本土美極梅奇酵母對(duì)玫瑰香葡萄酒降醇及香氣的影響

張鳴宇，羅莉莎，高 特，孫 康，葛 超，閻賀靜

（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004）

玫瑰香葡萄（Muscat）屬于麝香類葡萄，是昌黎產(chǎn)區(qū)特色葡萄品種之一，由其釀造的玫瑰香葡萄酒也因其特殊的麝香風(fēng)味而廣受歡迎[1]?；诮】岛拖M(fèi)者的多元化需求，低酒度葡萄酒產(chǎn)品越來越備受關(guān)注。但目前采用常規(guī)脫醇或降醇方法生產(chǎn)的低酒度葡萄酒，品種香氣損失嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)[2]。已有研究表明，優(yōu)選本土非釀酒酵母與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混菌發(fā)酵，可突出葡萄酒的品種特色和區(qū)域特征，是改善葡萄酒風(fēng)味特征的重要途徑[3-5]。

目前，已有多種非釀酒酵母被用于葡萄酒降醇的研究[6-8]，并獲得了一定的降醇效果，例如澤姆普林假絲酵母（Candida zemplinina）[9]、美極梅奇酵母（Metschnikowia pul-cherrima）[10]、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）[11]等。M.pulcherrima具有低產(chǎn)乙醇、增加葡萄酒甘油含量、降低乙酸產(chǎn)量、改善葡萄酒風(fēng)味、提高葡萄酒品質(zhì)等優(yōu)良的釀造特性[10，12]。此外，M.pulcherrima具有豐富的胞外酶尤其是β-葡萄糖苷酶活性[13]，有助于葡萄品種香氣物質(zhì)如萜烯、硫醇類物質(zhì)的釋放，對(duì)于改善葡萄酒的風(fēng)味具有很大的積極作用[14]。但M.pulcherrima混菌發(fā)酵的降醇效果及其對(duì)葡萄酒風(fēng)味的改善作用，具有較大的菌株差異，同時(shí)還取決于發(fā)酵條件[15-16]。因此，開展M.pulcherrima的優(yōu)選、發(fā)酵條件的優(yōu)化及其對(duì)葡萄酒風(fēng)味的具體影響及其影響機(jī)制的研究，仍是目前M.pulcherrima菌劑資源開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。

為獲得品種特色突出的低酒度玫瑰香葡萄酒，本研究通過比較分析6株本土M.pulcherrima菌株單菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、降醇效果及其他理化指標(biāo)，從中篩選降醇效果較好的菌株與商用釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香低酒精度葡萄酒，評(píng)估本土M.pulcherrima與商用釀酒酵母F33順序發(fā)酵對(duì)玫瑰香葡萄酒酒精含量及香氣的的影響，以期為特色低酒度玫瑰香葡萄酒的釀造提供菌劑資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玫瑰香葡萄，2020年10月采自昌黎葡萄溝（中國(guó)），含糖量為169.80 g/L，可滴定酸含量為5.20 g/L（以酒石酸計(jì)），pH 3.21。

1.1.2 菌株

商業(yè)釀酒酵母ACTIFLORE F33：法國(guó)LAFFORT公司；本土美極梅奇酵母（M.pulcherrima）（Mp04、Mp07、Mp08、Mp09、Mp10、Mp17）：均保藏于河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基（yeastextractpeptonedextrose，YPD）[17]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

模擬葡萄汁培養(yǎng)基：上海哈靈生物科技有限公司。

1.1.4 主要試劑

蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、果糖（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；偏重亞硫酸鉀、甘油、乙醇（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（50 000 U/mL）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；2-辛醇（純度≥98%）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

V1800紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；YXQ-LS50S立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BS-2F數(shù)顯恒溫振蕩培養(yǎng)箱：金壇區(qū)水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、7890B-5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國(guó)Agilent公司；100 μm PDMS固相微萃取針頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰香葡萄汁的制備

將玫瑰香葡萄分選、除雜、去梗、破碎后裝瓶，經(jīng)過巴氏滅菌（60 ℃滅菌30 min）后，待溫度降至28 ℃，加入50 mg/L SO2和20 mg/L果膠酶，置于4 ℃冰箱靜置12 h左右備用。

1.3.2 美極梅奇酵母單菌發(fā)酵

將斜面保藏的商業(yè)釀酒酵母F33（對(duì)照）和6株不同的本土M.pulcherrima（Mp07、Mp04、Mp17、Mp08、Mp09和Mp10）分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，以106CFU/mL的接種量接入含有200 mL玫瑰香葡萄汁的帶有橡膠塞和玻璃發(fā)酵栓的500 mL錐形瓶中，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。25 ℃靜置發(fā)酵，每天監(jiān)測(cè)CO2的質(zhì)量損失，若CO2質(zhì)量損失連續(xù)2 d變化＜0.2 g/100 mL，則視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液4 ℃離心10 min（6 000 r/min），取上清液測(cè)定乙醇、果糖、葡萄糖、甘油含量。

1.3.3 美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母順序接種發(fā)酵

取Mp04、Mp17和Mp08活化液，分別以107CFU/mL的接種量接入含有3 L玫瑰香葡萄汁的5 L玻璃罐中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。25 ℃靜置發(fā)酵3 d后，以106CFU/mL的接種量接種商業(yè)釀酒酵母F33，25 ℃靜置發(fā)酵，以未接種美極梅奇酵母的樣品為對(duì)照，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定各玫瑰香葡萄原酒（F33、Mp04/F33、Mp08/F33、Mp17/F33）的理化指標(biāo)，并采用GC-MS法測(cè)定玫瑰香葡萄酒的揮發(fā)性香氣成分。

1.3.4 測(cè)定方法

乙醇、葡萄糖、果糖、甘油含量：采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定[18]，并計(jì)算乙醇產(chǎn)量、產(chǎn)率、殘?zhí)橇?，其?jì)算公式如下：

總酸、揮發(fā)酸、干浸出物、總硫含量：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定；總酚含量：參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定；總糖含量：參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 玫瑰香葡萄原酒揮發(fā)性成分測(cè)定

使用GC-MS法測(cè)定玫瑰香葡萄原酒中的揮發(fā)性物質(zhì)[21]。

GC條件：HP-5MS（5 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%），流速1 mL/min。進(jìn)樣口溫度45 ℃。升溫程序：45 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速度升溫至84 ℃，保持2 min；以3 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速度升溫至200 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃。

MS條件：質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為30～350 m/z。

定性定量方法：檢測(cè)出的未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wileylibrary相匹配，選擇匹配度＞85%的物質(zhì)作為有效香氣成分，結(jié)合文獻(xiàn)中的保留指數(shù)進(jìn)行香氣物質(zhì)的定性；以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)（質(zhì)量濃度0.2 mg/mL），按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分質(zhì)量濃度實(shí)現(xiàn)定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；使用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析；采用Origin 2019b進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA）并作圖；采用TBtools軟件繪制樣品中揮發(fā)性成分差異熱圖[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美極梅奇酵母單菌發(fā)酵玫瑰香葡萄汁過程分析

不同單菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄汁CO2質(zhì)量損失曲線見圖1。

圖1 不同單菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄汁過程中CO2質(zhì)量損失的變化Fig.1 Changes of CO2 mass loss during Muscat juices fermentation by different single strains

由圖1可知，商用釀酒酵母F33單菌發(fā)酵速度遠(yuǎn)高于M.pulcherrima，能在發(fā)酵第8天達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，最高CO2質(zhì)量損失為2.46 g/100 mL。不同M.pulcherrima發(fā)酵能力和發(fā)酵速度具有很大差異，其中，M.pulcherrimaMp04、Mp08和Mp09發(fā)酵速度最快，最大CO2質(zhì)量損失在0.4～0.8 g/100 mL，且均在20 d左右完成發(fā)酵；M.pulcherrimaMp10發(fā)酵能力最弱，最大CO2質(zhì)量損失為0.19 g/100 mL，發(fā)酵第12天停止發(fā)酵。

單菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄汁結(jié)束后，測(cè)定各項(xiàng)理化指標(biāo)，結(jié)果見表1。由表1可知，6株M.pulcherrima單菌發(fā)酵能力較弱，發(fā)酵停止時(shí)殘?zhí)橇烤? g/L，與圖1結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道M.pulcherrima不能單獨(dú)完成發(fā)酵的結(jié)果一致[19]。由于M.pulcherrima不能單獨(dú)完成整個(gè)發(fā)酵，發(fā)酵液中仍有大量殘?zhí)?，?dǎo)致非釀酒酵母發(fā)酵液中酒精度較低，這不足以說明M.pulcherrima低產(chǎn)乙醇的釀造特性。因此，本研究參考文獻(xiàn)[18]引入了乙醇產(chǎn)率，以評(píng)價(jià)非釀酒酵母產(chǎn)乙醇的特性。不同M.pulcherrima的甘油和乙醇合成能力不同，甘油含量為1.72～3.93 g/L，均低于商業(yè)釀酒酵母F33（6.05 g/L）。乙醇產(chǎn)率介于27.49%～36.37%，均低于商業(yè)釀酒酵母F33（45.51%），其中乙醇產(chǎn)率最低的4株M.pulcherrima依次為Mp10（27.49%）、Mp08（31.33%）、Mp17（32.80%）、Mp04（32.95%）。而菌株Mp10由于發(fā)酵能力較弱，殘?zhí)呛枯^高，故舍去。綜合乙醇產(chǎn)率對(duì)比分析，認(rèn)為菌株Mp04、Mp08和Mp17發(fā)酵能力較強(qiáng)，降醇效果較好。

表1 不同單菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄汁前后理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes Muscat juice before and after fermentation by different single strains

2.2 美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒分析

2.2.1 玫瑰香葡萄原酒的理化指標(biāo)

玫瑰香葡萄原酒的理化指標(biāo)見表2。由表2可知，與商業(yè)釀酒酵母F33單菌發(fā)酵相比，M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵，降低了玫瑰香葡萄原酒的甘油含量，這與部分文獻(xiàn)報(bào)道不符[23-25]，分析認(rèn)為可能與菌株和發(fā)酵條件的差異有關(guān)。所有M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵均具有一定降醇作用，乙醇含量降低了0.38%vol～1.93%vol，降醇效果差異顯著（P＜0.05），Mp17/F33酒樣中乙醇含量最低（6.62%vol）。M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵提高了揮發(fā)酸含量，與部分文獻(xiàn)報(bào)道不符[2，10]，分析可能與菌株和發(fā)酵條件有關(guān)。揮發(fā)酸含量均在國(guó)標(biāo)GB/T15037—2006《葡萄酒》規(guī)定的范圍內(nèi)（≤1.2 g/L），對(duì)葡萄酒的風(fēng)味不會(huì)產(chǎn)生不良影響。M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵均顯著增加了總酚含量，較商業(yè)釀酒酵母F33單菌發(fā)酵提高6.36%～24.12%，其中，Mp04/F33酒樣中總酚含量增加最高，分析可能與M.pulcherrima具有豐富的胞外酶活性有關(guān)，增加了葡萄皮中酚類物質(zhì)的浸出率[26]。M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵對(duì)玫瑰香葡萄酒的干浸出物含量和總硫含量有顯著性影響（P＜0.05），具體原因需要進(jìn)一步的研究分析。

表2 不同美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒的理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indexes of Muscat wines sequential fermentation by different Metschnikowia pulcherrima and commercial Saccharomyces cerevisiae F33

2.2.2 玫瑰香葡萄原酒揮發(fā)性成分的分析

采用GC-MS從玫瑰香葡萄原酒中共檢測(cè)到55種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括酯類22種，醇類7種，酸類11種，醛類4種，萜烯類11種，結(jié)果見表3和圖2。

酯類物質(zhì)可以為葡萄酒帶來令人愉悅的花香和果香，是葡萄酒香氣的重要組成部分[19]。由表3和圖2可知，F(xiàn)33酒樣中酯類物質(zhì)種類最為豐富，共檢測(cè)到16種，總含量為21 122.8 μg/L。M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒中酯類物質(zhì)種類和含量明顯不同于商業(yè)釀酒酵母F33單菌發(fā)酵。Mp17/F33酒樣中共檢測(cè)到9種，遠(yuǎn)低于F33酒樣，但總含量（28 557.5 μg/L）卻高于F33單菌發(fā)酵，主要表現(xiàn)為正己酸乙酯、甲酸香草酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和棕櫚酸乙酯含量的增加。然而，Mp08/F33和Mp04/F33酒樣中酯類物質(zhì)的種類和含量均遠(yuǎn)低于F33和Mp17/F33酒樣。這與VARELA C等[13]提出的釀酒酵母與美極梅奇酵母混合發(fā)酵導(dǎo)致乙酯類物質(zhì)減少的結(jié)論相似。以上結(jié)果說明，不同M.pulcherrima菌株對(duì)玫瑰香葡萄原酒酯類物質(zhì)的影響不同，分析原因可能是不同M.pulcherrima菌株細(xì)胞內(nèi)酯類物質(zhì)合成相關(guān)關(guān)鍵酶活性具有差異。

表3 不同美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵葡萄原酒揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 GC-MS analysis results of volatile compounds of Muscat wines with sequential fermentation by different Metschnikowia pulcherrima and commercial Saccharomyces cerevisiae F33

續(xù)表

F33酒樣中醇類物質(zhì)的種類和總含量均高于M.pul cherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵的玫瑰香葡萄原酒。不同M.pulcherrima菌株對(duì)玫瑰香葡萄原酒中酸類物質(zhì)種類和含量的影響不同。與F33酒樣相比，Mp17/F33酒樣中酸類物質(zhì)含量增加212.08%，而Mp04/F33和Mp08/F33酒樣酸類物質(zhì)含量則有所降低。醛類感官閾值較低，風(fēng)味特征明顯，也是葡萄酒香氣的重要組成部分[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵降低了醛類物質(zhì)的種類及含量。不同M.pulcherrima菌株與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵的玫瑰香葡萄原酒中的萜烯類物質(zhì)種類和含量不同。其中M.pulcherrimMp08增加了萜烯類物質(zhì)含量。香葉醇、橙花醇、α-松油醇和玫瑰醚僅在Mp08/F33酒樣中檢測(cè)到，這幾種物質(zhì)是玫瑰香葡萄的重要品種香氣物質(zhì)[20]。由此可見，M.pulcherrimMp08與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵可促進(jìn)以上萜烯類物質(zhì)的合成和釋放，有利于突出玫瑰香葡萄酒的品種香氣。

萜烯類為玫瑰香類葡萄特征性香氣物質(zhì)[28]，因此，對(duì)不同玫瑰香葡萄原酒樣品中的萜烯類物質(zhì)和含量進(jìn)行聚類分析，并繪制熱圖，結(jié)果見圖3。

圖3 不同美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒中萜烯類物質(zhì)的差異分析熱圖Fig.3 Differences analysis heat map of terpenoid components of Muscat wines with sequential fermentation by different Metschnikowia pulcherrima and commercial Saccharomyces cerevisiae F33

由圖3可知，不同玫瑰香葡萄原酒樣品聚為3類：Mp08/F33和F33酒樣分別單獨(dú)聚為一類，Mp04/F33和Mp17/F33酒樣聚為一類。Mp08/F33酒樣中的萜烯類物質(zhì)總含量最高（11 468.9 μg/L），較F33酒樣增加113.07%，表現(xiàn)出優(yōu)良的增香潛力。Mp04/F33和Mp17/F33酒樣聚為一類，與F33和Mp08/F33酒樣距離較遠(yuǎn)，萜烯類物質(zhì)種類和含量遠(yuǎn)不及F33和Mp08/F33酒樣。

為進(jìn)一步分析不同M.pulcherrima與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒在香氣物質(zhì)組成上的差異，對(duì)氣味活度值（odor activity value，OAV）＞0.1的16種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。

圖4 OAV＞0.1的不同美極梅奇酵母與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵玫瑰香葡萄原酒香氣物質(zhì)主成分分析結(jié)果Fig.4 Principal compounds analysis results of aroma compounds(OAV＞0.1) in Muscat wines with sequential fermentation by different Metschnikowia pulcherrima and commercial Saccharomyces cerevisiae F33

由圖4可知，PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為40.5%和28.9%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為69.4%，說明兩個(gè)主成分基本反應(yīng)原數(shù)據(jù)的全部變異。4種玫瑰香葡萄原酒被完全區(qū)分開，說明不同M.pulcherrima對(duì)葡萄原酒的香氣成分影響不同，其中萜烯類物質(zhì)占絕大多數(shù)，該類物質(zhì)也被認(rèn)為是品種香氣的主要成分[27-28]。Mp08/F33酒樣位于第一象限，標(biāo)志性香氣物質(zhì)主要為芳樟醇、苯乙醇、香葉醇、橙花醇、α-松油醇和玫瑰醚。說明Mp08/F33順序發(fā)酵的玫瑰香葡萄酒樣品種特征顯著。F33酒樣位于第二象限，標(biāo)志性香氣物質(zhì)主要為癸醛、辛酸乙酯、月桂烯和月桂醛。Mp04/F33酒樣位于第三象限，標(biāo)志性香氣物質(zhì)主要為β-蒎烯；Mp17/F33酒樣位于第四象限，標(biāo)志性香氣物質(zhì)主要為1-壬醇、香茅醇、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和正己酸乙酯。由此可見，M.pulcherrima對(duì)玫瑰香葡萄原酒香氣物質(zhì)的影響具有顯著的菌株差異。

3 討論

本研究考察了本土M.pulcherrima在玫瑰香葡萄酒降醇和增香方面的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M.pulcherrimaMp04、Mp08和Mp17分別與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵，乙醇含量比F33單菌發(fā)酵分別降低0.38%vol、1.26%vol和1.93%vol，降醇效果較好。這一結(jié)果與GARCíA M等[29]的研究報(bào)道一致。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道，M.pulcherrima降醇效果范圍在0.9%vol～2.5%vol[30]，絕大多數(shù)降醇效果＜1.5%vol[29]，少數(shù)能達(dá)到2.0%vol以上[31]。本試驗(yàn)中M.pulcherrimaMp08降醇效果達(dá)到1.26%vol，處于中等水平，在葡萄酒的降醇方面具有一定的應(yīng)用潛力。研究表明，發(fā)酵條件對(duì)菌株的生長(zhǎng)和代謝具有不同影響，例如釀酒酵母的菌種來源，發(fā)酵過程的溶氧或通風(fēng)水平等[32]。因此，通過釀酒酵母的選擇及相應(yīng)混菌發(fā)酵條件的調(diào)控，將有望進(jìn)一步提高M(jìn)p08的降醇效果。

本研究對(duì)比分析了M.pulcherrimaMp04、Mp17和Mp08與商業(yè)釀酒酵母F33順序發(fā)酵對(duì)玫瑰香葡萄原酒香氣物質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株M.pulcherrima對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響具有較大差異，在酯類、醇類、萜烯類等物質(zhì)種類和含量方面具有不同影響。ZHANG B Q等[33]對(duì)不同M.pulcherrima順序發(fā)酵對(duì)酯類物質(zhì)影響的研究中，也得到了與本研究類似的結(jié)果。由此說明，菌株的差異可能是影響酯類物質(zhì)合成的關(guān)鍵因素，可能與不同菌株細(xì)胞內(nèi)酯類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶的活性的高低直接相關(guān)[34-35]。目前，有關(guān)M.pulcherrima與釀酒酵母混菌發(fā)酵對(duì)香氣物質(zhì)代謝的影響機(jī)制尚未明晰。因此，亟待開展相關(guān)研究，以便對(duì)M.pulcherrima混菌發(fā)酵對(duì)香氣物質(zhì)的合成進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。

本研究還發(fā)現(xiàn)，3株M.pulcherrima均可降低醇類物質(zhì)尤其是高級(jí)醇的含量，這一結(jié)果與部分文獻(xiàn)報(bào)道一致[14，36]。HRANILOVIC A等[31]的研究也得到了相似的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質(zhì)中的氮源對(duì)高級(jí)醇合成的影響可能起關(guān)鍵作用[37]。當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)含有過多的M.pulcherrima偏好的氮源時(shí)，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)高級(jí)醇含量的增加。同時(shí)，當(dāng)基質(zhì)中酵母可利用氮源含量為180～195 mg/L時(shí)，可生成適量的高級(jí)醇[38]。由此可見，M.pulcherrima與釀酒酵母的混菌發(fā)酵過程中，氮源的調(diào)控可能是實(shí)現(xiàn)高級(jí)醇精準(zhǔn)調(diào)控的有效途徑。

此外，結(jié)果表明，M.pulcherrimaMp08與商業(yè)釀酒酵母F33的順序發(fā)酵能顯著增加萜烯類物質(zhì)的含量。萜烯類及硫醇類物質(zhì)為葡萄酒的品種香氣物質(zhì)，該類物質(zhì)在葡萄果實(shí)中多以結(jié)合態(tài)形式存在，葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以使其水解，從而釋放可以呈香的游離態(tài)萜烯類物質(zhì)，增加葡萄酒的品種香氣[39-42]。由此說明，Mp08/F33酒樣萜烯類物質(zhì)的含量顯著升高，不僅與其β-葡萄糖苷酶活性有關(guān)，可能也由Mp08具有優(yōu)良的萜類物質(zhì)合成能力所致。此外，在本試驗(yàn)中，Mp08/F33酒樣中的苯乙醇含量也是最高的。苯乙醇可賦予葡萄酒玫瑰花香氣，也是玫瑰香葡萄酒的特征香氣物質(zhì)之一，可為葡萄酒帶來令人愉悅的淡雅、細(xì)膩而持久的玫瑰花香氣[43]。同時(shí)，苯乙醇也是酵母交互作用中非常重要的群體感應(yīng)信號(hào)分子之一[44-45]，具有抗菌保鮮作用[46]。綜上，雖然M.pulcherrimaMp08的降醇效果不是最好的，但M.pulcherrimaMp08表現(xiàn)出了較為突出的降醇和葡萄酒增香能力，該菌株可能在生產(chǎn)香氣濃郁的低酒度葡萄酒產(chǎn)品中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究通過比較不同本土M.pulcherrima單菌發(fā)酵玫瑰香葡萄汁發(fā)現(xiàn)，M.pulcherrimaMp04、Mp08和Mp17的糖發(fā)酵能力較強(qiáng)，降醇效果較好，與S.cerevisiaeF33順序接種發(fā)酵玫瑰香葡萄汁后，可使玫瑰香葡萄原酒中的乙醇含量分別降低0.38%vol、1.26%vol和1.93%vol。不同M.pulcherrima對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)、種類和含量影響不同。其中，M.pulcherrimaMp08與S.cerevisiaeF33順序發(fā)酵可使乙醇含量降低1.26%vol，苯乙醇含量增加165.49%，萜烯類物質(zhì)總量增加113.07%，增加新的香氣物質(zhì)香葉醇、橙花醇、松油醇和玫瑰醚，含量分別為108.3 μg/L、4 166.7 μg/L、99.6 μg/L和4 927.5 μg/L。綜上，M.pulcherrimaMp08具有較好的降醇效果和突出玫瑰香葡萄酒特征香氣的能力，在釀造品種香氣濃郁的低酒精度葡萄酒中具有重要的應(yīng)用潛力。