AHNAK2與甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的相關(guān)性分析

李建東，殷 濤，李卓良 (簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院普外科，四川 簡(jiǎn)陽(yáng) 641400)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是分化型甲狀腺惡性腫瘤中最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，具有高度分化、惡性低和生長(zhǎng)緩慢的特點(diǎn)，臨床預(yù)后良好，但部分患者在診斷時(shí)已發(fā)生局部鄰近組織甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，需要接受手術(shù)、術(shù)后放射性碘消融和促甲狀腺激素抑制等綜合治療，盡管多數(shù)患者可獲得較為滿意的預(yù)后，但仍有部分患者最終進(jìn)展為難治性PTC，易復(fù)發(fā)，甚至死亡[1]。頸部淋巴結(jié)是PTC常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，發(fā)生率為40%～90%，一旦發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PTC的復(fù)發(fā)率將顯著增高[2]。Ahnak核蛋白2(Ahnak nuclear protein 2，AHNAK2)是一個(gè)潛在的致癌基因，在腎透明細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、葡萄膜黑色素瘤和肺腺癌中高表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)[3]。但目前AHNAK2在PTC中的表達(dá)情況及其臨床意義尚不清楚。鑒于此，本研究擬檢測(cè)PTC組織中AHNAK2的表達(dá)情況，分析AHNAK2與PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床PTC的治療和預(yù)后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016年1月至2021年12月我院普外科收治的115例PTC患者(PTC組)的臨床資料，其中男42例，女73例；年齡23～72歲，平均(45.03±12.12)歲；腫瘤直徑0.1～6.0 cm，平均(1.34±0.22)cm；單側(cè)73例，雙側(cè)42例；單發(fā)64例，多發(fā)51例；分化程度：低中度分化30例，高度分化85例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期79例，Ⅲ～Ⅳ期36例；發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，合并橋本氏甲狀腺炎21例；微鈣化65例，低回聲實(shí)性結(jié)節(jié)63例，邊緣浸潤(rùn)36例。所有患者術(shù)前進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)和頸部淋巴結(jié)超聲評(píng)估，單側(cè)PTC行單側(cè)甲狀腺葉切除+峽部切除術(shù)+同側(cè)中央淋巴結(jié)清掃術(shù)，峽部或雙側(cè)PTC行全甲狀腺切除術(shù)+雙側(cè)中央淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)或細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)證實(shí)側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并行功能性側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中行冷凍切片的組織學(xué)檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次接受甲狀腺手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)為PTC；②年齡18周歲以上；③定期接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型甲狀腺惡性腫瘤；②未行中央淋巴結(jié)清掃術(shù)；③有甲狀腺手術(shù)史；④資料不完整，隨訪失聯(lián)。另選擇33例經(jīng)病理證實(shí)的良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者作為對(duì)照組，均行手術(shù)治療，組織標(biāo)本保存完好，其中男12例，女21例；年齡23～69歲，平均(45.51±11.43)歲。2組患者年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PZ051021)。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AHNAK2表達(dá)

取手術(shù)切除的甲狀腺組織，放入含0.3%過(guò)氧化氫的甲醇溶液中浸泡30 min，磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，加入AHNAK2一抗(PBS 1∶100稀釋，17682-1-AP，山羊抗兔多抗，美國(guó)Proteintech Group,Inc公司)，4 ℃孵育過(guò)夜，棄掉一抗，磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，加入羊抗兔Alexa Flour Plus 488標(biāo)記二抗(美國(guó)賽默飛公司)，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育20 min，棄掉二抗，磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。二氨基聯(lián)苯(福州邁新生物科技有限公司)顯色5 min，清洗，酒精和二甲苯脫水，永久培養(yǎng)基固定，光學(xué)顯微鏡下閱片拍照。IHC評(píng)分以染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞占比進(jìn)行評(píng)估，染色強(qiáng)度評(píng)分：0分表示陰性，1分表示弱陽(yáng)性，2分表示陽(yáng)性，3分表示強(qiáng)陽(yáng)性；以良性腫瘤細(xì)胞占比對(duì)染色程度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)染色細(xì)胞為0分，染色細(xì)胞占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘得到IHC評(píng)分，0～4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)[4]。

1.3 隨訪和相關(guān)資料收集

所有患者術(shù)后電話隨訪至2022年6月，統(tǒng)計(jì)隨訪期間PTC復(fù)發(fā)和患者死亡情況。統(tǒng)計(jì)PTC患者性別、年齡、腫瘤直徑、PTC側(cè)別、PTC數(shù)量、TNM分期、分化程度、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(中央?yún)^(qū)、側(cè)頸區(qū))、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺超聲特征(包括微鈣化、低回聲實(shí)性結(jié)節(jié)、邊緣浸潤(rùn))、術(shù)中清掃范圍等臨床資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PTC組織和正常甲狀腺組織中AHNAK2表達(dá)

AHNAK2陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，PTC組AHNAK2高表達(dá)率為62.61%(72/115)，高于對(duì)照組的27.27%(9/33)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.923，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

a：PTC(×40)；b：正常甲狀腺組織(×200)圖1 PTC和正常甲狀腺組織中AHNAK2表達(dá)

2.2 不同臨床特征的PTC患者間AHNAK2高表達(dá)比較

PTC患者中微鈣化、低度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的AHNAK2高表達(dá)率高于無(wú)微鈣化、中高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，不同年齡、性別、腫瘤直徑、甲狀腺超聲特征患者間AHNAK2高表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同PTC患者臨床特征AHNAK2高表達(dá)比較[例(%)]

2.3 不同AHNAK2表達(dá)的PTC患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率比較

所有患者均完成隨訪，中位隨訪時(shí)間32(6～65)個(gè)月，隨訪期間無(wú)患者死亡，20例復(fù)發(fā)，其中淋巴結(jié)復(fù)發(fā)18例(11例中央?yún)^(qū)復(fù)發(fā)、7例頸側(cè)區(qū)復(fù)發(fā))，甲狀腺?gòu)?fù)發(fā)2例;8例發(fā)生于術(shù)后15～24個(gè)月，11例發(fā)生于術(shù)后25～36個(gè)月，1例發(fā)生于術(shù)后50個(gè)月。根據(jù)ANHAK2表達(dá)情況將PTC患者分為高表達(dá)組(72例)和低表達(dá)組(43例)，繪制Kaplan-Meier曲線，經(jīng)檢驗(yàn)，高表達(dá)組無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于低表達(dá)組(9.30%vs.26.39%，Log-rankχ2=5.028，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同AHNAK2表達(dá)PTC患者無(wú)復(fù)發(fā)生存的Kaplan-Meier曲線

2.4 影響PTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的因素分析

將年齡(0=≤45歲，1=>45歲)、性別(0=男，1=女)、腫瘤直徑(0=≤1.0 cm，1=>1.0 cm)、微鈣化(0=否，1=是)、低回聲實(shí)性結(jié)節(jié)(0=否，1=是)、邊緣浸潤(rùn)(0=否，1=是)、PTC側(cè)別(0=單側(cè)，1=雙側(cè))、PTC數(shù)量(0=單發(fā)，1=多發(fā))、橋本氏甲狀腺炎(0=否，1=是)、分化程度(0=中高度分化，1=低度分化)、TNM分期(0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期)、頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=否，1=是)、頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=否，1=是)、術(shù)中淋巴結(jié)清掃范圍(0=中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，1=側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃)、AHNAK2作為自變量，以PTC患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)為因變量(0=否，1=是)，向后逐步法排除無(wú)關(guān)變量(P>0.05)，單因素Cox回歸結(jié)果顯示微鈣化、分化程度、TNM分期、頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AHNAK2表達(dá)與PTC患者的術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異變量納入多因素Cox回歸方程，向后逐步法排除無(wú)關(guān)變量(P>0.05)，結(jié)果顯示，頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AHNAK2高表達(dá)是PTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 影響PTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸方程

表3 影響PTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸方程

3 討論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的一種惡性內(nèi)分泌腫瘤，占人類所有惡性腫瘤的1%，占頭頸部惡性腫瘤的33%[2，5]。PTC是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的病理類型，占所有甲狀腺癌的80%～85%[2]，PTC早期易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，引起腫瘤復(fù)發(fā)[6]，一旦復(fù)發(fā)再次手術(shù)相對(duì)困難，可能會(huì)顯著增加手術(shù)并發(fā)癥，從而影響患者的生活質(zhì)量，降低患者生存率[7]。因此，術(shù)前準(zhǔn)確評(píng)估頸部淋巴結(jié)狀態(tài)有助于降低PTC復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)AHNAK2高表達(dá)與PTC患者微鈣化、低度分化、TNM分期的臨床特征、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，AHNAK2高表達(dá)是PTC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，可見(jiàn)AHNAK2在PTC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮致癌基因作用，AHNAK2高表達(dá)可能促進(jìn)PTC癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲等。AHNAK2屬于AHNAK家族成員，位于染色體14q32上，包含5 795個(gè)氨基酸，主要定位于各種細(xì)胞類型的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜，包括N端PDZ結(jié)構(gòu)域、中央重復(fù)單元區(qū)和C端結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)血腦屏障形成、細(xì)胞遷移、心臟鈣通道信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[8]。AHNAK2被認(rèn)為是一種致癌蛋白，既往研究顯示，AHNAK2在肺腺癌組織樣本中表達(dá)上調(diào)，且與肺腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，其在體外通過(guò)轉(zhuǎn)染si-AHNAK2抑制絲分裂原活化蛋白激酶通路相關(guān)蛋白表達(dá)后，肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均受到抑制[9]；AHNAK2還可通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的Smad3信號(hào)傳導(dǎo)促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10]。AHNAK2能誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路激活，促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]，或通過(guò)靶向透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的缺氧誘導(dǎo)因子1-α介導(dǎo)缺氧途徑促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12]。

AHNAK2參與PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)后復(fù)發(fā)的機(jī)制目前尚不清楚，分析可能包括以下幾方面：首先，AHNAK2作為一種支架蛋白，與電壓門(mén)控鈣通道相關(guān)，其C端結(jié)構(gòu)域末端與Ca2+通道的β2和β1a同工型相互作用，促使蛋白激酶A磷酸化，進(jìn)而限制Ca2+內(nèi)流。Ca2+是內(nèi)皮細(xì)胞中必不可少的第二信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、血管生成、屏障功能和炎癥等多種生理過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可導(dǎo)致黏附連接解體和細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞收縮，增加血管通透性，同時(shí)促使白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，驅(qū)使白細(xì)胞黏附和跨內(nèi)皮遷移[13]。AHNAK2可能通過(guò)促使細(xì)胞黏附、細(xì)胞連接參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，AHNAK2高表達(dá)可能導(dǎo)致PTC癌組織中B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。其次，核因子-kappa B(NF-κB)是調(diào)節(jié)炎癥以及調(diào)控癌變和癌癥進(jìn)展的重要因子，NF-κB可誘導(dǎo)snail、twist和鋅指E盒結(jié)合的同源盒蛋白2等多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)其侵襲功能[15-16]，同時(shí)，AHNAK2表達(dá)上調(diào)可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)[17]。最后，Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路激活可上調(diào)增殖基因-細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞黏附的跨膜蛋白-E-鈣黏蛋白表達(dá)，促使PTC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[18]，AHNAK2可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)PTC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[19]。本研究回歸分析結(jié)果顯示，頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTC術(shù)后復(fù)發(fā)也有關(guān)，頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者AHNAK2高表達(dá)率高于無(wú)頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與更高的PTC癌細(xì)胞侵襲性和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

綜上，PTC組織中AHNAK2表達(dá)上調(diào)，AHNAK2高表達(dá)與PTC患者微鈣化、低度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、頸部側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，是PTC預(yù)后的潛在標(biāo)志物。本研究創(chuàng)新之處在于闡述了AHNAK2與PTC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，但為回顧性研究，樣本量偏少，尚待進(jìn)一步開(kāi)展前瞻性大樣本臨床研究證實(shí)。