(xì)胞自主的有序死亡，心肌細(xì)胞的過(guò)度凋亡可以引起心臟收縮單位的減少進(jìn)一步導(dǎo)致心室重構(gòu)[9]。本研究采用鹽酸阿霉素腹腔注射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的心力衰竭大鼠模型，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組組織有輕微腫脹充血，心肌排列整齊；模型組心肌細(xì)胞凋亡最明顯；與模型組比較強(qiáng)心安神方小劑量組、強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組心肌細(xì)胞壞死程度明顯減輕，這表明強(qiáng)心安神方以及卡托普利對(duì)于心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，可抑制心肌細(xì)胞的凋亡。相比于對(duì)照組，模型組、強(qiáng)心安神方小劑量組、強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組的LVEF、LVFS均顯著降低，P＜0.01，雖然強(qiáng)心安神方小劑量組、大劑量組以及卡托普利組大鼠LVEF以及LVFS相比較模型組有所提高，但差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合前期研究成果及文獻(xiàn)考慮可能阿霉素造模大鼠心臟毒性大，經(jīng)6周造模后，大鼠心臟結(jié)構(gòu)改變，而本實(shí)驗(yàn)僅用藥物干預(yù)4周，藥效還不足以使心臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）作為細(xì)胞凋亡的主要通路之一，其介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與心衰的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密不可分，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性伴侶蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)GRP78的表達(dá)上調(diào)，與跨膜蛋白解離轉(zhuǎn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白結(jié)合，可有效抵抗細(xì)胞應(yīng)激，類(lèi)似于代償性的抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號(hào)表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，但是隨著GRP78的過(guò)度上調(diào)不能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，則會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的下游信號(hào)分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homolo-gous protein，CHOP），進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12]，所以GRP78、CHOP蛋白的上調(diào)可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用Real Time-PCR法檢測(cè)GRP78 mRNA、CHOP mRNA的表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，模型組GRP78 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，強(qiáng)心安神方大劑量組GRP78 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)表明強(qiáng)心安神方大劑量組可以抑制GRP78 mRNA的表達(dá)，達(dá)到抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而改善心肌細(xì)胞凋亡；與正常對(duì)照組相比，模型組、強(qiáng)心安神方小劑量組、 強(qiáng)心安神方大劑量組、卡托普利組CHOPmRNA表達(dá)均升高（P＞0.05）；與模型組、對(duì)照組相比，卡托普利CHOPmRNA表達(dá)升高（P＜0.05），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組CHOPmRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，強(qiáng)心安神方抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與CHOPmRNA表達(dá)無(wú)相關(guān)性。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)證實(shí)強(qiáng)心安神方可以改善心衰大鼠心功能，在一定程度上抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控GRP78 mRNA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，但是否與調(diào)控其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。