井文森,許珂,高青,許鵬,彭侃
1 西安交通大學附屬紅會醫(yī)院關節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關節(jié)重建科,西安 710054;2 西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)骨科
鈦合金廣泛用于組織再生,具有生物相容性高、機械強度高、耐腐蝕和細胞附著等優(yōu)點[1]。然而,未經任何修飾的原始鈦移植物幾乎是惰性的,因此無法在體內實現(xiàn)骨整合[2]。為了獲得具有增強成骨能力的生物活性骨-植入物界面,已實驗了各種方法來改變鈦合金表面的骨整合,如骨形態(tài)形成蛋白2(BMP-2)作為生物性材料復合至人工關節(jié)假體表面涂層中用以制備復合涂層,改善和促進鈦表面的骨整合[3]。BMP-2 作為轉化生長因子-β 超家族成員,是一種有效的形態(tài)發(fā)生素,在人類發(fā)育中起關鍵作用,廣泛參與骨形成和再生[4]。多數(shù)研究顯示,BMP-2 可涂覆到支架上,以構建用于骨缺損愈合的輸送系統(tǒng),然而,這種方法存在部分缺點,如劑量不準確、流量不受控制和BMP-2 在涂層表面的裝載率低,可能導致切口并發(fā)癥、骨吸收等問題[5]。3D 打印技術的出現(xiàn)使外科醫(yī)生能制造出與骨缺損相匹配的任意形狀、可控的孔形狀和孔隙率、良好的孔連通性以及臨床適用性的鈦合金假體,且3D打印金屬植入物已用于臨床實踐并取得良好預后[6-8]。但3D 打印對多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件的BMP-2 裝載率、累計釋放率的影響尚不清楚。因此,本研究主要探究3D 打印對多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2 裝載率、累計釋放率的影響及3D 打印多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件對成骨細胞增殖、分化的影響?,F(xiàn)報告如下。
1.1 材料及試劑 鈦合金Ti6Al4V 金屬粉末購自成都華寅粉體科技有限公司;小鼠成骨細胞系MC3T3-E1 購自齊一生物科技(上海)有限公司;BMP-2 ELISA 試劑盒購自上海名勁生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自上海繼和生物科技有限公司;兔源一抗Runt 相關轉錄因子2(RUNX2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、GAPDH及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。
1.2 多孔鈦合金試件表面BMP-2 生物復合涂層的制備及分組 ①多孔鈦合金試件的設計:3D 打印多孔鈦合金試件設計:使用3D設計軟件進行參數(shù)化建模,孔隙率設定為70%,直徑6 mm、高6 mm 的圓柱形鈦合金多孔試件。高溫燒結多孔鈦合金試件設計:直徑6 mm、高6 mm 的圓柱形鈦合金多孔試件。②多孔鈦合金試件的制備:3D 打印多孔鈦合金試件制備:按照研究設計,將建立的三維模型導入3D 金屬打印機中,鋪粉裝置先將鈦合金粉末平推到成型缸基板上,之后固定掃描間距,啟動打印,制備3D打印多孔鈦合金試件。高溫燒結多孔鈦合金試件制備:將鈦合金材料,用等離子旋轉電極法制備成球形鈦珠粒,用24目和32目篩子篩選出直徑為500~700 μm的鈦珠粒,將其填裝入內腔為直徑6 mm、高6 mm 的圓柱體的模具中,真空燒結爐內,抽真空,至10~30 Pa時,開始加熱,在200 ℃時保溫15 min,以使件內的水分充分蒸出,繼續(xù)加熱,400、600、800、1 000、1 200 ℃,分別保溫15 min,至1 300 ℃時保溫2 h,停止加熱,隨爐冷卻,這時鈦珠粒之間已牢固燒結。去除模具,高溫燒結多孔鈦合金試件即完成制備。③多孔鈦合金試件表面羥基磷灰石(HA)涂層的制備:取上述兩組多孔鈦合金試件,采用微弧氧化技術在試件表面制備HA 涂層,作BMP-2 的復合載體之用。④多孔鈦合金試件表面BMP-2 生物復合涂層的制備:上述兩組多孔鈦合金試件表面通過化學沉積法在其表面復合BMP-2 生物活性成分,分別制備3D 打印多孔BMP 復合涂層試件、高溫燒結多孔BMP 復合涂層試件。將制備成功的3D 打印多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件作為實驗組,另取制備成功的高溫燒結多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件作為對照組。
1.3 多孔BMP-2復合涂層試件的表征觀察分析 掃描電鏡觀察多孔BMP 復合涂層試件微孔的大小、形狀、孔徑、孔隙率、孔深度等表征。
1.4 多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件表面多孔涂層中BMP-2的裝載率測定 采用125I放射性標記法。參照文獻[5]方法,通過125I 放射性標記法測定多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件表面多孔涂層中BMP-2的裝載率。
1.5 多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2 累計釋放率的測定 將3D 打印多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件、高溫燒結多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件分別置于含有40 mL PBS 緩沖液的試管中,恒溫37 ℃,放置21 d。通過ELISA 試劑盒測定該緩沖液中每天BMP-2 的含量,計算不同時間BMP-2 的累計釋放率。
1.6 細胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)MC3T3-E1 細胞,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。
1.7 MC3T3-E1 細胞在多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件上的生長情況觀察 細胞接種前分別將3D打印多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件、高溫燒結多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件置于24孔板中,再將1 mL 含有 2×104個MC3T3-E1 細胞的細胞懸液接種到每個試件的表面,并孵育1、7 d。在每個時間點,將試件轉移到新的24 孔板中,用PBS 洗滌,2.5%戊二醛固定4 h。用一系列分級乙醇對試件進行脫水、干燥,通過掃描電鏡檢查試件上的細胞形態(tài)。
1.8 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8 法。將試件添加到24孔板中,并將MC3T3-E1細胞以2×104個的密度接種到每個試件上孵育 1、3、5 d。在預定時間點,將試件轉移到新的24 孔板中并用PBS 洗滌。將試件上的細胞與300 μL DMEM 和30 μL CCK-8 溶液在培養(yǎng)箱中共孵育1 h,然后使用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)。
1.9 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 表達檢測 采用qRT-PCR 法。將試件添加到24 孔板中,再將3.5×104個細胞接種到每個試件上利用DMEM 培養(yǎng)基2 d,分化誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d,然后終止培養(yǎng),用TRIzol 試劑裂解每個試件上的細胞,并通過離心收集提取的總RNA,將總RNA 反轉錄為cDNA 后,以cDNA 為模板在Bio-Rad iQTM5 系統(tǒng)上進行熒光定量 反 應。以GAPDH 為 內 參,采 用2-ΔΔCt法 計 算RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 表達。RUNX2 正向引物:5” -CTTCTTCTTCAATACCAAGTT-3” ,反向引物:5” -AGCATCTCCTTCATACATC-3” ;ALP 正 向 引物:5” -TGCCTACTTGTGTGGCGTGAA-3” ,反向引物:5” -TCACCCGAGTGGTAGTCACAATG-3” ;OCN 正 向引物:5” -GACGAGTTGGCTGACCACA-3” ,反向引物:5” -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3” ;OPN 正 向 引物:5” -GCTCAGCACCTGAATGTACC-3” ,反向引物:5” -CCTCGGCTCGATGGCTAGC-3” ;GAPDH 正 向 引物:5” -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3” ,反向引物:5” -TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3” 。
1.10 RUNX2、ALP、OCN、OPN 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。按照1.9中的方式將MC3T3-E1 細胞于分化誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d 后,用RIPA 裂解緩沖液裂解并提取每個試件上的細胞的總蛋白,蛋白質經定量、電泳、轉膜、封閉后,將膜與一抗RUNX2(1∶2 000)、ALP(1∶1 000)、OCN(1∶2 000)、OPN(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃下過夜孵育,然后將膜與二抗在室溫下共同孵育1 h。加入ECL 試劑觀察蛋白質條帶,Image J 軟件用于評估各個蛋白的灰度值。
1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據符合正態(tài)分布以±s表示,組間比較采用重復測量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件表征觀察比較 與對照組比較,實驗組的孔形狀規(guī)則,分布更均勻,見圖1。實驗組與對照組孔徑分別為(430.37 ± 7.75)、(268.67 ± 24.45)μm,孔深度分別為(537.75 ± 6.55)、(84.48 ± 7.25)μm,與對照組比較,實驗組孔徑、孔深度升高(P均<0.05)。由于對照組孔隨機分布,且存在部分孔重疊現(xiàn)象,故未測量孔隙率,而實驗組的孔隙率為(68.24 ± 2.31)%。
圖1 掃描電鏡觀察兩組多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件表面形貌
2.2 兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2裝載率比較 實驗組與對照組BMP-2 裝載率分別為(41.46 ± 3.27)%、(16.67 ± 1.58)%,與對照組比較,實驗組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2裝載率升高(P<0.05)。
2.3 兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2累計釋放率比較 與對照組比較,實驗組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2 累計釋放率(1、3、6、9、12、15、18、21d)升高(P均<0.05),見表1。
表1 兩組多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件BMP-2累計釋放率比較(%± s)
表1 兩組多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件BMP-2累計釋放率比較(%± s)
注:與對照組比較,*P<0.05。
?
2.4 MC3T3-E1 細胞在兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件上的生長情況 掃描電鏡結果顯示,培養(yǎng)1 d 后MC3T3-E1 細胞黏附在兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件表面,在孔內及孔壁處有大量細胞聚集。培養(yǎng)7 d 后,MC3T3-E1 細胞在兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件表面上緊密排列,在對照組試件表面,觀察到排列緊密的細胞層可覆蓋部分孔徑較小的孔,而實驗組試件表面可見致密的細胞層匯聚在孔徑較大的孔中,見圖2。
圖2 掃描電鏡觀察培養(yǎng)1、7 d時MC3T3-E1細胞在兩組多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件上的生長情況
2.5 MC3T3-E1 細胞在兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件上的增殖能力比較 與對照組比較,實驗組MC3T3-E1 細胞在第3、5 天時的增殖能力升高(P均<0.05);兩組MC3T3-E1 細胞在第1 天時增殖能力變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。
表2 各組MC3T3-E1細胞在第1、3、5天時的增殖能力比較(± s)
表2 各組MC3T3-E1細胞在第1、3、5天時的增殖能力比較(± s)
注:與對照組比較,*P<0.05。
組別對照組實驗組OD450值第1天0.36 ± 0.02 0.38 ± 0.03*第3天0.47 ± 0.03 0.86 ± 0.07*第5天0.65 ± 0.05 1.37 ± 0.11*
2.6 MC3T3-E1 細胞在兩組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件上的分化能力比較 細胞分化培養(yǎng)第14 d 時,與 對 照 組 比 較,實 驗 組RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 及蛋白表達升高(P均<0.05),見表3、4。
表3 細胞分化培養(yǎng)第14天時各組 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA表達比較( ± s)
表3 細胞分化培養(yǎng)第14天時各組 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA表達比較( ± s)
注:與對照組比較,*P<0.05。
組別對照組實驗組RUNX2 mRNA 1.00 ± 0.00 1.57 ± 0.11*ALP mRNA 1.00 ± 0.00 1.73 ± 0.12*OCN mRNA 1.00 ± 0.00 1.98 ± 0.14*OPN mRNA 1.00 ± 0.00 2.34 ± 0.15*
表4 細胞分化培養(yǎng)第14天時各組 RUNX2、ALP、OCN、OPN蛋白表達比較± s)
表4 細胞分化培養(yǎng)第14天時各組 RUNX2、ALP、OCN、OPN蛋白表達比較± s)
注:與對照組比較,*P<0.05。
鈦合金是應用最廣泛的人造骨替代品之一,因為它具有生物相容性和適宜的力學性能。然而,由于其生物惰性,導致這些“無生命”的材料只能作為支撐骨缺損的固定材料,而不能在假體與宿主骨之間形成良好的骨結合[9]。既往研究表明,將具有骨誘導活性的材料,如BMP-2 復合至金屬植入物表面可促進植入物表面的骨長入,從而提高其在體內的穩(wěn)固程度,被認為是提高假體-骨組織間骨整合最有效的方法[10]。但BMP-2 作為復合涂層中具有骨誘導活性的因子,其在涂層表面的裝載率是影響其成骨活性的關鍵因素,更大的接觸面積及多孔的涂層結構,理論上會較大程度地提高BMP-2 在涂層表面的裝載率[11]。目前臨床廣泛使用的生物型人工假體,主要是通過高溫燒結、高溫噴涂等二次成型技術,在金屬基體表面制備具有不同孔隙骨的涂層,如金屬珠粒微孔涂層、金屬絲纖維網狀涂層、磨砂粗糙面涂層等,其制備過程復雜,且對表面金屬涂層的孔徑、孔隙率等結構無法精準掌控[12]。3D 打印技術是一種很有前途的方法,可以生成具有復雜組件和多孔部分的個性化植入物[13],具有可控孔徑和孔隙率的互連多孔植入物,可以顯著降低剛度,更好地模仿天然骨組織的結構,促進骨再生和骨整合[14]。骨整合能力不僅取決于材料本身的骨傳導性,還與植入物的孔隙分布、孔隙率和孔徑大小有關。理想的骨科多孔植入物,其孔隙率應高于50%,特別是在65%~75%范圍,孔徑應在300~700 μm,這個范圍有利于成骨細胞的黏附、增殖和分化[15]。本研究利用3D 打印多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件,結果顯示實驗組試件孔徑為(430.37 ± 7.75)μm,孔隙率為(68.24 ± 2.31)%。本研究3D 打印多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件的孔隙率和孔徑被認為具有理想的骨誘導參數(shù)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),與對照組比較,實驗組多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件BMP-2 裝載率、BMP-2 累計釋放率(1、3、6、9、12、15、18、21 d)升高,提示BMP-2在3D打印多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件中發(fā)揮作用效果優(yōu)于高溫燒結多孔BMP復合涂層試件。
本研究結果顯示,培養(yǎng)7 d 后,對照組試件表面觀察到排列緊密的細胞層可覆蓋部分孔徑較小的孔,而實驗組試件表面可見致密的細胞層匯聚在孔徑較大的孔中,與對照組比較,實驗組MC3T3-E1 細胞在3、5 d 時的增殖能力升高,表明3D 打印多孔BMP-2 復合涂層鈦合金試件可促進MC3T3-E1 細胞的生長與增殖。RUNX2、ALP、OCN、OPN 基因是衡量成骨不同階段的重要指標[16],本研究利用這4 個基因來反映MC3T3-E1 細胞分化情況,結果顯示,細胞分化培養(yǎng)第14 天時,與對照組比較,實驗組 RUNX2、ALP、OCN、OPN mRNA 及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義,表明3D打印多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件促進了成骨細胞的分化。
綜上所述,3D 打印對多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件BMP-2 裝載率、BMP-2 累計釋放率優(yōu)于高溫燒結多孔BMP 復合涂層試件。3D 打印多孔BMP-2復合涂層鈦合金試件促進了成骨細胞的增殖與分化。