阿托伐他汀誘導(dǎo)Nrf2緩解非酒精性脂肪性肝病大鼠肝變性

閔方圓，覃鴻恩，肖 慧，周 輝，馬云飛 (.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥劑科，湖北 恩施 445000；.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院藥劑科，湖北 恩施 445000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)作為代謝綜合征的肝表現(xiàn)，近年來患病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。肝內(nèi)脂質(zhì)的堆積是NAFLD發(fā)生的始動(dòng)因素[3]。研究認(rèn)為脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激反應(yīng)是NAFLD進(jìn)程中肝損傷的重要機(jī)制[4]。核因子相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factors,Nrf-2)信號(hào)通路是近年來研究的熱點(diǎn)信號(hào)通路之一，其活化能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生多種抗氧化酶，有助于抑制活性氧所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。阿托伐他汀作為經(jīng)典的調(diào)血脂藥物，在NAFLD動(dòng)物模型和患者中能改善血脂和胰島素抵抗[6-7]，但少有研究探討其對(duì)NAFLD致病機(jī)制中氧化應(yīng)激的作用。本研究通過構(gòu)建大鼠NAFLD模型，從改善代謝和氧化應(yīng)激兩方面探討阿托伐他汀對(duì)NAFLD肝損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018。

阿托伐他汀(純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司)；兔抗鼠Nrf-2、p-Nrf-2、血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO-1)、奎寧氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]、GAPDH抗體(英國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國(guó)CST公司)；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成)；全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)；酶標(biāo)免疫分析儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 大鼠NAFLD模型制備及分組

1.3 大鼠血生化指標(biāo)檢測(cè)

使用全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT、TC、TG、HDL、LDL、血糖及空腹血清胰島素水平，操作按說明書進(jìn)行。

1.4 大鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)

制備肝組織勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清液，利用比色法檢測(cè)上清液中MDA、SOD和GSH-Px水平，操作按說明書進(jìn)行。

1.5 大鼠肝組織HE染色和TUNEL染色

取10%福爾馬林固定的大鼠肝組織，常規(guī)脫水、透明、包埋和4 μm切片。將切片分別按照TUNEL和HE染色步驟染色。封片后分別在光鏡下觀察肝組織病理改變及細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)

采用BCA法對(duì)提取蛋白質(zhì)進(jìn)行定量后，取50 μg上樣在100 V電壓條件下經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳50 min，300 mA轉(zhuǎn)膜1 h轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入GAPDH(1∶1 000)、Nrf-2(1∶500)、p-Nrf-2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)一抗，并于4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，ECL法顯色，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血糖、肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，阿托伐他汀中劑量組、阿托伐他汀高劑量組血糖、肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素水平均顯著降低(P<0.05)，見圖1。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05圖1 各組大鼠血糖、肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素水平

2.2 各組大鼠血脂水平比較

與對(duì)照組比較，模型組、阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀中劑量組和阿托伐他汀高劑量組大鼠血清TC、TG和LDL水平均顯著升高(P<0.05)，HDL水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，阿托伐他汀中劑量組、阿托伐他汀高劑量組血清TC、TG和LDL水平均顯著降低(P<0.05)，HDL水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較

2.3 各組大鼠血清AST、ALT水平比較

與對(duì)照組比較，模型組、阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀中劑量組和阿托伐他汀高劑量組大鼠血清AST、ALT水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，阿托伐他汀中劑量組、阿托伐他汀高劑量組血清AST、ALT水平均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清AST、ALT水平比較

2.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)改變及肝細(xì)胞凋亡情況

光鏡下可見對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)、小葉結(jié)構(gòu)正常。而模型組肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，主要為大泡性脂肪變性，也有部分小泡性脂肪變性，小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。不同劑量阿托伐他汀干預(yù)后肝脂肪變性程度明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡增多；與模型組比較，阿托伐他汀呈劑量依賴性減少肝細(xì)胞凋亡(圖2)。

圖2 各組肝組織病理變化及肝細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.5 阿托伐他汀對(duì)NAFLD大鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組、阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀中劑量組和阿托伐他汀高劑量組肝組織中MDA水平增加(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平降低(P<0.05)；與模型組比較，阿托伐他汀中劑量組、阿托伐他汀高劑量組MDA水平降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px水平比較

2.6 阿托伐他汀對(duì)NAFLD大鼠Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組比較，模型組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，阿托伐他汀中劑量組、阿托伐他汀高劑量組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：阿托伐他汀低劑量組；D：阿托伐他汀中劑量組；E：阿托伐他汀高劑量組;*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05圖3 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

既往研究認(rèn)為，肥胖、糖耐量受損和血脂異常與NAFLD相關(guān)，并可能在其發(fā)病中發(fā)揮作用[9-11]。本研究HE和TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝組織未見明顯病理改變，小葉內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而模型組肝小葉內(nèi)見廣泛的肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，小葉及匯管區(qū)內(nèi)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞凋亡增加，符合NAFLD肝損傷的病理形態(tài)[12]。另外，模型組AST、ALT水平較對(duì)照組顯著增加，由此可見本研究成功建立了高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型。

目前“二次打擊學(xué)說”是被廣泛接受的NAFLD發(fā)生、發(fā)展理論。其中胰島素抵抗與脂代謝紊亂作為始動(dòng)因素引起肝脂肪變性的首次打擊[13]；各種因素所致的氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷，引起肝組織炎癥和纖維化的二次打擊[14-15]。可見，脂質(zhì)代謝平衡對(duì)減輕肝脂肪變性起到重要作用。阿托伐他汀作為經(jīng)典的高效調(diào)血脂藥物在臨床應(yīng)用廣泛，但對(duì)于其在NAFLD中的作用研究較少。本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀通過改善脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激對(duì)肝脂肪變性具有保護(hù)作用。NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征的肝表現(xiàn)，本研究中，高脂飲食大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、高脂血癥、胰島素抵抗以及肝脂肪變性等NAFLD模型的典型表現(xiàn)。而阿托伐他汀治療可以顯著改善高脂飲食引起的肝脂肪變性。此外，阿托伐他汀減少了體質(zhì)量的增長(zhǎng)，降低了血清TC、TG和LDL水平。胰島素抵抗是肥胖與NAFLD相關(guān)的中心環(huán)節(jié)，而他汀類藥物被報(bào)道具有改善肝胰島素敏化的作用[16]。本研究中應(yīng)用阿托伐他汀顯著改善了NAFLD模型大鼠的胰島素抵抗，提示阿托伐他汀能影響NAFLD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)而發(fā)揮治療作用。

氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷是NAFLD進(jìn)展中第二次打擊的關(guān)鍵。氧化應(yīng)激使肝GSH-Px活力降低，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物過度產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)。有研究發(fā)現(xiàn)肝損傷小鼠MDA水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17]。而SOD與GSH-Px等酶系統(tǒng)能防止機(jī)體發(fā)生過氧化損傷[18-19]。本研究證實(shí)阿托伐他汀能提高機(jī)體的抗氧化力，減輕NAFLD大鼠肝損傷。

Nrf-2在機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用[20-23]；Nrf-2磷酸化激活并與抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合，誘導(dǎo)HO-1、NQO1和GSH-Px表達(dá)，對(duì)抗各種因素引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷[24-25]。Nrf-2缺乏被證實(shí)在動(dòng)物模型中表現(xiàn)為對(duì)多種肝疾病易感[26]。Sun等[27]研究中阿托伐他汀通過激活Nrf-2信號(hào)通路改善心臟缺血再灌注大鼠的氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，激活機(jī)體內(nèi)源性Nrf-2/HO-1/NQO1信號(hào)通路可以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。Nrf-2磷酸化是其活化的關(guān)鍵標(biāo)志。本研究Western blot結(jié)果顯示，阿托伐他汀可以明顯誘導(dǎo)Nrf-2的磷酸化并上調(diào)HO-1、NQO1表達(dá)水平，且表現(xiàn)為明顯的劑量依賴趨勢(shì)，因此推測(cè)阿托伐他汀可能通過激活Nrf-2/HO-1/NQO1信號(hào)通路激活對(duì)抗NAFLD大鼠的氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮肝保護(hù)作用。

綜上所述，阿托伐他汀不僅能改善NAFLD大鼠血脂紊亂，還可通過激活Nrf-2/HO-1/NQO1信號(hào)通路，促進(jìn)下游SOD、GSH-Px等表達(dá)，降低MDA水平從而發(fā)揮肝保護(hù)作用。