宮頸癌組織中Pax1、LMX1A 表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

劉皓，楊雯，譚學(xué)賢，孫斌，熊漢真

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，廣州 510145；2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在女性中的病死率僅次于乳腺癌［1］。宮頸癌的臨床治療包括手術(shù)、放化療等，但疾病早期癥狀不典型，明確診斷時(shí)多已處于中晚期，錯(cuò)失最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后較差［2-3］。配對(duì)盒基因1（Pax1）屬于配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子家族成員，包含一個(gè)配對(duì)盒結(jié)構(gòu)域和一個(gè)配對(duì)型同源結(jié)構(gòu)域，在胎兒發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用［4］。研究表明，Pax1作為一種抑癌基因，在食管癌、口腔癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低，其表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［5-6］。LIM 同源框轉(zhuǎn)錄因子1A（LMX1A）屬于同源框轉(zhuǎn)錄因子家族，能結(jié)合到富含GC 堿基的基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［7］。在胃癌和肺癌等腫瘤中低表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞遷移［8-9］。本研究通過檢測宮頸癌組織中Pax1、LMX1A表達(dá)，分析二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016 年1 月—2017 年6 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院診治的103 例宮頸癌患者。年齡22～76（60.19 ± 8.71）歲；TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期73 例，Ⅲ期30 例；腫瘤直徑：＜5 cm 62 例，≥5 cm 41 例；浸潤深度：T1～T266 例，T3～T437 例；分化程度：低分化40例，中分化35例，高分化28例；病理類型：鱗癌80 例，腺癌15 例，其他類型8 例；肌層浸潤45 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均行宮頸癌根治手術(shù)治療，經(jīng)病理學(xué)診斷確診為宮頸癌；②臨床病理資料完整；③首次診治。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重度肝腎功能障礙；②合并其他腫瘤者；③近1個(gè)月內(nèi)有全身性感染性疾病。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（20170614）。患者均簽署知情同意書。

1.2 宮頸癌及相應(yīng)癌旁組織中Pax1、LMX1A 表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法。宮頸癌及癌旁組織樣本常規(guī)中性甲醛固定，梯度脫水后，組織包埋機(jī)進(jìn)行包埋（深圳永年科技公司，型號(hào)：YN-02B1）。常規(guī)進(jìn)行免疫組化染色。Pax1 和Anti-LMX1A 抗體購自美國Acam 公司（貨號(hào)ab252847、ab82833）。DAB 顯色后脫水、透明和固定，鏡下（美國科特爾公司，型號(hào)：BP1500）觀察染色結(jié)果。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：陽性細(xì)胞比例≤5%為0 分，5%＜陽性比例＜25%為1 分，25%≤陽性比例＜50%為2 分，50%≤陽性比例＜75%為3 分，陽性比例≥75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無色（0 分），淡黃色（1 分），棕黃色（2 分）和棕褐色（3 分），陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分乘積為最終評(píng)分，0～4 為陰性，5～12為陽性［10］。

1.3 隨訪 患者出院后均定期進(jìn)行電話和門診方式隨訪，第1～2 年每3 個(gè)月隨訪1 次，以后每6 個(gè)月隨訪1 次。隨訪截至2022 年6 月，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 法（Log-rank 檢驗(yàn)）。單因素及多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及癌旁組織中Pax1、LMX1A 表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，Pax1、LMX1A 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，棕色染色。103 例宮頸癌組織中Pax1表達(dá)陽性41 例（39.81%），癌旁組織中Pax1 表達(dá)陽性69 例（66.99%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.294，P＜0.05）（圖1A、B）。103 例宮頸癌組織中LMX1A表達(dá)陽性40 例（38.83%），癌旁組織中LMX1A 表達(dá)陽性71 例（68.93%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.773，P＜0.05）（圖1C、D）。

2.2 宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌組織中不同TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中Pax1 和LMX1A 蛋白表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），不同患者年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、肌層浸潤、病理類型和腫瘤分化之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 Pax1和LMX1A蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 患者隨訪過程中，死亡46例，失訪2例。Pax1 表達(dá)陽性、陰性宮頸癌患者的5 年生存率分別為75.6%（31/41）、38.71%（24/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.386，P＜0.05）。LMX1A 表達(dá)陽性、陰性宮頸癌患者的5 年生存率分別為65.0%（26/40）、46.03%（29/63），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=3.487，P＜0.05）。

2.4 宮頸癌患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 以患者是否死亡作為因變量（0=存活，1=死亡），單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果顯示，TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Pax1和LMX1A蛋白表達(dá)是影響宮頸癌患者預(yù)后的因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 影響宮頸癌患者預(yù)后的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

表3 影響宮頸癌患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第2 位，僅次于乳腺癌。我國宮頸癌發(fā)病率較高，約為12.24/10 萬，且以每年上升0.4%～1.5%的速度升高，病死率達(dá)2.64/10萬［11］。宮頸癌治療包括手術(shù)、放化療等，但由于腫瘤惡性程度高，術(shù)后易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者生存預(yù)后較差［12］。因此，深入研究影響宮頸癌進(jìn)展的分子機(jī)制，尋找宮頸癌診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)的生物標(biāo)記物有重要臨床價(jià)值。

Pax1 編碼基因位于20p11.22，該基因編碼Pax1蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)盒（PAX）家族的成員，其參與正常的胚胎發(fā)育、椎骨發(fā)育等生理學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，Pax1 在口腔癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，機(jī)制尚不明確，腫瘤中Pax1 發(fā)揮抑癌基因作用，其能通過抑制癌基因如c-myc 的表達(dá)，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Pax1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，分析其原因可能是在宮頸癌中Pax1基因處于高甲基化狀態(tài)，Pax1 的啟動(dòng)子區(qū)以及外顯子區(qū)域高甲基化會(huì)導(dǎo)致RNA 聚合酶無法結(jié)合到Pax1 基因上而導(dǎo)致Pax1 基因轉(zhuǎn)錄異常，最終導(dǎo)致Pax1 基因表達(dá)下調(diào)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，Pax1 表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，原因是Pax1 表達(dá)下調(diào)參與促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。DENG 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化是宮頸癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一。Pax1 表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，腫瘤細(xì)胞表面的纖維蛋白、膠原蛋白和鈣黏蛋白等細(xì)胞黏附蛋白大量降解，使得腫瘤細(xì)胞黏附功能下降而發(fā)生轉(zhuǎn)移［15-16］。同時(shí)，F(xiàn)ARHAN等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Pax1與人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）協(xié)同表達(dá)。由于PTEN 是磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路的抑制蛋白，并且基質(zhì)金屬蛋白酶-1 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 等均是磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路的下游靶基因［18］。因此，在宮頸癌中Pax1 表達(dá)下調(diào)可引起PTEN 表達(dá)下調(diào)，使得磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路異常激活，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶-1 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 表達(dá)異常，基質(zhì)金屬蛋白酶通過降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

LMX1A基因位于1q23.3，該基因編碼含有同源結(jié)構(gòu)域和LIM 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，功能上可作為胰島素基因轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)因子［19］。近年研究表明，在胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中LMX1A表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致下游β-連環(huán)蛋白表達(dá)降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無限增殖和侵襲［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中LMX1A 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，分析其原因可能是在宮頸癌中LMX1A 基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，甲基化修飾會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組裝，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體無法在LMX1A基因啟動(dòng)子區(qū)形成，LMX1A 基因轉(zhuǎn)錄受到抑制而導(dǎo)致其表達(dá)下降。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，LMX1A 表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其機(jī)制可能是LMX1A作為抑癌基因，能夠抑制腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移。QIAN等［21］研究發(fā)現(xiàn)，LMX1A 能抑制血管生成素樣蛋白4的表達(dá)。因此，宮頸癌患者LMX1A表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致其對(duì)血管生成素樣蛋白4 的表達(dá)抑制作用解除，血管生成素樣蛋白4 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管新生，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤細(xì)胞造成的損傷，宮頸癌細(xì)胞通過腫瘤血管發(fā)生轉(zhuǎn)移。同時(shí)抗凋亡以及抗氧化應(yīng)激作用能夠提高腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中的存活率，導(dǎo)致宮頸癌患者病情惡化。

本研究中，103 例患者隨訪過程中死亡46 例，5年生存率為55.34%（57/103），低于既往文獻(xiàn)報(bào)道[22]。分析原因，一方面是本研究納入的患者年齡較大（平均年齡大于60 歲），且FIGO 分期較高，該部分患者臨床治療難度較大，預(yù)后較差，患者的病死率較高；另一方面，本研究樣本量較小，結(jié)果可能存在一定的誤差偏倚。本研究進(jìn)一步分析宮頸癌組織中Pax1和LMX1A 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pax1 及LMX1A 表達(dá)陽性的宮頸癌患者5 年生存率較高，表明Pax1 和LMX1A 蛋白表達(dá)檢測有助于判斷宮頸癌患者的生存預(yù)后。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，高TNM 分期、低Pax1和低LMX1A蛋白表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 表達(dá)有可能成為新的判斷宮頸癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，但兩者的具體作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 表達(dá)下調(diào)，并與宮頸癌患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，檢測二者表達(dá)有助于宮頸癌患者的預(yù)后預(yù)測。