自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞與彩色光瞳孔測量

沈士雅 竺慧 李蕊 李蕭蕭 劉虎

自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells,ipRGCs）是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的一個亞類，含有光敏蛋白——黑視蛋白（Melanopsin），故具有自主感光的特性，又稱為含黑視蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（Melanopsin-containing retinal ganglion cells,mRGCs）。ipRGCs位于視網(wǎng)膜內(nèi)層，胞體大、樹突長而分支稀疏，互相重疊、圍繞黃斑中心凹在視網(wǎng)膜上形成大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。除經(jīng)典光感受器（視桿和視錐細胞）外，ipRGCs構(gòu)成視網(wǎng)膜上第三類光感受器。ipRGCs通過將軸突直接投射到橄欖頂蓋前核（Olivary pretectal nucleus,OPN）以介導瞳孔對光反應（Pupillary light reflex,PLR）[2]；同時也投射至下丘腦視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）、膝狀體間小葉（Intergeniculate leaflet,IGL）等腦區(qū)，以調(diào)控晝夜節(jié)律、睡眠等功能[3-4]。

筆者主要對ipRGCs介導PLR的通路、視桿/視錐細胞和黑視蛋白引起的PLR特點、彩色光瞳孔測量方法及其在眼科疾病中的應用進行介紹總結(jié)，希冀為臨床上疾病的診斷和鑒別診斷提供新思路。

1 PLR主要由ipRGCs介導產(chǎn)生

最初在20世紀，Keeler[5]發(fā)現(xiàn)有嚴重外層視網(wǎng)膜變性、缺乏多數(shù)視錐和視桿細胞的小鼠仍有PLR。之后Freedman等[6]和Lucas等[7]發(fā)現(xiàn)完全沒有視錐、視桿細胞的小鼠也仍有PLR。到21世紀，黑視蛋白及表達黑視蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞被發(fā)現(xiàn)，人們開始不斷探索這類新細胞的潛在功能。研究發(fā)現(xiàn)，黑視蛋白基因敲除（但仍有ipRGCs細胞）小鼠的PLR出現(xiàn)減弱，但仍存在[8]；對缺乏視錐、視桿細胞的小鼠行黑視蛋白基因敲除，則PLR完全消失[9]；缺乏ipRGCs細胞的小鼠，其PLR將明顯減弱[10]。以上結(jié)果提示由視網(wǎng)膜到OPN的光信號主要是由ipRGCs介導傳遞，小部分可能由傳統(tǒng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞介導（見圖1）。

Belenky等[11]在小鼠中通過電子顯微鏡觀察到無長突細胞和雙極細胞的突觸在內(nèi)叢狀層中與ipRGCs的樹突相聯(lián)系，而無長突細胞和雙極細胞接受視桿和視錐細胞的信號輸入，證明ipRGCs可被來自視桿、視錐細胞的信號激活從而產(chǎn)生PLR。此外，ipRGCs所含的黑視蛋白也可直接感受光信號，產(chǎn)生PLR。

2 視桿/視錐細胞和黑視蛋白產(chǎn)生的PLR存在差異

首先，黑視蛋白對波長約480 nm的短波長藍光最為敏感，而視桿細胞的敏感波長約505 nm，長波長敏感視錐細胞（L cone）約567 nm，中波長敏感視錐細胞（M cone）約541 nm，短波長敏感視錐細胞（S cone）約445 nm[12]。其次，黑視蛋白對光的敏感程度不如視桿/視錐細胞。視桿細胞對低強度光敏感（6～7 log quanta·cm-2·s-1），視錐細胞對中等強度光敏感（10～11 log quanta·cm-2·s-1），而黑視蛋白對高強度（11～12 log quanta·cm-2·s-1）、連續(xù)的光敏感[2]。此外，黑視蛋白介導的PLR更為緩慢和持久。PLR包括瞬變收縮（Phasic response）和強直收縮（Tonic response）2個成分。瞬變收縮是指閃光刺激時或光照開始時發(fā)生的瞬時、大幅度的瞳孔收縮反應，主要由視錐和視桿細胞介導；強直收縮是指連續(xù)暴露于光照時發(fā)生的持續(xù)瞳孔收縮反應，在低至中等強度光照下主要由視桿細胞介導，在高強度光照下主要由黑視蛋白介導，目前視錐細胞對強直收縮的作用尚不明確[13-14]。光照停止后瞳孔由收縮狀態(tài)逐漸擴大的過程也存在瞬變和強直2個成分[15-16]。當暴露于紅光或低至中等強度的光照時，光照停止后瞳孔會快速恢復至原大?。划敱┞队谒{光或高強度的光照時，光照停止后瞳孔則緩慢恢復[17-18]。在盲人和視網(wǎng)膜外層功能缺陷的小鼠中，光照后的瞳孔快速恢復反應會缺失或明顯受損[15,19]。以上結(jié)果提示，光照停止后瞳孔的快速恢復反應受視桿/視錐細胞影響，而光照停止后瞳孔緩慢恢復反應主要由黑視蛋白引起，這種緩慢反應也被稱為光照后瞳孔反應（Postillumination pupillary response，PIPR）。

圖1.自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在瞳孔對光反射的傳入通路中發(fā)揮作用Figure 1.IpRGCs play a role in the afferent pathway of PLRIpRGCs,intrinsically photosensitive retinal ganglion cells;PLR,pupillary light reflex;OPN,olivary pretectal nucleus;E-W nucleus,Edinger-Westphal nucleus.

3 彩色光瞳孔測量法可評估視桿細胞、視錐細胞和含黑視蛋白的ipRGCs的功能

由于視桿細胞、視錐細胞和黑視蛋白產(chǎn)生的PLR各具特點，因此可利用不同光信號選擇性地刺激視桿細胞、視錐細胞和黑視蛋白以產(chǎn)生不同的PLR。視桿細胞對低強度光敏感，具有最低的激活閾值，敏感波長接近藍光，因此可在產(chǎn)生暗視覺的環(huán)境內(nèi)（亮度小于0.001 cd/m2）使用低強度的藍光檢測視桿細胞產(chǎn)生的PLR以評估視桿細胞功能；視錐細胞對光的敏感性低于視桿細胞，且主要對長波長的光敏感，因此在產(chǎn)生明視覺的環(huán)境內(nèi)（亮度大于3 cd/m2）使用紅光檢測視錐細胞產(chǎn)生的PLR以評估視錐細胞功能；黑視蛋白對光反應的激活閾值最高，且對短波長藍光敏感，因此可使用高強度藍光檢測黑視蛋白產(chǎn)生的PLR以評估含黑視蛋白的ipRGCs功能。以上即彩色光瞳孔測量法[也被稱為選擇性波長瞳孔測量法(Selective wavelength pupillometry）]的基本原理。其大概過程為：使用照明系統(tǒng)產(chǎn)生特定波長、強度、時長的光照，交替刺激瞳孔誘發(fā)PLR，同時使用紅外瞳孔測量儀實時采集瞳孔形態(tài)、記錄瞳孔直徑變化；以時間為橫軸、以瞳孔直徑為縱軸繪制曲線，利用該曲線來反映光照開始和停止后的瞳孔反應，評估每種類型光感受器的功能。目前使用的光刺激方案大致分為兩類：一類使用短時長光照（包括1 s、10 s和20 s等），另一類使用連續(xù)光照（大于30 s，光照強度呈階梯樣遞增或坡樣遞增）。有研究表明，光刺激前先進行暗適應有利于檢測視桿細胞介導的PLR，而在藍光背景下行紅光刺激有利于檢測視錐細胞相關(guān)的PLR，因為藍光背景可抑制黑視蛋白和視桿細胞活性[20]。

含黑視蛋白的ipRGCs功能主要通過光照停止后產(chǎn)生的PIPR進行評估。檢測PIPR時，最理想的光應為靠近黑視蛋白最敏感波長（約480 nm）的藍光，但只要光線強度足夠，任何波長的光均能產(chǎn)生PIPR[21]。有研究采用持續(xù)時間4 ms～30 s內(nèi)的光刺激誘發(fā)PIPR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)持續(xù)時間為1 s的光刺激可產(chǎn)生明顯的、穩(wěn)定的、持續(xù)時間長的PIPR，因此具有較高實用性[22]。在眾多用于定量測量PIPR的指標中，PIPR幅度（光照停止后特定時間點瞳孔縮小的程度，常用光照停止后第6秒）和平臺期PIPR（PIPR曲線達平臺期時瞳孔縮小的程度）變異性最小、可靠性最高[22]。

4 彩色光瞳孔測量在眼科疾病中的應用現(xiàn)狀

目前已有多項研究采用彩色光瞳孔測量法分析不同眼科疾病的視網(wǎng)膜光感受器功能改變，這些眼科疾病包括青光眼[23-29]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[30]、年齡相關(guān)性黃斑變性[31]、缺血性視神經(jīng)病變[32]和遺傳性線粒體視神經(jīng)病變[33-35]等。

盡管采用的彩色光瞳孔測量方案不同，但既往研究均顯示PLR，尤其是PIPR，在青光眼患者中存在改變。Kankipati等[23]用10 s的紅光（623 nm）及藍光（470 nm）分別刺激散瞳后的一只眼，記錄對側(cè)眼的瞳孔直徑變化，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，青光眼患者中PIPR顯著降低；青光眼視神經(jīng)病變程度越重，PIPR越弱。Adhikari等[24]對早期青光眼患者進行左眼散瞳處理，使用1 s的藍光（464 nm）和紅光（658 nm）交替刺激視網(wǎng)膜的部分象限，記錄右眼的瞳孔直徑變化，發(fā)現(xiàn)在早期青光眼患者中已經(jīng)出現(xiàn)了PIPR的改變。Najjar等[25]讓受試者單眼暴露于藍光（462 nm）2 min，然后再暴露于紅光（638 nm）2 min，在2 min的刺激過程中光強度以對數(shù)方式逐漸增加，記錄刺激眼的瞳孔收縮直徑變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，早期青光眼患者的瞳孔收縮幅度減??；這些變化也與青光眼帶來的結(jié)構(gòu)損傷相關(guān)，如視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度，在高光強（>12.5 log photons·cm-2·s-1）下，平均視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度與光照時瞳孔收縮幅度正相關(guān)。而視野評分與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度沒有相關(guān)性，說明在早期青光眼患者中，PLR可能更敏感地反映青光眼帶來的結(jié)構(gòu)損傷變化。Wang等[26]在青光眼患者和正常對照組中使用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)問卷評估了睡眠情況，發(fā)現(xiàn)青光眼患者的睡眠障礙患病率高于對照組。然而睡眠參數(shù)和PLR之間沒有相關(guān)性[27]。青光眼患者的睡眠和情緒障礙可能與ipRGCs介導的晝夜節(jié)律紊亂相關(guān)[28-29]。因此，彩色光瞳孔測量能夠有效反映青光眼產(chǎn)生的視神經(jīng)損傷程度，有可能作為評估青光眼病情進展的可靠工具。

Feigl等[30]在糖尿病患者中向右眼呈現(xiàn)10 s的488 nm和610 nm的彩色光照刺激，2種光照間隔5 min，記錄左眼的瞳孔直徑變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的PIPR出現(xiàn)減退，且糖尿病病程與PIPR呈負線性關(guān)系，提示ipRGCs功能隨著糖尿病病程的延長而逐漸降低。Maynard等[31]對晚期年齡相關(guān)性黃斑變性（Age-related macular degeneration,AMD）的研究中，使用10 s的紅光（604 nm）及藍光（448 nm）刺激散瞳后的一只眼，間隔55 s，記錄對側(cè)眼刺激3 s后瞳孔收縮幅度和刺激消失后6 s的PIPR幅度（%基線瞳孔直徑）。使用抑郁自評量表及匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)問卷計算抑郁評分和睡眠相關(guān)評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)晚期AMD患者有明顯的刺激3 s后瞳孔收縮減少及PIPR幅度降低，且PIPR幅度與患者的睡眠效率評分呈正相關(guān)。在前部缺血性視神經(jīng)病變（Anterior ischemic optic neuropathy,AION）患者中，Tsika等[32]使用暗適應后暗淡藍光刺激（464±26）nm、光適應后明亮紅光刺激（635±20）nm、光適應后明亮藍光刺激，光照強度以對數(shù)增加，先后刺激右眼及左眼。最后同時對雙眼進行1 s明亮紅光和藍光刺激，2次光刺激之間有一間隔，使得瞳孔在下一次光刺激前恢復到基線狀態(tài)，記錄患者的瞳孔直徑變化。發(fā)現(xiàn)受AION影響的眼睛在暴露于明亮藍色光后PIPR受損。然而在Leber遺傳性視神經(jīng)病變[33-34]及顯性視神經(jīng)萎縮病變[35]中，與健康對照組相比，雖然患者的視覺功能低下，但PLR功能，如藍光刺激時的瞳孔收縮、明亮藍光消失后的PIPR未見明顯受損，稱為瞳孔視覺分離現(xiàn)象（Pupilovisual dissociation）。而相關(guān)組織學研究也證明，Leber遺傳性視神經(jīng)病變和顯性視神經(jīng)萎縮中傳統(tǒng)的神經(jīng)節(jié)細胞大量丟失，而ipRGCs卻相對保留，這與彩色光瞳孔測量的結(jié)果互相印證[36]。

作為一種客觀、實用和快速的方法，彩色光瞳孔測量正被越來越多地用于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)相關(guān)疾病的研究中，在視網(wǎng)膜損傷的定位（位于內(nèi)層還是外層）中具有重要應用價值。除眼科疾病外，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茲海默癥中也有重要應用[37-38]。然而目前彩色光瞳孔測量法仍具有一些局限性。首先，彩色光瞳孔測量相關(guān)研究所使用的測量方案不盡相同、具有極大異質(zhì)性，不同研究的測量結(jié)果存在差異，這使得不同研究之間的可比性下降、部分結(jié)果缺乏可重復性，從而限制了彩色光瞳孔測量的臨床推廣與應用。在2017年第32屆國際瞳孔會議上，各國專家根據(jù)現(xiàn)有知識和經(jīng)驗制定出瞳孔測量的相關(guān)標準，并于2019年正式發(fā)表[21]。該標準中提出，行彩色光瞳孔測量相關(guān)研究時，應報告瞳孔測量設備的基本信息、視網(wǎng)膜的適應狀態(tài)、光刺激特征以及被檢查者的一般信息。其次，Crippa等[38]研究發(fā)現(xiàn)，雖然黑視蛋白對光的敏感性不受年齡影響，但外層視網(wǎng)膜對光照的敏感性似乎受年齡影響，兒童比成人需要更亮的紅光刺激才能引起視錐細胞相關(guān)的PLR。次外，視桿細胞、視錐細胞、黑視蛋白對PLR的貢獻仍未完全了解，且不能完全排除存在個體差異的可能性。最后，盡管彩色光瞳孔測量法可用于定位外層或內(nèi)層視網(wǎng)膜損傷，但是目前尚不能用于判定特定疾病類型。

但不可否認的是，在光照方案的充分標準化之后，彩色光瞳孔測量法能夠量化不同視網(wǎng)膜光感受器的功能，反映相關(guān)眼科疾病的病理變化，并對疾病的診斷和預后有潛在的預測價值。在動物實驗中，通過敲除或修改部分感光細胞的基因，可以實現(xiàn)ipRGCs與視錐、視桿細胞和其他非光敏視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的分離。但是在具有完整視網(wǎng)膜功能的人類受試者中難以分離ipRGCs與視錐、視桿細胞的作用。彩色光瞳孔測量法可選擇性地刺激人體內(nèi)不同視網(wǎng)膜光感受器，通過分析相應PLR改變可判斷視網(wǎng)膜功能的完整性，這一方法在未來很有可能成為眼科疾病和神經(jīng)退行性疾病損傷的特定標記方法。此外，彩色光瞳孔測量法操作簡單、快速，是一種非侵襲性的檢查手段，可用于群體的便攜式檢測，可能有助于篩查早期視神經(jīng)及視網(wǎng)膜功能障礙、追蹤疾病進展、判斷疾病預后，在臨床上有著巨大的應用前景，值得進一步研究。

5 小結(jié)

ipRGCs位于視網(wǎng)膜內(nèi)層，內(nèi)含黑視蛋白，是除視桿細胞、視錐細胞以外的第3 類光感受器細胞。ipRGCs可通過黑視蛋白直接感受光信號，也可被來自視桿、視錐細胞的信號激活，而后將信號傳導至OPN，產(chǎn)生PLR。視桿、視錐細胞和黑視蛋白產(chǎn)生的PLR存在差異。視桿、視錐細胞對光照敏感，主要產(chǎn)生快速PLR；黑視蛋白對光照不敏感，產(chǎn)生的PLR更為緩慢和持久。根據(jù)不同光感受器的敏感波長和反應閾值不同，開發(fā)出彩色光瞳孔測量法，可將PLR中視桿、視錐細胞及ipRGCs的貢獻區(qū)分開來，可用于評估視網(wǎng)膜或視神經(jīng)疾病中不同光感受器的功能完整性，從而定位視網(wǎng)膜損傷的位置。目前彩色光瞳孔測量法已在多種眼科疾病中得到應用，然而其具體方案有待進一步優(yōu)化完善。在未來，這種客觀、實用和快速的測量方法有可能成為眼科疾病和神經(jīng)退行性疾病損傷的特定標記方法，有望成為篩查早期視神經(jīng)及視網(wǎng)膜功能障礙、追蹤疾病進展、判斷疾病預后的可靠手段。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明沈士雅：課題設計，資料分析及解釋，撰寫論文，根據(jù)編輯部的修改意見進行修改；竺慧：參與選題、設計，修改論文并參與編輯部修改意見的修改。李蕊、李蕭蕭：參與選題、設計，修改論文；劉虎：參與選題、設計、資料的分析和解釋，參與修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，參與編輯部修改意見的修改，給予工作支持