肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗中4-二甲氨基吡啶殘留量高效液相色譜檢測方法的建立及驗(yàn)證

李雙花，趙萍，田洪敏，李紅，董威，陳煜，鮑路偉，吳克

武漢博沃生物科技有限公司技術(shù)中心新型疫苗與重組蛋白湖北省工程實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075

肺炎球菌是肺炎、腦膜炎、中耳炎和鼻竇炎的主要病原菌，也是引起嬰幼兒和老年人發(fā)病及死亡的重要病因［1-3］。細(xì)菌莢膜多糖疫苗在預(yù)防由肺炎球菌、腦膜炎球菌、流感嗜血桿菌等引起的侵襲性疾病中均具有良好的效果［4-5］，但肺炎球菌莢膜多糖屬于非T 細(xì)胞依賴性抗原，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，多糖抗原不能對2 歲以下幼兒產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答［6］，而多糖-蛋白結(jié)合疫苗可將非 T 細(xì)胞依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門 細(xì)胞依賴性抗原，并在嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性和保護(hù)力［7-8］。

多糖-蛋白結(jié)合疫苗的關(guān)鍵有效成分是通過化學(xué)反應(yīng)方法將多糖抗原與載體蛋白共價結(jié)合制備，其制備工藝中常見的多糖活化劑包括溴化氰和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟化硼（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate，CDAP）。溴化氰可在水環(huán)境下幾分鐘內(nèi)完成活化過程，操作簡便，但毒性較大［9］。相比溴化氰，CDAP活化條件相對溫和，活化效率更高，而毒性卻低很多，因此近年來將CDAP用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗工藝制備中［10-12］。

CDAP 活化多糖后轉(zhuǎn)化為4-二甲氨基吡啶（4-dimethylamino pyridine，DMAP）［13-14］，相對于溴化氰，DMAP 是一種低毒性化合物，但仍具有毒性、刺激性，可損傷眼睛、皮膚、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等，危害人體健康。因此，控制和監(jiān)測多糖-蛋白結(jié)合疫苗中DMAP 殘留量，對于保障其質(zhì)量和使用安全性具有非常重要的意義。

目前DMAP 檢測的相關(guān)研究較少，有報道采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）法［15］和高效液相色譜（HPLC）法［16-18］進(jìn)行測定，其中GC-MS 法檢測靈敏度高，但方法較為繁瑣，且檢測成本較高；而HPLC 法具有操作簡便、專屬性強(qiáng)、檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)。但DMAP 是一種強(qiáng)極性堿性化合物，在常規(guī)反相色譜上無保留，無法實(shí)現(xiàn)與溶劑峰的分離。本研究建立了對色譜柱類型、流動相組成優(yōu)化后的HPLC 方法，以用于肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗中殘留DMAP 的檢測，并對優(yōu)化后的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1. 1 疫苗 肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結(jié)合疫苗（Pn 1、Pn 3、Pn 4、Pn 5、Pn 6A、Pn 6B、Pn 7F、Pn 9V、Pn 14、Pn 18C、Pn 19FA、Pn 19F、Pn 23F）購自武漢博沃生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 DMAP標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）、CDAP標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）、脫氧膽酸鈉（分析純）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）購自美國天地有限公司；庚烷磺酸鈉（分析純）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；磷酸、鹽酸（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；帶二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀（Agilent 1260）購自安捷倫科技（中國）有限公司；Sepax HPC18 色譜柱（5 μm，4. 6 mm × 250 mm）購自蘇州賽分科技有限公司；Ultimate Polar-RP 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）購自月旭科技（上海）股份有限公司；pH 計（FE20）購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 對照品儲備溶液配制 取DMAP對照品50 mg，用甲醇∶水= 90∶10（V／V）溶解并定容至50 mL，濃度為1 mg／mL。

1.3.2 對照品工作溶液配制 取對照品儲備溶液，分別用流動相稀釋至濃度為0.05、0.1、1、2和10 μg／mL。

1. 3. 3 供試品溶液配制 取1 mL 肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結(jié)合疫苗，加入100 μL 10%脫氧膽酸鈉溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），渦旋混勻，于冰水浴中放置30 min；取出后立即加入50 μL 鹽酸溶液（8.6%，V／V），渦旋混勻，16 250 ×g離心15 min，取上清液，用0.45 μm水系濾器過濾。

1.3.4 空白溶液 取1 mL去離子水，按照1.3.3項方法處理。

1.3.5 CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物處理 第1步中間產(chǎn)物制備（加入蛋白之前）：取Pn 19F 型肺炎球菌多糖溶液攪拌均勻，加入0.5 mg／mL CDAP 乙腈溶液，NaOH 調(diào) pH 至 9.5，攪拌均勻，0.45 μm 水系濾器過濾；第2 步中間產(chǎn)物制備（加入蛋白后）：取Pn 19F型肺炎球菌多糖溶液攪拌均勻，加入0.5 mg／mL CDAP乙腈溶液，NaOH 調(diào)pH 至9.5，持續(xù)攪拌2 min，加入 CRM197 蛋白溶液，NaOH 調(diào) pH 至 9. 5，攪拌均勻，0.45 μm水系濾器過濾。

1.4 色譜條件的優(yōu)化 以1 μg／mL DMAP對照品溶液為樣品，檢測波長：280 nm，流速：1 mL／min，進(jìn)樣體積：10 μL，柱溫：35 ℃。首先以 Ultimate Polar-RP（5 μm，4.6 mm ×250 mm）為色譜柱，分別考察0.1%氨水溶液（pH 8.0）-乙腈流動相體系、20 mmol／L 醋酸銨溶液（pH 6.5）-乙腈流動相體系、庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀（離子對試劑緩沖液）溶液-乙腈流動相體系對色譜保留和峰形影響；繼而考察了庚烷磺酸鈉濃度（5、10、15 mmol／L）、磷酸氫二鉀濃度（15、20、25 mmol／L）、離子對試劑緩沖液pH 值（2. 5、3. 0、3.5）、離子對試劑緩沖液與乙腈比例（85∶15、87∶13、89∶11）對色譜保留和峰形的影響；在選定的色譜條件下，考察不同色譜柱Sepax HP-C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）和Ultimate Polar-RP色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對色譜保留和峰形的影響。

1.5 方法的驗(yàn)證

1. 5. 1 專屬性 取1 μg／mL DMAP 對照品溶液、供試品溶液及空白溶液，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣檢測。

1.5.2 檢出限及定量限 將0.1 μg／mL DMAP 對照品工作溶液逐級稀釋，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣檢測，分別以信噪比3∶1 和10∶1 對照品溶液濃度為儀器檢出限和定量限，通過計算得出方法的檢出限和定量限。

1.5.3 線性 將對照品工作溶液按照1.4項優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣檢測，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計算相關(guān)系數(shù)。

1. 5. 4 準(zhǔn)確度 取2 種血清型肺炎球菌多糖-CRM-197 結(jié)合疫苗（Pn 19F 和Pn 4）為供試品，分別加入已知量的DMAP 對照品，3 個濃度水平加標(biāo)（Pn 19F：0. 060、0. 120、0. 180 μg／mL；Pn 4：0. 600、1. 200、1. 800 μg／mL），按照 1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測，每個加標(biāo)濃度水平平行加標(biāo)測定3 次，按下式計算加標(biāo)回收率。

加標(biāo)回收率（%）=實(shí)測值／理論值×100%

1.5.5 重復(fù)性及重現(xiàn)性 取Pn 6B 型肺炎球菌多糖-CRM197 結(jié)合疫苗為供試品，由1 名實(shí)驗(yàn)員在同一日期內(nèi)平行測定6 次，計算6 次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），即為方法的重復(fù)性；在不同實(shí)驗(yàn)室間、不同日期，由不同實(shí)驗(yàn)員平行測定24 次，計算24 次測定結(jié)果的RSD，即為方法的重現(xiàn)性。

1.6 方法的初步應(yīng)用 取13種不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結(jié)合疫苗及CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件檢測DMAP殘留量。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相組成及比例 氨水溶液-乙腈流動相體系、醋酸銨溶液-乙腈流動相體系下DMAP 有保留，但色譜峰拖尾，柱效低，而庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀溶液-乙腈流動相體系下，DMAP 不僅有保留，且峰形對稱，柱效高，見圖1。因此選擇庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀溶液-乙腈為流動相。綜合考慮DMAP保留時間、峰形和色譜柱的長期穩(wěn)定性，選擇流動相為5 mmol／L 庚烷磺酸鈉溶液（含20 mmol／L 磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)pH至3.0）∶乙腈 =87∶13（V／V）。

圖1 供試品及對照品溶液色譜圖Fig.1 HPLC profile of test sample and control solutions

2.1.2 色譜柱 Ultimate Polar-RP 色譜柱柱效低，壽命短；Sepax HP-C18 色譜柱柱效高，峰形對稱，且壽命長。因此選擇Sepax HP-C18色譜柱。

2.2 優(yōu)化后的色譜條件 色譜柱：Sepax HP-C18（5 μm，4. 6 mm × 250 mm）；流動相：5 mmol／L 庚烷磺酸鈉溶液（含20 mmol／L 磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)pH 至3. 0）∶乙腈 = 87∶13（V／V）；檢測波長：280 nm；流速：1 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：35 ℃。

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 供試品溶液中DMAP 色譜峰與對照品溶液主峰保留時間一致；供試品溶液中DMAP 色譜峰無雜質(zhì)干擾，其光譜圖與對照品溶液一致，歸一化后兩者完全重合；利用二極管陣列檢測器的峰純度鑒定功能得出，供試品溶液中DMAP 色譜峰純度為99.8%。見圖2。表明該方法不受供試品機(jī)制和前處理溶劑的干擾，專屬性強(qiáng)，是一種高選擇的分離方法。

圖2 對照品與供試品溶液中DMAP色譜峰光譜圖Fig.2 DMAP peaks in control and sample solutions

2.3.2 檢出限及定量限 方法的檢出限和定量限分別為3.6（S／N=4.4）和14.4 ng／mL（S／N=14.1）。

2. 3. 3 線性 DMAP 濃度在 0. 05 ～ 10 μg／mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y=1×107X+340 514，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2. 3. 4 準(zhǔn)確度 兩種血清型肺炎球菌多糖-CRM197結(jié)合疫苗各9份樣品的加標(biāo)回收率均在83%～105%之間，滿足痕量分析的準(zhǔn)確度要求，見表1。表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表1 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy

2.3.5 重復(fù)性及重現(xiàn)性 同一實(shí)驗(yàn)員同一日期對同一供試品平行6次測定結(jié)果的RSD為0.28%～0. 72%，不同實(shí)驗(yàn)員不同實(shí)驗(yàn)室間不同日期平行24 次測定結(jié)果的RSD為7.38%，見表2。表明該方法重復(fù)性和重現(xiàn)性較好。

表2 結(jié)合疫苗中DMAP殘留量的重復(fù)性和重現(xiàn)性（μg／mL）Tab. 2 Repeatability and reproducibility of residual DMAP content in conjugate vaccine（μg／mL）

2.4 方法的初步應(yīng)用 13 種不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結(jié)合疫苗中DMAP 殘留量為0. 135 ～ 1.635 μg／mL；CDAP 活化肺炎球菌多糖第一步中間產(chǎn)物即可檢測出DMAP，未檢測到CDAP，見圖3。表明CDAP 在pH 9.5 的堿性條件下活化多糖后可完全轉(zhuǎn)化為DMAP。

圖3 Pn 19F型多糖活化過程中間產(chǎn)物色譜圖Fig. 3 HPLC profile of intermediates in activation process of Pn polysaccharide of serotype 19F

3 討論

DMAP 是一種強(qiáng)極性的堿性化合物，在反相色譜分離模式下無保留，且峰形不佳。本研究建立了肺炎球菌多糖-CRM197蛋白結(jié)合疫苗中DMAP 殘留量的HPLC 測定方法，采用極性C18 色譜柱，離子對試劑為流動相。經(jīng)驗(yàn)證該方法專屬性好，供試品溶液中DMAP 色譜峰與對照品溶液主峰保留時間一致，且供試品中其他成分對檢測無干擾；該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，操作簡便，可有效檢測肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗中DMAP 殘留量，對疫苗的質(zhì)量控制及用藥安全具有重要意義。

有研究報道 CDAP 活化多糖有 2 種機(jī)理［14］，第 1種機(jī)理為CDAP 活化多糖羥基即生成多糖衍生物和DMAP，而第2 種機(jī)理是CDAP 活化多糖羥基后先生成多糖衍生物，加入蛋白后生成DMAP。本研究對CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，CDAP 在pH 9. 5 的堿性條件下活化多糖后可完全轉(zhuǎn)化為DMAP，即CDAP 活化多糖為第1 種活化機(jī)理，為肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合機(jī)理提供了依據(jù)。