多聚長效抗菌膜液材（敷）料裂解細(xì)菌生物膜的作用研究

田爽，倪朝輝，趙雪利，胡治，羅建良，宋柏杉，楊欣，黃紅蘭

細(xì)菌黏附材料表面并形成生物膜，可造成植入物的失敗或患者感染。目前，多釆用添加傳統(tǒng)抗菌劑來制備抗菌材料，例如，抗生素、金屬及其鹽、季銨鹽化合物、聚六亞甲基雙胍等，而這些方法存在一定的弊端。比如浸出的抗生素和重金屬，被摻入到聚合物表面逐漸釋放，增加微生物對(duì)抗菌劑的耐受性；次致死劑量的抗生素加劇生物膜的形成；生物大分子和死亡微生物聚集在聚合物表面，阻止抗菌功能團(tuán)發(fā)揮作用等。因此，需要尋找一種新型的抗菌材料或抗菌改性方法。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料是一種新型復(fù)方生物材料，是通過多元接枝改性技術(shù)合成的第七代季銨鹽聚合物產(chǎn)品。區(qū)別于臨床現(xiàn)有的一過性殺菌產(chǎn)品，通過生物工程的接枝改性技術(shù)，對(duì)原有各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾，各組分通過多次的基團(tuán)替換和關(guān)聯(lián)嫁接，改變了原有各成分的屬性和關(guān)系，優(yōu)化了分子結(jié)構(gòu)，使其具有長效抗菌的能力，很好地阻斷創(chuàng)面病原微生物的侵襲與定植，用于皮膚及黏膜創(chuàng)面感染的預(yù)防和輔助治療，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1]。

細(xì)菌的生物膜是一些細(xì)菌附著并包埋于創(chuàng)面，與細(xì)胞外基質(zhì)等形成的一種膜性結(jié)構(gòu)，是創(chuàng)面難愈或不愈的一種新機(jī)制[2]。本研究觀察了多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、白念珠菌形成的生物膜的裂解作用，為臨床治療細(xì)菌生物膜感染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 由太信太德生物醫(yī)學(xué)工程（湖南）有限公司生產(chǎn)的多聚長效抗菌膜液材（敷）料，商品名：捷克信；產(chǎn)品批號(hào)：202104271-1。銀離子抑菌劑（生產(chǎn)批號(hào)：20122113）和碘伏（生產(chǎn)批號(hào)：200621）作為陽性對(duì)照藥物，購自長春希凱科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、白念珠菌均自臨床標(biāo)本中分離，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 儀器設(shè)備 SW-CJ-1F 型凈化工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；YA28X-4T/10JL 高壓蒸汽滅菌器購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHP060 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；PC5515R 臺(tái)式高速離心機(jī)和 AX223ZH 型分析天平購自奧豪斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌，接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于 37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，160 r/min 4 h，使細(xì)菌濃度達(dá)到 9 × 108CFU/ml[3]。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用倍比稀釋法測(cè)定捷克信、碘伏、銀離子的 MIC[4]。無細(xì)菌生長的藥物最高稀釋度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 細(xì)菌生物膜形成周期測(cè)定 將稀釋后的菌液加入到放有細(xì)胞爬片的 6 孔板中，37 ℃ 培養(yǎng)，每 24 小時(shí)換液一次。通過結(jié)晶紫染色測(cè)定 12、24、36、48 h 每種菌生物膜的形成情況[5]。

1.2.4 裂解細(xì)菌生物膜試驗(yàn) 將稀釋后的菌液加入到放有細(xì)胞爬片的 6 孔板中。肺炎克雷伯菌37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 48 h，其余菌連續(xù)培養(yǎng) 24 h。在已形成生物膜的 6 孔板中加入 2 ×MIC 濃度的碘伏、捷克信、銀離子，37 ℃ 培養(yǎng)8 h。通過結(jié)晶紫染色以及活菌計(jì)數(shù)觀察碘伏、捷克信、銀離子裂解已形成的生物膜的能力[5]。

2 結(jié)果

2.1 多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度

采用倍比稀釋法測(cè)定多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌以及金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌混合液、金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合液的 MIC，銀離子與碘伏作為陽性對(duì)照，如表1 所示。

表1 多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）（mg/L）Table 1 The MIC of JEK SUNG against bacteria (mg/L)

2.2 細(xì)菌生物膜形成周期測(cè)定

細(xì)菌在六孔板上形成生物膜的情況如圖1 所示，金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌的生物膜在 24 h 時(shí)形成的形態(tài)最好，肺炎克雷伯菌的生物膜在 48 h 時(shí)形成的形態(tài)最好。

2.3 裂解細(xì)菌生物膜結(jié)果

2.3.1 結(jié)晶紫染色觀察 向已培養(yǎng)的生物膜樣品中加入 2 × MIC 濃度的碘伏、捷克信、銀離子，37 ℃ 培養(yǎng) 8 h。結(jié)晶紫染色顯示，捷克信可以有效裂解已形成的生物膜（圖1）。對(duì)金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌形成的生物膜裂解效果較明顯。

圖1 捷克信裂解細(xì)菌生物膜Figure 1 JEK SUNG lytic bacterial biofilm

2.3.2 活菌計(jì)數(shù)觀察 將細(xì)胞爬片洗脫的菌液做倍比稀釋后，涂布于 NA 固體平板上，37 ℃ 培養(yǎng)18 ～ 20 h，取菌落數(shù)為 30 ～ 300 之間的平板計(jì)算活菌數(shù)。結(jié)果如圖2 所示，捷克信可以有效裂解生物膜中的細(xì)菌，其中裂解金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌的效果顯著，與細(xì)菌對(duì)照組比較，差異顯著。

圖2 捷克信裂解細(xì)菌生物膜（活菌計(jì)數(shù)）Figure 2 JEK SUNG lytic bacterial biofilm (viable count)

3 討論

多聚長效抗菌膜液材（敷）料是一種新型復(fù)方生物材料，是通過多元接枝改性技術(shù)對(duì)原有各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，優(yōu)化了分子結(jié)構(gòu)，起到了多組分聚合協(xié)同增效的作用，從而全面提升了產(chǎn)品的臨床療效[6]。

前期研究顯示，多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌有抑制作用[1]。在此基礎(chǔ)上，本研究探討了多聚長效抗菌膜液材（敷）料裂解細(xì)菌生物膜的作用。

通過形態(tài)學(xué)和生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)顯示，多聚長效抗菌膜液材（敷）料對(duì)金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌混合感染以及金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果較明顯。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌、MRSA 以及金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果，與陽性對(duì)照藥物銀離子比較，差異顯著。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料中，有機(jī)硅季銨鹽以化學(xué)鍵方式附著和固定在組織的表面，通過有機(jī)硅的接枝聚合形成交聯(lián)膜，改變細(xì)菌胞壁的通透性，使菌體內(nèi)的酶、輔酶和代謝中間產(chǎn)物溢出，致使微生物發(fā)生“接觸死亡”；聚季銨鹽-1 破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出；殼聚糖季銨鹽破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，改變菌體的 pH 環(huán)境[7]，從而殺死生物膜中的細(xì)菌。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料在體外實(shí)驗(yàn)中裂解細(xì)菌生物膜的形成，為臨床上使用細(xì)菌生物膜感染的防治提供了理論依據(jù)。