1.5GHz微波輻射對大鼠外周血免疫細胞和脾臟組織影響的量效關(guān)系研究

董霽，姚傳福，管淑婷，王惠，王浩宇，張靜，徐新萍，姚斌偉，周紅梅，趙黎，彭瑞云

近年來，隨著技術(shù)的不斷進步和突破，微波已被廣泛應(yīng)用于通訊、醫(yī)療、化學(xué)合成、消毒等諸多領(lǐng)域。但同時，也使得大量的職業(yè)人群和非職業(yè)人群更多地暴露于微波輻射環(huán)境中，因此，人們對于微波輻射造成的潛在健康風(fēng)險的擔(dān)憂也日益增加[1-3]。大量研究報道提示，微波輻射可通過熱和非熱效應(yīng)損傷機體多個系統(tǒng)[4-8]。L 波段微波（1.0 ～2.0 GHz）被廣泛應(yīng)用于無線電通訊中，但其對機體影響的研究缺乏。

免疫系統(tǒng)是機體抵御外源刺激的第一道防線，在維持機體穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的作用。研究表明，免疫細胞是電離輻射和非電離輻射的敏感靶細胞[5]。相對于電離輻射，非電離輻射對免疫細胞的影響仍然存在很大的爭議[9-12]。因此，本研究采用1.5 GHz 微波輻射大鼠，探討不同功率密度條件下，大鼠免疫組織和相關(guān)細胞的變化，明確免疫系統(tǒng)損傷的特征和量效關(guān)系，為微波輻射致免疫系統(tǒng)損傷的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 石蠟購自德國 Leica 公司；二甲苯、高錳酸鉀、升汞甲醛、脫鈣液等購自國藥集團；中性樹膠、蘇木素染色液、伊紅染色液等購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）小鼠抗大鼠 CD45 抗體、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）小鼠抗大鼠 CD3 抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）小鼠抗大鼠 CD45R 抗體、PE 小鼠抗大鼠 CD45抗體、APC 小鼠抗大鼠 CD3 抗體、FITC 小鼠抗大鼠 CD161a 抗體、APC 小鼠抗大鼠 CD3 抗體、FITC 小鼠抗大鼠 CD4 抗體、PE 小鼠抗大鼠CD8a 抗體等購自 Biolegend 公司（中國）。Cytokine&Chemokine 22-Plex Rat ProcartaPlex Panel購自美國 Thermo Fisher 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 高速離心機為德國 Eppendorf公司產(chǎn)品；水平低速離心機為 Monad 公司產(chǎn)品；全自動脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機、烤片機和光學(xué)顯微鏡為德國 Leica 公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡為日本 Hitachi 公司產(chǎn)品；全自動血細胞分析儀為日本 Sysmex 公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國BD 公司產(chǎn)品；多功能液相芯片分析平臺為美國Luminex 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 80 只二級雄性 Wistar大鼠，體重（180 ± 20）g，購自維通利華，合格證號 SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心。根據(jù)微波輻射平均功率密度隨機分為 4 組，分別為：假輻射組（Sham 組），5 mW/cm2微波輻射組（L5），30 mW/cm2微波輻射組（L30）和50 mW/cm2微波輻射組（L50），每組 20 只大鼠。

1.2.2 微波輻射 采用本院微波輻射系統(tǒng)[13-14]，大鼠置于有機玻璃圓盤中，輻射臺勻速旋轉(zhuǎn)以確保全身均勻輻射。微波輻射頻率為 1.5 GHz、平均功率密度分別為 5、30 和 50 mW/cm2，輻射時間為6 min。假輻射組處理方法同微波輻射組，但不予微波暴露。

1.2.3 大鼠外周血細胞分析 分別于輻射后 6 h、7 d 和 14 d，采用 1% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主靜脈取血 0.5 ml，置于肝素抗凝管中，采用全自動血細胞分析儀檢測外周血中白細胞（white blood cell，WBC）、淋巴細胞、中性粒細胞的數(shù)目。

1.2.4 大鼠外周血淋巴細胞亞群分析 按照上述方法收集抗凝外周血，取 100 ～ 200 μl 置于流式檢測管中，按照下述模塊加入相應(yīng)的抗體各 1.0 μl。模塊 1：T 淋巴細胞和 B 細胞淋巴比例（PE 抗大鼠 CD45 抗體、APC 抗大鼠 CD3 抗體、FITC抗大鼠 CD45R 抗體）；模塊 2：NK 細胞比例（PE 抗大鼠 CD45 抗體、APC 抗大鼠 CD3 抗體、FITC 抗大鼠 CD161a 抗體）；模塊 3：T 淋巴細胞亞型（APC 抗大鼠 CD3 抗體、FITC 抗大鼠 CD4 抗體、PE 抗大鼠 CD8a 抗體）。經(jīng)流式細胞儀檢測各細胞亞群百分比。

1.2.5 大鼠外周血清細胞因子濃度檢測 按照上述方法收集外周血（不抗凝），分離血清，采用Cytokine&Chemokine 22-Plex Rat ProcartaPlex Panel，于多功能液相芯片分析平臺檢測多種免疫細胞因子，包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A 和 TNF-α 等濃度。

1.2.6 大鼠脾臟和骨髓組織結(jié)構(gòu)觀察

1.2.6.1 光鏡觀察 于微波輻射后 6 h、7 d 和14 d，分離大鼠脾臟組織和胸段椎骨。將脾臟組織置于 10% 福爾馬林溶液固定 3 周后，進行病理制片和蘇木精-伊紅（HE）染色。將胸段椎骨采用Helly 液固定 24 h 后，置于 10% 福爾馬林溶液固定 3 周，取材后在脫鈣液中浸泡 3 周，待骨組織軟化透明，進行病理制片和 HE 染色。組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6.2 電鏡觀察 取微波輻射后 7 d 的脾臟組織 1 mm2，置于 2.5% 戊二醛磷酸緩沖固定液中固定過夜，0.1 mol/L 磷酸緩沖液沖洗后，采用 1%鋨酸固定并用雙蒸水沖洗。經(jīng)梯度乙醇脫水，丙酮和包埋液浸透包埋后，制作半薄切片和 HE 染色，采用光學(xué)顯微鏡定位組織，并制作超薄切片。經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛負染后，在透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

文中的數(shù)據(jù)均以±s表示，統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 6.0 軟件，采用兩因素多水平方差分析進行整體分析，采用t檢驗進行兩兩比較分析。

2 結(jié)果

2.1 1.5 GHz 微波輻射減少大鼠外周血中免疫相關(guān)細胞的數(shù)量

為了明確微波輻射后外周血免疫細胞的波動，首先分析了輻射后外周血中免疫相關(guān)細胞的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.5 GHz 微波輻射可在輻射后 6 h 和7 d 減少 WBC 和淋巴細胞的數(shù)量（P＜ 0.05），輻射后 14 d 恢復(fù)（圖1A 和圖1B）。但是，微波輻射對大鼠外周血中性粒細胞的數(shù)量無顯著影響（圖1C）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，輻射后 6 h 和7 d，L5 和 L50 組，WBC 和淋巴細胞的數(shù)量略低于L30 組。上述結(jié)果表明，不同平均功率密度的微波輻射對外周血免疫相關(guān)細胞數(shù)量影響不一，可能是輻射損傷及機體自我修復(fù)機制共同作用的結(jié)果。

圖1 1.5 GHz 微波輻射后大鼠外周血免疫相關(guān)細胞數(shù)量變化（A：白細胞；B：淋巴細胞；C：中性粒細胞；與 Sham 組相比，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001）Figure 1 The alterations of immune cells in peripheral blood after 1.5 GHz microwave exposure (A: White blood cells; B:Lymphocytes; C: Neutrophils; *P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001 vs Sham)

2.2 1.5 GHz 微波輻射動態(tài)調(diào)節(jié)大鼠外周血淋巴細胞亞群

由于外周血淋巴細胞對于微波輻射的敏感性，分析了不同亞群淋巴細胞的動態(tài)變化規(guī)律，包括 B淋巴細胞、T 淋巴細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）等。輻射后 6 h、7 d 和 14 d 的流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，5 mW/cm2微波輻射對B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞的比例無顯著影響，而30 和 50 mW/cm2微波輻射可顯著提升 B 淋巴細胞的比例，并下調(diào) T 淋巴細胞的比例。同時，微波輻射對 B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用與平均功率密度相關(guān)（圖2A ～ B）。與 Sham 組相比，各輻射組 NK 細胞于輻射后 6 h 顯著上調(diào)（P＜ 0.001）（圖2C）。此外，還進一步分析了 T 淋巴細胞亞群，包括 CD4+T 淋巴細胞和 CD8+T 淋巴細胞的變化，結(jié)果顯示，微波輻射對 T 淋巴細胞亞群并無顯著影響（圖3D）。上述結(jié)果提示，1.5 GHz 微波輻射后，機體 B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞亞群呈現(xiàn)劑量依賴性的調(diào)節(jié)，以維持機體免疫平衡。

圖2 1.5 GHz 微波輻射后大鼠外周血淋巴細胞亞群的變化（A：B 淋巴細胞；B：T 淋巴細胞；C：NK 細胞；D：CD4+T與 CD8+T 的比值；與 Sham 組相比，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與 L5 組相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001）Figure 2 The subtypes of lymphocytes in peripheral blood after 1.5 GHz microwave exposure (A: B lymphocytes; B: T lymphocytes; C: NK cells; D: The ratio of CD4+ T lymphocytes to CD8+ T lymphocytes; ** P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Sham; #P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01, ###P ＜ 0.001 vs L5)

2.3 1.5 GHz 微波輻射促進多種細胞因子的表達

細胞因子在促進淋巴細胞和多種免疫細胞增殖、分化和活化過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究分析了與 B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞增殖和活性密切相關(guān)的細胞因子，包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A 和 TNF-α 的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射后6 h 和 7 d，5 mW/cm2微波輻射后細胞因子無顯著改變，而 30 mW/cm2和 50 mW/cm2微波輻射后細胞因子表達顯著上調(diào)（P＜ 0.05）。其中，輻射后6 h，50 mW/cm2微波輻射對細胞因子的上調(diào)作用強于 30 mW/cm2微波輻射；但輻射后 7 d，兩組之間無顯著差異（圖3）。上述結(jié)果與外周血中B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞的動態(tài)變化規(guī)律一致，表明 30 mW/cm2和 50 mW/cm2微波輻射后，機體通過動態(tài)調(diào)節(jié)機體的免疫平衡，可以達到修復(fù)免疫系統(tǒng)損傷的目的。

圖3 1.5 GHz 微波輻射后大鼠血清細胞因子水平變化（A：IL-2；B：TNF-α；C：IL-4；D：IL-6；E：IL-17A；與 Sham 組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與 L5 組相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；與 L30 組相比，$$P ＜ 0.01，$$$P ＜ 0.001）Figure 3 The secretion of cytokines in serum after 1.5 GHz microwave exposure (A: IL-2; B: TNF-α; C: IL-4; D: IL-6; E: IL-17A;*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Sham; # P ＜ 0.05, ## P ＜ 0.01, ### P ＜ 0.001 vs L5; $$P ＜ 0.01, $$$P ＜ 0.001 vs L30)

2.4 1.5 GHz 微波輻射劑量依賴地損傷大鼠脾臟組織

平均功率密度為 5、30 和 50 mW/cm2的1.5 GHz 微波輻射大鼠后，采用光鏡觀察脾臟和骨髓的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，微波輻射可引起脾臟組織損傷，輻射后 6 h 損傷出現(xiàn)，以輻射后 7 d 損傷最重，輻射后 14 d 呈恢復(fù)趨勢。以輻射后 7 d為例，Sham 組脾臟組織脾小體完整，細胞增殖旺盛，而各輻射組則出現(xiàn)不同程度的血管淤血、淋巴細胞核碎裂等改變，且隨著平均功率密度的增加，組織損傷呈現(xiàn)加重趨勢。但微波輻射對骨髓組織結(jié)構(gòu)無顯著影響，表現(xiàn)為骨髓結(jié)構(gòu)完整、骨小梁排列整齊，血細胞豐富（圖4A ～ B）。

圖4 1.5 GHz 微波輻射后 7 d 大鼠脾臟和骨髓組織結(jié)構(gòu)、脾臟超微結(jié)構(gòu)變化[A：骨髓組織結(jié)構(gòu)（Scale bar = 50 μm）；B：脾臟（Scale bar = 50 μm）；C：脾臟組織超微結(jié)構(gòu)（Scale bar = 500 nm）]Figure 4 The histopathological analysis of rats′ spleen and bone marrow at 7 d after 1.5 GHz microwave exposure [A: Bone marrow (Scale bar = 50 μm); B: Spleen (Scale bar = 50 μm); C: The ultrastructure analysis of spleen (Scale bar = 500 nm)]

進而，通過 TEM 觀察脾臟組織超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Sham 組脾臟組織淋巴細胞胞核、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)完整，L5 組可見線粒體腫脹、嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，L30 組可見線粒體腫脹、嵴斷裂、甚至消失，L50 組可見線粒體空化明顯，同時胞漿胞核凝固、溶酶體增多等（圖4C）。上述結(jié)果提示，微波輻射可劑量依賴地損傷脾臟組織。

3 討論

微波技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人們的日常生活中，微波輻射引起的健康危害越來越受到關(guān)注[12-21]。既往研究主要以神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等為重點，揭示了不同波段微波的損傷效應(yīng)[22-24]。由于免疫系統(tǒng)是機體抵抗外源危險信號的第一道防線，能快速啟動反應(yīng)，因此對于免疫系統(tǒng)損傷效應(yīng)也逐步開展，主要以 S 波段微波輻射大小鼠，明確了其對外周血細胞的影響，同時發(fā)現(xiàn)微波輻射可顯著降低 NK-92 細胞的殺傷活性并誘導(dǎo)其凋亡[25]。但目前，微波輻射對免疫損傷效應(yīng)的研究仍然較少，且研究結(jié)果存在爭議[9-12]。

L 波段微波是通訊系統(tǒng)中常見的微波頻段，其對機體的影響研究缺乏。本課題組前期已經(jīng)成功建立了 1.5 GHz 微波輻射損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)了其可損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶和工作記憶，并明確致傷機制[23,26]。但 L 波段微波對免疫系統(tǒng)的研究未見報道。此外，我們前期研究了不同功率密度 S 波段微波的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)平均功率大于 5 mW/cm2的微波輻射可造成明顯的損傷效應(yīng)[14]。因此，本研究以 5、30 和 50 mW/cm2等不同平均功率密度的1.5 GHz 微波輻射大鼠，發(fā)現(xiàn)該輻射損傷模型未引起大鼠體溫的變化（數(shù)據(jù)未顯示），表明該條件下存在非熱效應(yīng)。1.5 GHz 微波輻射可造成大鼠外周血 WBC 和淋巴細胞數(shù)量下降，于輻射后 7 d減少最為明顯，于輻射后 14 d 恢復(fù)，表明微波輻射可造成免疫相關(guān)細胞可逆性損傷；大鼠脾臟組織損傷，且于輻射后 7 d 損傷最重，而后逐步恢復(fù)，表明微波輻射可損傷機體免疫器官。此外，30 和50 mW/cm2微波輻射刺激下，可劑量依賴地上調(diào)B 淋巴細胞比例和下調(diào) T 淋巴細胞比例，并通過調(diào)節(jié)細胞因子含量，以穩(wěn)定機體免疫平衡，促進免疫修復(fù)。因此，上述結(jié)果提示 1.5 GHz 微波輻射可導(dǎo)致機體免疫損傷效應(yīng)，且不同功率密度下的機體損傷修復(fù)機制不同。

綜上所述，1.5 GHz 微波輻射可致大鼠外周血WBC 和淋巴細胞數(shù)量下降，B 淋巴細胞比例上調(diào)、T 淋巴細胞比例下調(diào)，B 和 T 淋巴細胞增殖與活化相關(guān)細胞因子的含量增加；脾臟組織損傷。同時，脾臟組織損傷程度、淋巴細胞比例改變和細胞因子分泌變化等，與微波輻射平均功率密度呈正相關(guān)。