李君一 袁福杰 劉科琳 王英
原發(fā)性急性閉角型青光眼(Primary acute angle closure glaucoma,PAACG)是我國原發(fā)性青光眼最常見的類型,病理性眼壓升高是急性閉角型青光眼(Acute angle closure glaucoma,AACG)首要的獨立危險因素。房水作為重要的眼內液,與血漿中蛋白相比,房水蛋白在質量與數量上與其存在一定差異。與以往觀念不同,當前研究認為房水(Aqueous humor,AH)中的蛋白不僅僅是由睫狀體的毛細血管濾過產生,局部組織分泌同樣參與了AH蛋白的生成[1]。近年來,一些研究認為青光眼房水中一些蛋白的改變參與了疾病的發(fā)病過程,與小梁網(Trabecular,TM)細胞外基質的重塑、炎癥反應、神經退行性疾病等相關[2-6]。本研究通過蛋白組學分析對眼壓高低不同的PAACG房水樣本進行檢測,探究眼壓高低不同的PAACG房水蛋白的差異表達?,F報告如下。
選取2019 年3 月至2020 年9 月期間于吉林大學第二醫(yī)院眼科中心入院治療的PAACG患者88例(88眼),按照術前眼情況分為A組[眼壓≥50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),36個樣本]和B組(眼壓≤21 mmHg,52 個樣本)。將上述A、B組樣本又分為2個隊列:發(fā)現隊列(A組,26個樣本;B組,37個樣本)和驗證隊列(A組,10個樣本;B組,15個樣本),分別通過數據獨立采集(Data-independent acquisition,DIA)方法和平行反應監(jiān)測(Parallel reaction monitor,PRM)分析房水蛋白。為了減少降眼壓藥物對房水蛋白組學的影響,所有PAACG患者均使用了布林佐胺滴眼液(比利時愛爾康公司)、酒石酸溴莫尼定滴眼液(愛爾蘭艾爾建公司)、卡替洛爾滴眼液(中國廣東大冢制藥有限公司)等降眼壓藥物進行治療。本研究遵循赫爾辛基宣言,并通過倫理委員會批準(2020044),所有患者均知情同意并簽署知情同意書。
所有患者行房水樣本采集前3 d,使用左氧氟沙星滴眼液(中國參天制藥公司)預防感染,手術準備過程中使用鹽酸奧布卡因滴眼液(中國參天制藥公司)行表面麻醉。在顯微鏡下使用1 ml胰島素注射器(舒銳,上海碧迪醫(yī)療器械有限公司)于前房中緩慢抽取約100 μl房水放入無菌EP管中,存貯至-80℃冰箱直至分析。所有的青光眼手術及房水采集過程均由同一經驗豐富、操作熟練的醫(yī)師完成。
1.3.1 蛋白提取 房水樣本使用3倍體積的乙醇沉淀過夜,然后在10 625 r/m離心30 min。將蛋白重新懸浮在裂解緩沖液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.1 mol/L二硫蘇糖醇和5 mmol/L Tris)中。通過Bradford方法進行蛋白質濃度的測定。
1.3.2 蛋白消化 蛋白樣本(50~200 μl)在95℃下用20 mmol/L二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)還原5 min 使蛋白變性,然后在溫室黑暗中用55 mmol/L碘乙酰胺烷基化45 min,再加入胰蛋白酶(1:50),在37℃下孵育過夜。消化后將所得肽進行高壓液相色譜(High-pressure liquid chromatography,HPLC)分離。
1.3.3 HPLC分離 采用高pH RPLC色譜柱(4.6 mm×250 mm,C18,3 μm;美國Waters公司)分離混合的肽樣品。將樣品加入到緩沖液A1(H2O,PH=10)中。洗脫梯度為5%~30%的緩沖液B1(90%乙腈,PH=10;流速,1 ml/min)持續(xù)30 min。每分鐘收集1 份洗脫的肽,將其凍干后,將30 個餾分重懸于0.1%甲酸中,用于液相色譜-質譜(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析。
1.3.4 LC-MS分析 Orbitrap Fusion Lumos tribrid質譜儀(德國Thermo Scientific公司)與EASY-nLC 1000 結合用于依賴數據采集質譜(Data-dependent acquisition,DDA-MS)和數據獨立采集-質譜(Data independent acquisition–mass spectrometry,DIAMS)模式下的質譜(Mass spectrometry,MS)分析。在RP C18自填充毛細管液相色譜柱(75 μm×100 mm,3 μm)上分離消化的肽。洗脫梯度為5%~30%緩沖液B2(0.1% 甲酸,99.9%乙腈;流速,0.3 μl/min),持續(xù)60 min。
1.3.5 光譜圖庫的建立及生成 以依賴數據采集(Data-dependent acquisition,DDA)模式分析了RPLC的30 個餾分。在DIA模式下分析每個單獨的樣品。使用Proteome Discoverer(德國Thermo Scientific公司)軟件處理DDA數據,并在附加了iRT融合蛋白序列(瑞士Biognosys公司)的人類SwissProt數據庫中進行搜索。將結果導入Spectronaut Pulsar(瑞士Biognosys公司)軟件中。
經濟全球化和貿易自由化正改變著我們的世界,當今人們處于一個世界性的人口、商品、財富、信息和思想的不斷交換之中,這種行為已然構成了復雜的全球性網絡[1-3].隨著全球化進程的不斷加快,世界各個國家和地區(qū)間的貿易活動更加頻繁,區(qū)域經濟系統(tǒng)間的相互依賴程度也不斷加大[4].
1.3.6 PRM質譜分析 在Triple TOF 5600上進行PRM分析。肽段的分離在RPC18自填充毛細管LC色譜柱(50 μm×500 mm,3 μm)上進行。洗脫的梯度為5%~30%的緩沖液B1(0.1%的甲酸,99.9%的乙腈;流速為0.3 μl/min),持續(xù)60 min。為了電離,使用2.10 kV的噴霧電壓和60℃的毛細管溫度。使用PRM采集模式監(jiān)控肽段,沿著完整的色譜運行對所有肽段標記物進行前體離子的MS/MS掃描,每個樣品運行2次。歸一化碰撞能量固定為35%,累積時間為300 s。
1.3.7 數據分析 采用Spectronaut Pulsar(瑞士Biognosys公司)以默認設置分析DIA-MS數據。Q值截止值為0.01對應[發(fā)現錯誤率(False discovery rate,FDR)為1%]過濾所有結果。對于PRM模式,使用Skyline軟件(版本3.5.0.9319)為所選的候選肽生物標記物選擇合適的m/z前體離子→m/z片段離子躍。
1.3.8 生物信息學分析 蛋白質分類是基于功能注釋進行的,使用基因本體論(Gene ontology,GO)對生物過程、分子功能和細胞定位進行蛋白質分類。此外,所有選擇的蛋白質均使用IPA軟件(美國Ingenuity Systems公司)進行網絡分析。
病例對照研究。采用Prism Graph Pad統(tǒng)計學軟件進行數據分析。采用獨立樣本t檢驗分析蛋白表達差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
對發(fā)現隊列中所有的房水樣本進行檢測,共發(fā)現636種蛋白質,通過質量控制分析即去除了50%的默認蛋白質和較高的變異系數(Coefficents of variability,CV)蛋白,獲得了506種蛋白質用于后續(xù)的分析。對2組樣本進行了聚類分析,在非監(jiān)督與監(jiān)督模式下,可觀察到A、B組具有較好的聚類趨勢。差異蛋白篩選標準:P<0.05,倍數變化>1.5。
在506種蛋白質,倍數變化>1.5且P<0.05的蛋白有51個,A/B表示患者房水中平均蛋白水平倍數變化。其中A組上調蛋白有17個,B組上調蛋白有34個。見圖1。
本研究對鑒定出的房水蛋白采用IPA軟件分析并進行GO功能注釋,發(fā)現隊列中A、B組所有差異蛋白主要參與了細胞進程、對刺激做出反應、代謝過程、生物調節(jié)過程、免疫調節(jié)等重要生物過程,見圖2。為了進一步了解眼壓高低不同對于房水中生化途徑的影響,我們進行了2組上調蛋白的對比分析。對比了發(fā)現隊列中A、B組差異蛋白表達,A組差異蛋白在代謝過程、多細胞組織過程、生物調節(jié)、對刺激做出反應等生物過程中表達明顯上調;B組差異蛋白在細胞過程、生物黏附、定位等生物過程中表達明顯上調,見圖3。
蛋白質-蛋白質相互作用網絡可看到差異蛋白主要與代謝性疾病、神經系統(tǒng)性疾?。ò柶澓DY)、脂質代謝性疾病相關。眾所周知,阿爾茲海默癥屬于淀粉樣變性疾病的一種,見圖4。房水中APOA2、CFB、CHI3L1、IGFBP6、IGHA2、MEGF10、PIK3IP1、PROS1、TIMP1和ADGRL1這幾種差異性蛋白均在淀粉樣變性疾病以及阿爾茲海默癥疾病中顯現出相關性。其中,與阿爾茲海默癥疾病相關的差異蛋白APOA2、CFB、CHI3L1、IGHA2、PROS1和TIMP1在A組表達上調,IGFBP6、MEGF10、PIK3IP1、ADGRL1在B組表達上調,見圖5—6。與脂質代謝疾病相關的差異蛋白有APOA2、ARSA、CARTPT、FBN1、NPC2,其中APOA2在A組表達上調,其余均在B組表達上調(紅色表示在A組中表達上調,綠色表示在B組中表達上調),見圖7。
圖1.發(fā)現隊列中A、B組房水差異蛋白基因名稱A組患者(眼壓>50 mmHg)房水中蛋白質有17種蛋白質水平表達上調(紅色),B組患者(眼壓<21 mmHg)房水中蛋白質有34種蛋白質水平表達上調(藍色)。差異表達為1.5倍變化Figure 1.The names of the differential protein genes in the aqueous humor between groups A and B found in the cohortThe expression of 17 proteins and in the aqueous humor of group A (IOP>50 mmHg) and group B patients (IOP<21 mmHg) was up-regulated (red) and upregulated (blue),respectively.The difference is expressed as a 1.5 fold change.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.
圖2.發(fā)現隊列中A、B組所有差異蛋白的生物學過程A組:眼壓>50 mmHg;B組:眼壓<21 mmHgFigure 2.The biological process of discovering all differential proteins in the two groups A and B of the cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.
圖3.發(fā)現隊列A、B組中差異蛋白生物學過程分析對比A組:眼壓>50 mmHg;B組:眼壓<21 mmHgFigure 3.Analysis and comparison of the biological process of differential proteins found in the two groups A and B of the cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.
驗證隊列(A組,10 個樣本;B組,15 個樣本)選取APOA2、LRP2、VASN、TIMPs進行對比驗證,研究結果顯示發(fā)現隊列與驗證隊列中結果保持一致,見圖8。
病理性眼壓升高是青光眼發(fā)病的首要危險因素,對青光眼患者AH中蛋白質組學的分析,有助于了解眼壓高低不同狀態(tài)下AH中差異蛋白的表達對于眼內微環(huán)境的影響。本研究中,我們通過對發(fā)現隊列中A、B組患者AH中的蛋白組的分析,顯示其中有51 種蛋白質存在差異表達,這些蛋白質與中樞神經系統(tǒng)性疾病、炎癥反應、脂質代謝等相關的功能網絡重疊。本研究認為2組不同眼壓的PAACG患者房水中發(fā)生的復雜蛋白質組變化將為尋找青光眼特定生物學靶標(用于疾病的預防以及相應治療策略)提供重要的實驗依據。
研究證實炎癥參與青光眼的發(fā)病以及視神經損傷[7-8]。本研究結果顯示發(fā)現隊列中A組患者房水中CHI3L1、CFB、C1RL、LYZ和CD163等差異蛋白表達上調,這些差異蛋白可通過級聯反應激活炎癥及免疫反應途徑,進一步造成眼內壓的升高及視神經損傷。
本研究中差異蛋白CHI3L1 在AD以及淀粉樣變性中均存在,CHI3L1是1種由局部產生及釋放的糖蛋白,可由中性粒細胞、單核巨噬細胞、癌細胞等產生,CHI3L1 被認為與急慢性炎癥反應、細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)重塑、血管生成等過程相關。Qiu等[9]的研究發(fā)現CHI3L1的過表達可以促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,并可以通過TGF-β信號通路參與ECM的調節(jié),促進纖維化。已有研究顯示在剝脫綜合征患者血清以及房水中已經發(fā)現CHI3L1表達水平上升,并認為其表達增高可能是纖維化過程中早期剝落物異常生成的觸發(fā)點[10-11]。
血管素是一種I型跨膜糖蛋白,在氧含量正常條件下,其水平較低。而在缺氧條件下血管素表達顯著增加,血管素水平升高可以誘導血管內皮細胞的遷移導致血管形成增加[12-14]。而青光眼患者在持續(xù)高眼壓狀態(tài)下,眼前節(jié)組織處于缺血缺氧狀態(tài),并且可在部分患者虹膜上觀察到新生血管的形成。
先前已有研究報道補體因子B(Complement factor B,CFB)在組織缺血及免疫過程中表達上調[15],本研究中發(fā)現隊列的A組患者房水中的CFB水平升高,可能與持續(xù)高眼壓狀態(tài)下,組織缺血引起細胞因子上調有關。CD163通常作為巨噬細胞的抗炎性標志物,參與細胞保護、組織修復重塑以及纖維化過程。Margeta等[16]研究對比了青光眼與正常對照組眼球解剖結構,發(fā)現CD163在經典流出途徑小梁網和Schlemm管周圍表達明顯上升,與對照組相比,早期及晚期青光眼視神經中CD163+巨噬細胞顯著增加,并形成軸突浸潤。
圖4.蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖Figure 4.Network analysis diagram of differential proteins and diseases
圖5.淀粉樣變性相關的差異蛋白在2組中的表達Figure 5.Different proteins related to amyloidosis in the two groups of proteins
圖6.阿爾茲海默癥相關的差異蛋白在2組中的表達Figure 6.Different proteins related to Alzheimer's disease in the two groups of proteins
圖7.脂質代謝相關的差異蛋白在2組中的表達Figure 7.Different proteins related to lipid metabolism in the two groups of proteins
氧化應激刺激是中樞神經系統(tǒng)退行性病變的重要發(fā)病機理,神經保護因子可通過抵抗氧化應激過程來保護神經元免受侵害。Jeon等[17]的研究表明IGFBP-6是重要的神經元存活因子,可以保護神經元細胞免受H2O2的氧化應激刺激。VGF神經生長因子是一種神經分泌的營養(yǎng)因子,具有神經保護作用。Takeuchi等[18]的研究顯示在視神經擠壓發(fā)生后的5~7 d內VGF神經生長因子的表達可能隨著神經膠質細胞的活化而上調。本研究中發(fā)現隊列中A組VGF神經生長因子的表達降低,這一改變可能是造成青光眼視神經損傷的原因之一。
糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B(Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B,GPNMB)主要在小膠質細胞中表達,是一種跨膜的蛋白。小膠質細胞的活化是許多神經退行性疾病的特征性表現,已有研究報道多種神經退行性疾病中發(fā)現GPNMB水平的升高[19]。GPNMB可通過激活神經膠質細胞分泌至細胞外并負調節(jié)炎癥反應來抑制炎癥反應和阻止神經元變性[20-21]。由此可見,增加GPNMB的水平可能是未來潛在的治療靶標。
IPA途徑分析顯示,發(fā)現隊列中A組蛋白質上調主要與免疫、炎癥途徑(LXR/RXR激活、急性期反應信號傳導)、動脈硬化等信號傳導途徑相關。其中LXR及RXR為核受體,參與脂質代謝、炎癥反應及將膽固醇轉化為膽汁酸,本研究中CARTPT、FBN1、NPC2,APOA2、LRP2等差異蛋白與脂質代謝相關[22-23]。
圖8.驗證隊列中A、B組患者房水中TIMP1、VASN、APOA2、LRP2的濃度比較A組:眼壓>50 mmHg;B組:眼壓<21 mmHgFigure 8.Comparison of the concentrations of TIMP1,VASN,APOA2,and LRP2 in the aqueous humor of patients in groups A and B in the validation cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.a,compared with patients in group A,P<0.05.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.
APOA2比APOA1的疏水性強,對脂蛋白代謝以及載脂蛋白穩(wěn)定性有更強的調節(jié)性,而脂蛋白的構象改變可增加淀粉樣變性的敏感度,在Yang等[24]構建的小鼠動物模型中APOA2在淀粉樣變性中起著至關重要的作用。
低密度脂蛋白受體相關蛋白受體2(Lipoprotein receptor-related protein 2,LRP2)是調節(jié)神經元生長和修復的重要細胞信號傳導介質,具有促進軸突的存活、軸突生長的作用,既往有研究報道LRP2的突變及缺失可能導致眼壓升高、視網膜神經節(jié)細胞密度降低以及視神經的軸突病變[25-27]。
FBN1的正常表達對維持房水正常流出具有重要的功能作用,FBN1與轉化生長因子β結合蛋白1(Latent transforming growth factor β-binding protein 1,LTBP-1)之間的相互作用對于ECM中潛在的TGF-β復合物穩(wěn)定起重要影響作用,FBN1 的表達下調嚴重影響復合物的穩(wěn)定,導致TGF-β的活化[28],致使房水流出減少。
有研究觀察表明CARTPT在神經興奮調節(jié)行為中起著積極作用,一些研究把CARTPT認定為人類內源性抗抑郁藥物,相較健康對照組腦脊液中CARTPT水平,重度抑郁癥患者顯著降低[29-30]。而青光眼作為一種身心性疾病,與正常健康對照組相比,青光眼患者患抑郁的風險顯著增高[31-32]。本研究結果顯示,發(fā)現隊列中A組患者房水中CARTPT表達顯著低于B組。
基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,M M P)可以降解E C M,減輕房水流出阻力,基質金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP)作為MMP的非選擇性抑制劑,可以通過1:1與MMP結合從而抑制其活性[33-34]。有研究報道,與白內障對照組相比,無論是POAG還是PACG患者,房水中均顯示TIMPs含量增加,MMP/TIMP比例失衡[35]。本研究中可以看到A組房水中TIMP1水平高于B組,表明在高眼壓持續(xù)狀態(tài)下,房水中TIMPs的表達上調導致ECM重塑,增加房水的流出阻力,形成惡性循環(huán),眼壓進一步升高。
綜上所述,PAACG眼壓升高可能與免疫炎癥反應以及小梁網細胞外基質重塑相關,青光眼可能與阿爾茲海默癥等神經退行性疾病一樣具有相似的神經損傷病理機制,除此之外,神經保護性蛋白的缺失可能會進一步加重視神經損傷。本研究也存在一些不足之處,我們對眼壓高低不同的PAACG患者房水差異蛋白進行了初步探討,但出于倫理及安全考慮未能夠將抗青光眼藥物對房水蛋白的影響排除在外,后續(xù)我們可通過相關的動物模型及細胞實驗展開進一步深入的探究。
利益沖突申明本研究無任何利益沖突
作者貢獻聲明李君一:參與選題、設計及相關文獻的分析和總結;撰寫論文;根據編輯部的意見進行修改。袁福杰:參與選題、設計及相關文獻的分析和總結。劉科琳:參與選題、設計和修改論文的結果結論。王英:參與選題、設計及相關文獻的分析和總結,修改論文中關鍵性結果、結論,根據編輯部的修改意見進行核修