血清中睪酮測定的能力驗(yàn)證研究

高飛，胡澤斌，于婷，董喆，黃杰

NIFDC-PT-319 血清中睪酮測定能力驗(yàn)證計(jì)劃是國家藥品監(jiān)督管理局項(xiàng)目，依據(jù) ISO/IEC 17043:2010《合格評定能力驗(yàn)證的通用要求》運(yùn)作，該計(jì)劃由中國食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)組織及實(shí)施。

睪酮的分子式組成為 C19H28O2，是由 19 個(gè)碳原子構(gòu)成的類固醇類荷爾蒙，分子量為 288.4。在人體循環(huán)系統(tǒng)中，大約 97% 的睪酮結(jié)合在人血漿蛋白中。其中，血液中的睪酮有 60% 與性激素結(jié)合球蛋白相結(jié)合，38% 與白蛋白相結(jié)合，2% 為游離狀態(tài)[1]。睪酮的水平對于人類胚胎發(fā)育、男性性腺的發(fā)育[2]、骨髓的造血功能及骨密度[3]等起到重要作用。在臨床中，血清中睪酮的測定主要被用于女性內(nèi)分泌失調(diào)[4-5]或者男性性功能障礙的輔助診斷[6]，其檢測的方法包括參考方法（如同位素稀釋質(zhì)譜法）和常規(guī)測定方法（如化學(xué)發(fā)光法）。

目前，我國已有多個(gè)睪酮檢測試劑盒獲得了國家藥品監(jiān)督管理局的上市批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。同時(shí)，基于體外診斷試劑注冊檢驗(yàn)、國家監(jiān)督抽驗(yàn)等檢驗(yàn)的發(fā)展，國內(nèi)多個(gè)醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)也已開展睪酮檢測的項(xiàng)目。因此，中國食品藥品檢定研究院組織實(shí)施了血清中睪酮測定能力驗(yàn)證計(jì)劃。通過本計(jì)劃，可客觀評價(jià)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室睪酮檢測的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 本次能力驗(yàn)證樣本有 3 份，為中國食品藥品檢定研究院研制，均為通過收集外觀清澈透明，無溶血、黃疸、乳糜的臨床血清，混合后分裝得到。其中 1 份真正的能力驗(yàn)證樣本的濃度為 3.67 ng/ml，并采用參考方法定值，并經(jīng)過均勻性和穩(wěn)定性分析，另外 2 份樣本為干擾樣本，濃度分別為 0.22 ng/ml 和 1.79 ng/ml。

1.1.2 試劑與儀器 睪酮測定試劑盒分別為吉林迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司、四川邁克生物股份有限公司和深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司產(chǎn)品；睪酮質(zhì)控品來自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所；睪酮校準(zhǔn)品為廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

化學(xué)發(fā)光測試儀為深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司產(chǎn)品；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)為美國 Waters 公司產(chǎn)品；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為吉林迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司和四川邁克生物股份有限公司產(chǎn)品；ADVIA?Centaur XPT 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為德國 Siemens公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 參加者報(bào)名 全國范圍內(nèi)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室通過登錄能力驗(yàn)證服務(wù)平臺進(jìn)行自愿報(bào)名（平臺網(wǎng)址為：http://223.71.250.33/Login.aspx）。共有 6 家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本能力驗(yàn)證項(xiàng)目，來自全國 4 個(gè)省（自治區(qū)）、直轄市的醫(yī)療器械檢驗(yàn)所/食品藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和企業(yè)實(shí)驗(yàn)室，詳見表1。其中檢驗(yàn)機(jī)構(gòu) 1 家（占 16.7%）；企業(yè)實(shí)驗(yàn)室 5 家（占 83.3%）。6 家實(shí)驗(yàn)室中 5 家采用商品化試劑盒，檢測方法為化學(xué)發(fā)光法，1 家為實(shí)驗(yàn)室自建高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。參加實(shí)驗(yàn)室所分配的樣本編號和濃度信息見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)室分布情況

表2 參加考核實(shí)驗(yàn)室分配樣本編號及濃度（ng/ml）信息

1.2.2 檢測步驟 參加者收到樣品后需按照以下步驟進(jìn)行檢測：①實(shí)驗(yàn)前取出樣品，恢復(fù)至室溫（20 ～ 25 ℃）后充分混勻待測；②檢測方法可采用參考方法或商品化試劑盒；③檢測儀器應(yīng)在儀器校準(zhǔn)合格有效期內(nèi)；④試劑配套的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品應(yīng)檢測通過；⑤每份能力驗(yàn)證樣本應(yīng)重復(fù)測定不少于 5 次并計(jì)算均值（保留 2 位小數(shù)）、測定值的變異系數(shù)（CV，%）及相對偏差（真正樣本的實(shí)測值與標(biāo)示值比值）。

1.2.3 結(jié)果反饋 實(shí)驗(yàn)室收到樣品后的 14 個(gè)工作日完成實(shí)驗(yàn)并在平臺上提交結(jié)果報(bào)告。同時(shí)將以下報(bào)送材料郵寄至聯(lián)系人，并務(wù)必向聯(lián)系人提交完整的電子版報(bào)送材料。報(bào)送材料包括：①結(jié)果報(bào)告單（加蓋公章）；②原始試驗(yàn)記錄（必須含試劑盒、校準(zhǔn)品、檢測儀器等關(guān)鍵信息以及檢測人員/負(fù)責(zé)人聯(lián)系方式）；③原始數(shù)據(jù)匯總表；④原始數(shù)據(jù)打印結(jié)果或截屏或復(fù)印件等（務(wù)必在結(jié)果數(shù)據(jù)旁用簽字筆標(biāo)注清楚結(jié)果所對應(yīng)的樣本信息）；⑤如采用商品化試劑盒，需提供試劑盒說明書，及試劑盒批號和有效期等信息。

1.2.4 防止串通措施 隨機(jī)賦予每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室一個(gè)代碼，最終的結(jié)果報(bào)告中均使用該代碼。每個(gè)代碼均代表一份隨機(jī)組合的樣本。

2 結(jié)果

2.1 不同單位對能力驗(yàn)證樣本的檢測結(jié)果

全部實(shí)驗(yàn)室均按要求如期提交了結(jié)果報(bào)告，有效數(shù)據(jù) 6份。變異系數(shù)及相對偏差的檢測結(jié)果見表3、表4 和表5。

2.2 結(jié)果分析

1 份真正樣本的血清睪酮標(biāo)示值為（3.67 ± 0.16）ng/ml（k= 2）。根據(jù)判定原則，測定值與標(biāo)示值的相對偏差應(yīng)在 ± 30.0% 范圍內(nèi)，且 3 份樣品的測定結(jié)果的 CV 值均應(yīng)不高于 10.0%，才認(rèn)為結(jié)果滿意。

全部數(shù)據(jù)中，4 家實(shí)驗(yàn)室的 1 份真正樣本血清睪酮測定值與標(biāo)示值的相對偏差結(jié)果滿足要求，其余 2 家（單位代碼分別為：227 和 435）的相對偏差結(jié)果均不在范圍內(nèi)，如表4 所示。其中，代碼為 227 的實(shí)驗(yàn)室采用的實(shí)驗(yàn)方法為高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，代碼為 435 的實(shí)驗(yàn)室采用的實(shí)驗(yàn)方法為化學(xué)發(fā)光法；6 家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的 CV 均滿足要求，除 1 家實(shí)驗(yàn)室的 3 號樣本 CV 值超過 9.0% 外，其余樣本的 CV 值均小于 5.0%，真正樣本的 CV 值在0.8% ～ 4.0% 之間，表明重復(fù)性整體結(jié)果滿意（表3）。最終獲得結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室為 4 家，滿意率為 66.7%，結(jié)果不滿意的實(shí)驗(yàn)室為 2 家，不滿意率為 33.3%（表5）。

表3 各參加實(shí)驗(yàn)室血清睪酮測定均值與 CV 值結(jié)果匯總

表4 各參加實(shí)驗(yàn)室血清睪酮測定均值與靶值的相對偏差結(jié)果匯總

表5 血清中睪酮測定能力驗(yàn)證結(jié)果表

本次能力驗(yàn)證的目的是考察各參加實(shí)驗(yàn)室對血清中睪酮的檢測能力，通過提交的數(shù)據(jù)和原始記錄等對結(jié)果中存在的部分問題進(jìn)行如下可能性分析：

⑴未按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作

單位代碼分別為 227 和 435 的兩家實(shí)驗(yàn)室沒有按照《NIFDC-PT-319 血清中睪酮測定能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；作業(yè)指導(dǎo)書中明確要求“實(shí)驗(yàn)前將所有樣品恢復(fù)至室溫，充分混勻后檢測”，而單位代碼為 435 的實(shí)驗(yàn)室提供的原始數(shù)據(jù)中并沒有將檢測樣本恢復(fù)至室溫這一項(xiàng)進(jìn)行記錄且最終報(bào)送的結(jié)果為不滿意。

⑵實(shí)驗(yàn)操作過程是否規(guī)范

單位代碼為 227 的實(shí)驗(yàn)室 3 號樣本的檢測結(jié)果分別為 0.319、0.371、0.372、0.410、0.397 ng/ml?？梢郧宄乜吹剑? 次結(jié)果間波動(dòng)比較明顯，導(dǎo)致 CV 超過 9.0%。對于產(chǎn)生這種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因，是儀器參數(shù)需優(yōu)化，還是操作人員的操作誤差所致，均需要實(shí)驗(yàn)室去查找原因進(jìn)行分析。對于可能的原因，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)并排查，以明確是隨機(jī)誤差還是系統(tǒng)誤差所導(dǎo)致的 CV 值較大。

⑶未重視標(biāo)準(zhǔn)化研究的重要性

部分實(shí)驗(yàn)室檢測所使用的檢測方法既沒有與國際上已有的血清睪酮同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行方法學(xué)的互換研究，也沒有基于上述測量原理對企業(yè)的樣本進(jìn)行賦值和溯源；而對于睪酮這類血清含量偏低、基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)較多的非肽激素類物質(zhì)而言，建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的基于國際或國內(nèi)參考測量程序的檢測方法尤為重要。

3 討論

化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法用于血清中睪酮的測量是目前國內(nèi)常用的睪酮檢測方法。根據(jù)國家臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（JCTLM）列表，目前國際上已有的血清睪酮參考方法主要有 3 種，分別由德國臨床化學(xué)會(huì) H1（DGKL）[7]、比利時(shí)根特大學(xué)[8]和美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）[9]建立，檢測原理均為同位素稀釋質(zhì)譜法。本次能力驗(yàn)證所采用的真正樣本正是基于此測量原理進(jìn)行賦值。

在血清睪酮的測定中，如何準(zhǔn)確測量復(fù)雜基質(zhì)中的微量物質(zhì)是難點(diǎn)之一，而國際上所采用的特異性的同位素稀釋質(zhì)譜法在進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件后可達(dá)到減少同分子量化合物對分析影響的結(jié)果。因此，建議部分實(shí)驗(yàn)室參考國際參考測量程序優(yōu)化各自的檢測方法。

綜上所述，建議各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下方面：①定期確認(rèn)實(shí)驗(yàn)儀器的參數(shù)及性能指標(biāo)是否滿足不同樣本的檢測需求，定期采用效期內(nèi)的試劑對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)；②采用國際或國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對各自的試劑盒或自建方法進(jìn)行準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行結(jié)果分析；③加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化研究，在建立方法時(shí)應(yīng)盡量基于參考測量程序以便使樣本的賦值具有可溯源性；④建議結(jié)果不合格的實(shí)驗(yàn)室參加測量審核。