弓形蟲ROP16蛋白對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

馬慧慧，汪鵬濤，劉春蘭，李佳銘，王藝璇，蘭 敏，趙志軍，3

乳腺癌(breast cancer,BC)，女性最好發(fā)的腫瘤之一，對(duì)女性的健康造成巨大威脅，多年來，是導(dǎo)致女性死亡的最主要病因[1]。其中，以激素受體陽性乳腺癌發(fā)病率最高[2]。癌細(xì)胞的無限增殖、抗凋亡特性是目前腫瘤治療的一大難題，針對(duì)這些特性研發(fā)的抗腫瘤藥物能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3]，但因腫瘤治療周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的耐藥性，嚴(yán)重影響了腫瘤的治療及預(yù)后。因此，研究新的抗腫瘤藥物和方法是腫瘤治療的關(guān)鍵。近年來，隨著對(duì)抗腫瘤藥物研究的深入，寄生蟲蟲體蛋白成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。因其具有成分單一、高效、低毒的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)避免了全蟲因成分復(fù)雜、毒性大帶來的危害。為臨床治療腫瘤帶來新思路。

2007年，研究者們通過構(gòu)建小鼠模型首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了弓形蟲 ROP16 基因。其位于基因組Ⅶb染色體上，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時(shí)，通過核易位序列，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮作用。ROP16 蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子 STAT3/STAT6 的磷酸化影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。但不同蟲株間存在差異，如Ⅰ型蟲株可通過促進(jìn)宿主細(xì)胞 STAT3/STAT6 快速、持續(xù)的磷酸化，Ⅱ型蟲株則正好與Ⅰ 型蟲株相反，由于其激酶區(qū)一個(gè)關(guān)鍵氨基酸被替代，因此 II 型蟲株不引起 STAT3/STAT6 磷酸化[4-6]。前期研究表明，弓形蟲 RH 株速殖子與人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞共培養(yǎng)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。而 ROP16 作為速殖子中的關(guān)鍵分子，與弓形蟲抗腫瘤作用密切相關(guān)。

因此，本研究擬采用過表達(dá) ROP16 蛋白的慢病毒載體(MCF-7-RH ROP16)，通過 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)及 Western-blot 方法，探究 ROP16 蛋白對(duì) MCF-7 細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；ROP16 過表達(dá)及空載體慢病毒購自漢恒生物公司；胎牛血清和 DMEM 培養(yǎng)基購于 BI 公司；Caspase-9、His-tag 抗體購于 Abcam 公司；Caspase-3、CyclinA1、CDK2、Bax、Bcl-2、p21、p53、β-actin 抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis 試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Real Time PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連 TaKaRa生物工程公司；RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建 取出凍存于液氮罐中的MCF-7 細(xì)胞，立即復(fù)蘇，DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。待 MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，將其接種在 12 孔板上，每孔細(xì)胞數(shù)為 6×104，每組 3 個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分為 ROP16過表達(dá)組(MCF-7-RH ROP16)、陰性對(duì)照組(MCF-7-HBLV)和空白組(MCF-7)。當(dāng)細(xì)胞的融合程度約為 50%時(shí)，將過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒按病毒說明書添加到 12 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光蛋白檢測(cè)。在成功感染慢病毒后，以加入嘌呤霉素(3 μg/mL)的 DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選至過表達(dá)組、陰性對(duì)照組未見細(xì)胞死亡，說明獲得 ROP16 穩(wěn)定表達(dá)的 MCF-7 細(xì)胞株，可進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1.3 RT-PCR法驗(yàn)證ROP16 mRNA在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況 收集并用Trizol法提取MCF-7、MCF-7-HBLV、MCF-7-RH ROP16細(xì)胞組RNA，檢測(cè)其含量及純度，逆轉(zhuǎn)錄后，以獲得的cDNA為模板。反應(yīng)體系為(20 μL):DNA 1 μL,上、下游引物各1 μL,Taq PCR Master Mix 10 μL,無酶水補(bǔ)足。GAPDH為內(nèi)參基因，調(diào)整參數(shù)(95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán))，通過SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)ROP16(上游引物：5′-CGGCTGGTCTCGG-3′；下游引物：5′-GGTGAAAGCTGGGTTTGGT-3′)mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法驗(yàn)證ROP16蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況 收集細(xì)胞并提取 MCF-7、MCF-7-HBLV、MCF-7-RH ROP16細(xì)胞組蛋白。蛋白濃度經(jīng)BCA試劑檢測(cè)后，以每孔30 μg蛋白上樣后用80 V恒壓電泳30 min，再以120 V恒壓、300 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜90 min后，膜用50 g/L的BSA封閉1.5 h。分別加入His-tag和β-actin一抗。置搖床4 ℃孵育18 h左右。TBST洗膜3次(10 min/次)，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。3次TBST清洗(15 min/次)，加入ECL顯色液，避光環(huán)境下曝光拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CCK-8法檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞增殖 收集 MCF-7、MCF-7-HBLV、MCF-7-RH ROP16 細(xì)胞組細(xì)胞，以 8×103個(gè)/孔細(xì)胞量接種到 96 孔板。置于恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 后，加 CCK8 檢測(cè)液，繼續(xù)孵育2 h 后，于 450 nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定MCF-7細(xì)胞周期及凋亡 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 MCF-7、MCF-7-HBLV、MCF-7-RH ROP16 細(xì)胞組細(xì)胞，調(diào)整數(shù)量至 2×105～1×106個(gè)。加入預(yù)冷 75%乙醇，4 ℃固定 18 h，離心,棄上清，加 PBS 洗滌。加入 PI 和 RNaseA，室溫避光放置 30 min，采用最小進(jìn)樣速度測(cè)定細(xì)胞周期。對(duì)各組檢測(cè)細(xì)胞均未作細(xì)胞周期同步化處理。利用 AnnexinV-PE/7-AAD 試劑盒，將稀釋后的 1×工作液重懸待檢細(xì)胞，于每管中加 5 μL AnnexinV-APC、10 μL 7-AAD后，輕柔混勻。待其反應(yīng) 10 min，以最低上樣速度上流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的凋亡。

1.7 Western blot法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中p-STAT3、細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 收集細(xì)胞并提取 MCF-7、MCF-7-HBLV、MCF-7-RH ROP16 細(xì)胞組蛋白。以每孔 30 μg 蛋白上樣后用 80 V 恒壓電泳 30 min，再以 120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流冰浴轉(zhuǎn)膜2 h后，膜用50 g/L的BSA封閉1.5 h。分別加入 p-STAT3、Bcl-2、Bax、Caspases-3、Caspase9、p53、p21、CDK2、CyclinA1 和β-actin 一抗。置搖床4 ℃孵育 18 h左右。TBST 洗膜 3 次(10 min/次)，加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。3 次 TBST 清洗(15 min/次)，加入 ECL 顯色液，避光環(huán)境下爆光拍照，以β-actin 為內(nèi)參，分析各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建ROP16過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞 為了構(gòu)建ROP16穩(wěn)轉(zhuǎn)的MCF-7細(xì)胞株，采用空載體(HBLV)和過表達(dá)ROP16蛋白的慢病毒載體(HBLV-RH ROP16)分別感染MCF-7細(xì)胞。收集細(xì)胞，培養(yǎng)到一定數(shù)目并狀況良好，熒光顯微鏡觀察，視野范圍內(nèi)95%以上的細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)熒光(圖1A)。進(jìn)一步通過Western blot和RT-PCR法，驗(yàn)證ROP16在MCF-7細(xì)胞中蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比于MCF-7-HBLV和MCF-7細(xì)胞組，MCF-7-RH ROP16細(xì)胞組的ROP16蛋白(圖1B)和mRNA(圖1C)表達(dá)明顯增高(FROP16=893.6,P<0.001;FmRNA=83 065,P<0.001)。表明ROP16蛋白成功表達(dá)于MCF-7細(xì)胞。

A為熒光顯微鏡觀察ROP16蛋白感染MCF-7細(xì)胞情況,a-c為GFP表達(dá)(透射光,×40);a'-c'為細(xì)胞形態(tài)(熒光,×40)；B為Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中ROP16蛋白表達(dá),1為空白組；2為陰性對(duì)照組；3為過表達(dá)組；C為q-PCR檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中ROP16 mRNA表達(dá)。圖1 熒光顯微鏡、Western blot和RT-PCR檢測(cè)ROP16在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of ROP16 in MCF-7 cells,detected by fluorescence microscopy，RT-PCR and Western blotting

2.2 ROP16蛋白對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法測(cè)定ROP16蛋白對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響。如圖2所示，感染Ⅰ型 ROP16 蛋白24 h 后，MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制(F=97.28，P<0.01)，而在 48 h、72 h 后，MCF-7 的生長(zhǎng)受到顯著抑制(F48 h=157.2,P<0.001;F72 h=280.7,P<0.001)。結(jié)果表明，過表達(dá)Ⅰ型 ROP16 蛋白可抑制 MCF-7 細(xì)胞增殖。

圖2 CCK-8 檢測(cè)ROP16對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of ROP16 on the proliferation of MCF-7 cells,detected with CCK-8 assays

2.3 ROP16蛋白對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 以上結(jié)果證明ROP16蛋白可顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖。由于細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期調(diào)控，于是進(jìn)一步探究ROP16蛋白對(duì) MCF-7 細(xì)胞周期的影響。由流式分析結(jié)果(圖3A、B)可見,Ⅰ型過表達(dá)組中 G1 期細(xì)胞比例由 67.11%下降到 53.92%,S 期比例由 22.94%上升到 36.78%,G2 期的比例沒有明顯變化。進(jìn)一步通過Western blot法測(cè)定 ROP16 過表達(dá)后的 MCF-7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株周期蛋白表達(dá)情況，以明確 ROP16 蛋白誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生周期阻滯的機(jī)制。如圖3C、D所示，與MCF-7-HBLV、MCF-7 細(xì)胞組相比,MCF-7-RH ROP16 細(xì)胞組細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子p21 的表達(dá)水平增高(F=371.5,P<0.001),周期相關(guān)蛋白 CDK2、CyclinA1的表達(dá)水平降低(FCDK2=748.9,P<0.001;FCyclinA1=633.1,P<0.001)。表明Ⅰ型ROP16 蛋白對(duì) MCF-7 細(xì)胞中周期蛋白的表達(dá)有一定的調(diào)控作用,并使其停止在S期。

A：流式分析 ROP16 過表達(dá)后對(duì) MCF-7 細(xì)胞周期影響情況；B：MCF-7 細(xì)胞周期蛋白流式結(jié)果分析；C：Western blot檢測(cè)ROP16過表達(dá)后對(duì) MCF-7 細(xì)胞中 S 期相關(guān)蛋白 p21、CDK2和CyclinA1的表達(dá)情況；D：MCF-7 細(xì)胞周期蛋白的細(xì)胞水平的定量分析。圖3 流式細(xì)胞術(shù)、Western-blot檢測(cè)ROP16蛋白對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of ROP16 protein on the MCF-7 cell cycle,detected by flow cytometry and Western blotting

2.4 ROP16蛋白對(duì) MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)以上結(jié)果,猜測(cè) ROP16 蛋白對(duì) MCF-7 細(xì)胞凋亡有一定的影響，因此通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。如圖4A、B所示，MCF-7-RH ROP16 細(xì)胞組凋亡率為 11.4%,相較于MCF-7-HBLV、MCF-7細(xì)胞組升高(F=172.1,P<0.001)。進(jìn)一步通過Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，以明確 ROP16 蛋白誘導(dǎo) MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制。相較于MCF-7-HBLV、MCF-7細(xì)胞組，ROP16蛋白過表達(dá)載體感染MCF-7 細(xì)胞,可使 Bax、Caspase9、Caspase3、p53蛋白高表達(dá)(FBax=37.88,Fcaspase9=20.21,Fcaspase3=38.10,Fp53=49.72，均P<0.01)，而Bcl-2低表達(dá)(F=19.44,P<0.01)(圖4C、D),Bcl-2/Bax 蛋白比例降低。表明Ⅰ型 ROP16 蛋白可誘導(dǎo) MCF-7 細(xì)胞凋亡。

A：流式分析 ROP16 過表達(dá)后對(duì) MCF-7 細(xì)胞凋亡影響情況；B：MCF-7 細(xì)胞周期蛋白流式結(jié)果分析；C：Western blot檢測(cè) ROP16 過表達(dá)后對(duì) MCF-7 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Bax、Caspases-3、Caspase9、p53 蛋白的表達(dá)情況；D：MCF-7 細(xì)胞凋亡蛋白的細(xì)胞水平的定量分析。圖4 流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測(cè)ROP16蛋白對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of ROP16 on MCF-7 apoptosis,detected by flow cytometry and Western blotting

2.5 ROP16對(duì)MCF-7 細(xì)胞 STAT3 蛋白的激活作用 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弓形蟲 ROP16 蛋白對(duì)人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞增殖、周期、凋亡有顯著影響。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，我們檢測(cè)了 JAK/STAT3 通路中關(guān)鍵蛋白STAT3 的表達(dá)，以明確 ROP16 蛋白具體的抗腫瘤機(jī)制。相較于MCF-7-HBLV、MCF-7 細(xì)胞組,ROP16 蛋白過表達(dá)組中 p-STAT3 的表達(dá)上調(diào)(F=4 705,P<0.001)(圖5A、B)。表明Ⅰ型 ROP16 蛋白可誘導(dǎo) STAT3 磷酸化進(jìn)而激活 STAT3。

A:Western blot 檢測(cè) ROP16 過表達(dá)后 MCF-7 中 p-STAT3 蛋白的表達(dá)情況；B：MCF-7 細(xì)胞中 p-STAT3 細(xì)胞水平的定量分析。圖5 Western blot 檢測(cè) ROP16 過表達(dá)后 MCF-7 中 p-STAT3 蛋白的表達(dá)情況Fig.5 Western blot detection of p-STAT3 protein expression in MCF-7 cells after ROP16 overexpression

3 討 論

弓形蟲蛋白R(shí)OP16作為一個(gè)外源蛋白，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。Chang等報(bào)道了ROP16蛋白通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、P21、CDKs等凋亡、周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲Ⅱ型ROP16蛋白可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2、Bax 等的表達(dá)，抑制THP-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；Ⅰ型ROP16蛋白可通過促進(jìn)STAT3磷酸化，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Cleaved Caspases-3、Caspases-9、p53、p21、CDK6、CyclinD1等與凋亡、周期相關(guān)的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯[9-10]。本研究結(jié)果顯示，Ⅰ型ROP16蛋白可通過磷酸化激活STAT3，調(diào)節(jié)凋亡、周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯。說明ROP16蛋白對(duì)不同腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用。

JAK/STAT3信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其在絕大多數(shù)人類腫瘤中呈異?；罨癄顟B(tài)。其中，STAT3 作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，被激活后以入核的方式，通過調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞周期、凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤及消化道腫瘤細(xì)胞增殖、使其凋亡減少，正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[11-12]。且在 60%肝癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)了 STAT3 表達(dá)升高[13]。目前已有研究表明，ROP16 蛋白可通過干擾人體 JAK/STAT3 信號(hào)通路,影響人體細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)亡等功能[14]。因此，本研究猜測(cè)，ROP16 可能參與了 JAK/STAT3 信號(hào)途徑的調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。STAT3 可誘導(dǎo)凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)，使 Caspase9 和 Caspase3 蛋白表達(dá)降低，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖；使其凋亡減少，并通過直接調(diào)節(jié) CyclinA1、CDK2、p21 等因子的表達(dá)，正向調(diào)控 MCF-7 細(xì)胞周期。而弓形蟲 ROP16 蛋白相當(dāng)于 JAK/STAT3 信號(hào)通路抑制劑，通過調(diào)節(jié) STAT3 細(xì)胞因子，使 MCF-7 細(xì)胞凋亡增加，增殖減少，并導(dǎo)致其 S 期細(xì)胞阻滯。

本實(shí)驗(yàn)探究了弓形蟲Ⅰ型 ROP16 蛋白對(duì)激素受體陽性乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的表型影響，從體外細(xì)胞水平證明 ROP16 可以誘導(dǎo) MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制其增殖并發(fā)生周期阻滯。后續(xù)計(jì)劃通過正常乳腺上皮 MCF-10 細(xì)胞、三陰性乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞及 HER2 陽性乳腺癌 SKBR-3 細(xì)胞，觀察 ROP16 對(duì)正常乳腺上皮及其它亞型乳腺癌細(xì)胞的影響及其具體機(jī)制。并進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞混懸液注射于實(shí)驗(yàn)裸鼠體內(nèi)，進(jìn)一步驗(yàn)證弓形蟲ROP16 蛋白對(duì)瘤體生長(zhǎng)是否有抑制作用。

綜上所述，弓形蟲Ⅰ型(RH 株)ROP16 蛋白可在人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞中表達(dá)，通過促進(jìn)JAK/STAT3 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白 STAT3 的磷酸化，誘導(dǎo) MCF-7 凋亡、抑制其增殖并引起細(xì)胞 S 期阻滯。此項(xiàng)研究為未來利用寄生蟲蟲體蛋白治療乳腺癌提供理想生物治療候選分子奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無