梅毒螺旋體抗體快速試劑的實(shí)驗(yàn)室性能評(píng)價(jià)

夏德菊，袁柳鳳，周潛，許四宏，尹躍平

梅毒是由梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）感染引起的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有近兩千萬(wàn)的梅毒新發(fā)感染者，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口遷移的加快，從2005 - 2014年，梅毒病例增加了近三倍[2]。梅毒可由受感染的孕婦傳給胎兒，威脅下一代健康；系統(tǒng)性的梅毒也增加了其他病原體感染的機(jī)會(huì)，如人類免疫缺陷病毒[3-4]。及時(shí)診斷和治療對(duì)于減少梅毒發(fā)病率以及梅毒螺旋體向性伴侶和新生兒的傳播至關(guān)重要，通過(guò)早期發(fā)現(xiàn)母體感染并及時(shí)治療幾乎可以完全預(yù)防先天性梅毒[5]。在資源有限且難以進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室或梅毒篩查的地區(qū)，快速床旁（POC）檢測(cè)可以增加檢測(cè)人數(shù)，并為臨床服務(wù)提供同期治療的機(jī)會(huì)。此方法衍生的快檢試劑可以在室溫下儲(chǔ)存，操作時(shí)不需要任何設(shè)備，并且可以使用通過(guò)手指穿刺獲得的全血直接檢測(cè)，目前在發(fā)展中國(guó)家以及快速檢測(cè)應(yīng)用場(chǎng)景中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6-8]。

目前，我國(guó)已有超三十個(gè)企業(yè)研制出了 TP 抗體快速檢測(cè)試劑，此類試劑是以膠體金或硒為標(biāo)記物、以硝酸纖維素膜為載體、以層析形式進(jìn)行固相免疫測(cè)定的技術(shù)為原理而制備的。如此多的 TP 快檢試劑一方面為梅毒的即時(shí)檢測(cè)提供便利，但另一方面由于各生產(chǎn)單位所用抗原不同、工藝不同等，其產(chǎn)品的質(zhì)量也可能不同，而且前期一項(xiàng)研究表明，梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑對(duì)不同臨床時(shí)期梅毒感染樣本的檢測(cè)靈敏度有顯著性差異[0]，因此為客觀評(píng)價(jià) TP 抗體快速試劑質(zhì)量水平以及比較各試劑之間的質(zhì)量差異，本研究選用前期本科室研制的梅毒螺旋抗體快速試劑國(guó)家參考品以及商品化的血清轉(zhuǎn)化盤和不同臨床時(shí)期的梅毒樣本對(duì)目前市面主要使用的 TP 抗體快速檢測(cè)試劑進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 評(píng)價(jià)樣本 梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品由中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室制備并提供，批號(hào)為 370035-201801。該套參考品由 10 份陽(yáng)性樣本，20 份陰性樣本，3 份最低檢出限樣本及 1 份精密度樣本組成。梅毒血清轉(zhuǎn)換盤購(gòu)自 SeraCare 公司，是于 2012年從美國(guó)一位 41 歲女性采集的 9 支樣本（分別在第0、5、10、13、31、45、48、52 和 59 天采集），該轉(zhuǎn)換盤所有樣本未經(jīng)稀釋，未加防腐劑，為梅毒自然進(jìn)程中的原始樣本。不同臨床時(shí)期的梅毒樣本由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院提供，一期梅毒樣本 8 份，二期梅毒樣本 10 份，三期梅毒樣本5 份，潛伏期梅毒樣本 12 份，梅毒治愈后樣本16 份，共計(jì) 51 份樣本，均為檢驗(yàn)科剩余樣本。1.1.2 評(píng)價(jià)試劑 待評(píng)價(jià)試劑為 2020年國(guó)家藥品醫(yī)療器械監(jiān)督抽檢中梅毒螺旋體抗體檢測(cè)試劑盒（免疫層析法）項(xiàng)目各地區(qū)抽樣試劑，基本覆蓋了市面上普遍使用的梅毒螺旋體抗體快速試劑，共計(jì) 34 批次，來(lái)源于國(guó)內(nèi) 14 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，分布在北京、福建、浙江、廣州等省市，其中 A 廠家11 批次，B 廠家 8 批次，C、D 和 E 廠家各 2 批次，其余廠家均 1 批次，涉及的 TP 抗體快速試劑方法學(xué)有乳膠法和膠體金法。

1.2 方法

1.2.1 操作和結(jié)果判定 嚴(yán)格按照各試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本檢測(cè)和結(jié)果判定。本次試驗(yàn)由 2 人完成，一人負(fù)責(zé)加樣，一人負(fù)責(zé)結(jié)果判讀以保證不同試劑之間評(píng)價(jià)的一致性。對(duì)于梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品按照參考品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，即待參考品完全融化，并混合均勻后作為待測(cè)樣品使用；如有必要可離心去除沉淀及雜質(zhì)。參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：①陰性參考品：陽(yáng)性反應(yīng)不得多于2 份，陰性參考品符合率應(yīng) ≥ 18/20；②陽(yáng)性參考品：陰性反應(yīng)不得多于 1 份，陽(yáng)性參考品符合率應(yīng) ≥ 9/10；③最低檢出限參考品，L1 應(yīng)檢出陽(yáng)性，L2 可檢出陽(yáng)性或陰性；L3 應(yīng)檢出陰性；④重復(fù)性參考品：平行檢測(cè) 10 次，應(yīng)均為陽(yáng)性反應(yīng)且顯色度均一。血清轉(zhuǎn)換盤每支樣本檢測(cè) 1 次，然后統(tǒng)計(jì)每一批試劑檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤的陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)（即檢測(cè)結(jié)果開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)應(yīng)樣本的采樣時(shí)間）。選取2 批次 A 廠家試劑，2 批次 B 廠家試劑，其余廠家各 1 批次，共 16 批次試劑對(duì) 51 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，若樣本不夠全部試劑檢測(cè)，原則為保證每個(gè)廠家檢測(cè)一批次產(chǎn)品。

1.2.2 試劑評(píng)分方法 按照滿分 100 分分配給三個(gè)項(xiàng)目，即檢測(cè)梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品項(xiàng)目 40 分，檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤項(xiàng)目 30 分，檢測(cè) 51 份臨床樣本項(xiàng)目 30 分。其中檢測(cè)梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品中的陰性參考品、陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品、重復(fù)性參考品各10 分，如果陰性參考品、陽(yáng)性參考品有任一樣本檢測(cè)不符合扣 1 分，最低檢出限參考品 L1 和 L2均為陽(yáng)性為 10 分，L1 陽(yáng)性而 L2 陰性判 8 分。檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)為 31 d 為滿分 30 分，第45、48、52 和 59 天分?jǐn)?shù)依次遞減 2 分。試劑檢測(cè) 51 份臨床樣本的陽(yáng)性率乘以本項(xiàng)目基礎(chǔ)分 30 分為最終試劑檢測(cè)臨床樣本項(xiàng)目分?jǐn)?shù)。最終將三個(gè)項(xiàng)目得分相加為本次評(píng)價(jià)試劑的分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品

34 批次試劑檢測(cè)國(guó)家參考品中的陰性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品均滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中有 24 批試劑檢測(cè) 20 份陰性參考品均為陰性，10 批試劑檢測(cè)結(jié)果有 1 份樣本假陽(yáng)性。最低檢出限參考品有 21 批試劑檢測(cè)結(jié)果 L1 和L2 均為陽(yáng)性，13 批試劑僅檢出 L1 陽(yáng)性。對(duì)于10 份陽(yáng)性參考品，有 20 批試劑均檢出陽(yáng)性，9 批試劑檢出 9 份陽(yáng)性，均符合參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但有 5 批試劑僅檢測(cè) 8 份陽(yáng)性，不符合參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中 A 廠家和 B 廠家生產(chǎn)的不同批次試劑檢測(cè)同一套國(guó)家參考品的陰性參考品、陽(yáng)性參考品和最低檢出限參考品結(jié)果出現(xiàn)不一致情況，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)國(guó)家參考品結(jié)果Table 1 Results of 34 batches of TP antibody rapid reagent testing national reference

2.2 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤

34 批次試劑中有 3 批試劑最快出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)，均在第31 天，有 6 批次試劑最晚出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)，均在第59 天，中間相差 4 周時(shí)間。陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)為 52、45 和 48 d 的分別有 10、8 和 7 批次試劑。其中同為 A 廠家生產(chǎn)的 11 批次試劑，有 3 批次陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)為第59 天，1 批次陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)為第31 天。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)（A1 ～ 11：A 廠家生產(chǎn)的 11 批次試劑；B1 ～ 8：B 廠家生產(chǎn)的8 批次試劑；C1 ～ 2：C 廠家的 2 批次試劑；D1 ～ 2：D 廠家生產(chǎn)的 2 批次試劑；E1 ～ 2：E 廠家生產(chǎn)的 2 批次試劑）Figure 1 Days of positive conversion of 34 batches of TP antibody rapid reagents detection serum conversion disk (A1 - 11: 11 batches of reagents produced by manufacturer A; B1 - 8: 8 batches of reagents produced by manufacturer B; C1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer C; D1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer D; E1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer E)

2.3 16 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)不同臨床時(shí)期樣本

分別選取 A、B 廠家檢測(cè)血清轉(zhuǎn)換盤性陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)最早和最晚的 A1、A11 和 B1、B8 各 2 批次試劑，其余廠家各 1 批次試劑檢測(cè)臨床樣本。對(duì)于 8 份一期樣本，除了 3、6、8 號(hào)樣本所有檢測(cè)試劑均檢出陽(yáng)性外，其余 5 份樣本均有試劑未檢出，尤其是 1、2 號(hào)樣本 16 批試劑僅有 4 批和5 批試劑檢出陽(yáng)性。4、5、7 號(hào)樣本分別有 6、6、4 批樣本檢為陰性。對(duì)于 10 份二期樣本，除了1、2 號(hào)樣本有 1、3 批樣本漏檢外，其余樣本所有檢測(cè)試劑均檢出陽(yáng)性。5 份三期樣本以及 16 份治愈后樣本所有檢測(cè)試劑均檢出陽(yáng)性。12 份潛伏期樣本，有一份樣本有 2 批次試劑檢為陰性，其余所有試劑檢測(cè)該期樣本均為陽(yáng)性。16 批次試劑檢測(cè) 51 份臨床樣本的陽(yáng)性率為 84.3% ～ 100%，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 16 批次 TP 抗體快速試劑檢測(cè)不同臨床時(shí)期樣本結(jié)果Table 2 Results of 16 batches of TP antibody rapid reagents for testing samples of different clinical stages

2.4 試劑評(píng)分結(jié)果

按照擬定的評(píng)分方法對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行評(píng)分，由于只有 16 批次試劑檢測(cè)了臨床樣本，因此表3列出了 16 批次試劑的評(píng)分結(jié)果。總分最高的為A 廠家的 A11 試劑，為 99.4 分，其次為 D 廠家和 L 廠家試劑，分別為 99.0 和 98.0 分?？偡肿畹偷臑?A 廠家的 A1 試劑，為 83.3 分，其次是B 廠家的 B1 試劑和 H 廠家試劑，分別為 84.5和 85.2 分。

表3 16 批次 TP 抗體快速試劑評(píng)分結(jié)果Table 3 16 Batch TP antibody rapid reagents scoring results

3 討論

基于免疫層析法研制的 TP 抗體快速試劑是近幾年發(fā)展的一種十分簡(jiǎn)便、快速的梅毒診斷血清學(xué)方法，適用于性病門診的快速檢測(cè)、街頭無(wú)償獻(xiàn)血者的篩查以及緊急用血，尤其在資源匱乏地區(qū)有很高的經(jīng)濟(jì)學(xué)效益[10-11]。由于此類試劑技術(shù)門檻較低，國(guó)內(nèi)眾多企業(yè)研制出 TP 抗體快速試劑。2019年之前并無(wú)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)此類試劑進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管，長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)對(duì)于該類試劑僅執(zhí)行注冊(cè)檢驗(yàn)，且均為使用企業(yè)參考品進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，試劑質(zhì)量差異很大。因此，我們于 2019年研制出梅毒螺旋體抗體快速試劑國(guó)家參考品，用于此類試劑的注冊(cè)檢驗(yàn)，以加強(qiáng)試劑的質(zhì)量監(jiān)管。從2020年監(jiān)督抽檢的 34 批次試劑檢測(cè)國(guó)家參考品結(jié)果來(lái)看，85.3% 的試劑符合國(guó)家參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不符合批次的不合格項(xiàng)目均為陽(yáng)性參考品符合率，集中表現(xiàn)為對(duì)弱滴度樣本的漏檢，一方面可能是因?yàn)橛捎诳焖贆z測(cè)試劑采用膠體金或硒標(biāo)記，并用層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，因此該類試劑的靈敏度確實(shí)低于酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法試劑，另一方面可能和試劑未正規(guī)評(píng)價(jià)過(guò)早期梅毒感染者樣本有關(guān)。

典型的梅毒感染進(jìn)程為先在生殖器出現(xiàn)原發(fā)皮損，即硬性下疳，臨床稱為一期梅毒，下疳?？勺匀挥?，2 ～ 3 個(gè)月無(wú)癥狀的隱伏期后進(jìn)入二期梅毒，此期的主要表現(xiàn)為全身皮膚黏膜出現(xiàn)梅毒疹，二期梅毒因治療不當(dāng)，經(jīng)過(guò) 5年或更久的反復(fù)發(fā)作而進(jìn)入三期，主要表現(xiàn)為皮膚黏膜的潰瘍性損害或內(nèi)臟器官的肉芽腫樣病變。但大部分梅毒患者并沒(méi)有典型的皮損表現(xiàn)，即表現(xiàn)為隱性梅毒感染。一、二期梅毒又統(tǒng)稱為早期梅毒，此期傳染性強(qiáng)，但病程短、破壞性小。三期梅毒又稱為晚期梅毒，該期傳染性弱，但病程長(zhǎng)、破壞性大。隱性梅毒也具有傳染性，但病程不明確，跨度很大。梅毒患者經(jīng)過(guò)有效正規(guī)的驅(qū)梅治療后其非特異性抗體滴度轉(zhuǎn)為陰性即為梅毒治愈患者，但特異性抗體終身維持陽(yáng)性。我國(guó)在 20 世紀(jì)經(jīng)歷了梅毒大流行，目前處于梅毒治愈和隱性期感染人數(shù)較多，又考慮到早期梅毒感染者病程短，樣本不易收集，因此梅毒檢測(cè)試劑注冊(cè)前的臨床試驗(yàn)選用早期感染樣本較少，所以 TP 抗體快速試劑對(duì)早期梅毒感染樣本的檢測(cè)情況并未有效評(píng)估，一定程度上影響了試劑的研發(fā)。本研究對(duì)血清轉(zhuǎn)換盤的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)34 批次試劑的檢測(cè)陽(yáng)轉(zhuǎn)天數(shù)相差高達(dá) 4 周時(shí)間，間接證實(shí)了部分試劑對(duì)早期感染樣本的檢測(cè)靈敏度較低。對(duì)不同臨床時(shí)期梅毒感染樣本的檢測(cè)結(jié)果也可以證實(shí)，TP 抗體快速試劑對(duì)三期、隱性期及治愈后梅毒感染樣本的檢測(cè)靈敏度較高，一方面是因?yàn)榇似跇颖镜募膊∵M(jìn)程較長(zhǎng)，抗體滴度較高，另一方面也說(shuō)明了由于樣本易獲得，試劑研發(fā)廠家對(duì)此期樣本驗(yàn)證考核較多。但 TP 抗體快速試劑對(duì)一期梅毒感染樣本檢測(cè)靈敏度較低，本研究中處于一期梅毒感染的 1、2 號(hào)樣本 16 批試劑僅有 4 和5 批試劑檢出陽(yáng)性，還有 3 份樣本也有試劑出現(xiàn)漏檢，16 批試劑對(duì) 51 份臨床樣本的檢出率最低僅達(dá)到 84.3%，因此亟需提高 TP 抗體快速試劑對(duì)早期梅毒感染者的檢出，以有效阻斷傳播源，控制梅毒流行。

16 批次 TP 抗體快速試劑評(píng)分為 83.3 ～99.4 分，90 分以下有 4 家試劑，分?jǐn)?shù)跨度較大，跨度最大的兩個(gè)試劑來(lái)自于同一個(gè)生產(chǎn)廠家，一定程度反映了目前國(guó)內(nèi) TP 抗體快速試劑的質(zhì)量良莠不齊，而且部分廠家試劑的工藝穩(wěn)定性也有待改進(jìn)。所以臨床使用時(shí)要嚴(yán)格對(duì)檢測(cè)試劑質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，重點(diǎn)關(guān)注對(duì)早期樣本的檢測(cè)能力。如果未有效評(píng)估不同臨床時(shí)期樣本的檢測(cè)情況，建議此類試劑主要用于緊急篩查以及資源匱乏地區(qū)，有醫(yī)療條件的地區(qū)可以選用靈敏度更高的梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)。

TP 抗體快速試劑對(duì)不同臨床時(shí)期樣本檢測(cè)差異可能還和不同臨床時(shí)期梅毒樣本的抗體譜變化有關(guān)，前期我們使用商品化的 WB 試劑對(duì)不同臨床時(shí)期梅毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析不同樣本對(duì) TP 外膜蛋白中的 TP15、TP17、TP45 和 TP47 蛋白的反應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)抗 TPN45 的抗體在各個(gè)時(shí)期的反應(yīng)強(qiáng)度均很高，而其余三種抗體在梅毒一期、二期、三期、治愈后的疾病進(jìn)程中呈現(xiàn)上升再下降的變化，梅毒早期感染樣本 TP15 抗體的反應(yīng)強(qiáng)度要高于 TP17 和 TP47 抗體[9]，這些變化提示 TP 抗體快速試劑在研發(fā)設(shè)計(jì)時(shí)要選擇合適的抗原種類以及濃度配比。

綜上所述，我國(guó)梅毒螺旋體抗體快速試劑在對(duì)早期梅毒感染樣本檢測(cè)能力方面需要提高，一方面需要選取覆蓋所有疾病進(jìn)程的樣品對(duì)試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，另一方面需要維持不同批次試劑的工藝穩(wěn)定性以及運(yùn)輸穩(wěn)定性，最后要關(guān)注梅毒疾病進(jìn)程中梅毒螺旋體的免疫應(yīng)答模式，加強(qiáng) TP 抗體快速試劑的基礎(chǔ)研究，從源頭提高試劑質(zhì)量。