增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定貝類中42種除草劑殘留

朱富強(qiáng)，郭宇鵬，潘 軍，韓巖君，吳 濤

（1 濱州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濱州 256600 2 濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心 山東濱州 256600）

除草劑對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品的增產(chǎn)、 增收發(fā)揮著重要作用。 然而，不合理施用和濫用除草劑，易使其通過(guò)滲透或地表徑流進(jìn)入河口和淺海生態(tài)系統(tǒng)，造成近岸海域除草劑殘留污染[1]。 近年來(lái)，我國(guó)近岸海域表層海水中屢次檢出除草劑殘留[2-3]，有研究表明，某些三嗪類及酰胺類除草劑在海水中相比于河水中更難降解[4-5]，貝類主要棲息于近岸海域及潮間帶，生長(zhǎng)位置較為固定，極易富集農(nóng)藥殘留等污染物[6-7]，最終通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人類健康造成影響。 建立貝類中多種除草劑殘留的檢測(cè)方法，對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估貝類的食用安全風(fēng)險(xiǎn)，保障人體健康具有重要意義。

目前，貝類中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8]、 氣相色譜法（GC）[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[10]及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[11]等，其中，LCMS/MS 具有靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，重現(xiàn)性好，無(wú)需衍生等優(yōu)點(diǎn)。貝類中蛋白質(zhì)和脂肪含量豐富，基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定前需進(jìn)行凈化處理。凝膠滲透色譜法（GPC）[12]、QuEChERS 法[13]、固相萃取法（SPE）[14]是常用的凈化方法。 GPC 法除脂效果好，而操作繁瑣復(fù)雜，不適用于大批量樣品檢測(cè)。QuEChERS 凈化法主要利用石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18） 及N-丙基乙二胺（PSA）等對(duì)干擾組分實(shí)現(xiàn)高效快速凈化，然而，對(duì)于理化性質(zhì)各異的多組分農(nóng)藥，在凈化過(guò)程中可能會(huì)導(dǎo)致部分農(nóng)藥損失，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的SPE 處理方法操作復(fù)雜，影響結(jié)果穩(wěn)定性和檢驗(yàn)效率，不能滿足高通量樣品快速檢測(cè)要求。

增強(qiáng)型脂質(zhì)去除 （Enhanced matrix removal，EMR-Lipid）是一種新型的高聚物吸附劑，可通過(guò)疏水相互作用和體積排阻作用的結(jié)合高效吸附脂類等雜質(zhì)。 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除（Captiva EMR-Lipid）固相萃取柱是在EMR-Lipid 基礎(chǔ)上升級(jí)而成，以固相萃取方式，可實(shí)現(xiàn)通過(guò)式一步凈化，與傳統(tǒng)的SPE 法相比，無(wú)需活化、淋洗、洗脫等操作，更為高效快速。對(duì)于脂類含量較高的樣品，增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取法具有良好的凈化效果[15-16]，而該法用于水產(chǎn)品中除草劑等農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 本文采用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取法凈化樣品，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，高效準(zhǔn)確測(cè)定了貝類中42 種除草劑殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Tedia 公司；甲酸（純度＞99%），美國(guó)ACS 恩科化學(xué)；萃取鹽包（內(nèi)含1.0 g 無(wú)水檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸二鈉鹽水合物、4.0 g 無(wú)水硫酸鎂、1.0 g 氯化鈉）、Captiva EMRLipid 固相萃取柱 （3 mL/300 mg）、EMR-Lipid 凈化管、EMR-Lipid Polish 萃取管，美國(guó)Agilent 公司；PSA、GCB，天津博納艾杰爾科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：胺苯磺隆、環(huán)丙嘧磺隆質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，BePure 公司； 苯磺隆質(zhì)量濃度為100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；其余39 種標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

貝類樣品，本地批發(fā)市場(chǎng)及網(wǎng)購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS 串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)沃特世公司；Shim-pack GIST C18-AQ 色譜柱 （100 mm × 2.1 mm，1.9 μm），島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；3-18K5 離心機(jī)，德國(guó)SIGMA 公司；CP225D 電子分析天平，德國(guó)Sartorius 公司；Milli-Q Advantage A10 超純水儀，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 各準(zhǔn)確移取42 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL。 臨用前以空白基質(zhì)提取液進(jìn)行稀釋。

1.3.2 樣品前處理 提?。悍Q取均質(zhì)樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 純水，充分混合，渦旋振蕩1 min，加入10.0 mL 乙腈，充分混合，渦旋振蕩5 min，再加入萃取鹽包，充分混合，渦旋振蕩1 min 后，以6 000 r/min離心5 min 后取上清液，待凈化。

QuEChERS 凈化[17]：準(zhǔn)確移取1 mL 上清液，置于裝有50 mg PSA 和20 mg GCB 的離心管中，渦旋振蕩1 min 后，以6 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 尼龍針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，待測(cè)。

EMR-Lipid 凈化： 準(zhǔn)確移取5 mL 上清液，提取液至EMR-Lipid 凈化管中 （提前用5 mL 純水充分潤(rùn)濕活化），渦旋振蕩2 min，于6 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至EMR-Polish 管中，劇烈振蕩1 min 進(jìn)行鹽析后以6 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 尼龍針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，待測(cè)。

Captiva EMR-Lipid 凈化： 準(zhǔn)確移取2.4 mL上清液與0.6 mL 純水混合，通過(guò)Captiva EMRLipid 固相萃取柱，重力作用下收集濾液，經(jīng)0.22 μm 尼龍針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件 Shim-pack GIST C18-AQ 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A 相）、乙腈（B 相）。 流速：0.3 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL。 梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%B；1.5～15.0 min，10%B～95%B；15.0～17.5 min，95%B；17.5～18.0 min，95%B～10%B；18.0～20.0 min，10%B。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源： 電噴霧電離源（ESI）；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：正離子模式；毛細(xì)管電壓：2.00 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h； 脫溶劑氣溫度：500 ℃；碰撞氣流速：0.15 mL/min； 錐孔反吹氣流量：150 L/h；錐孔電壓：均為10 V。 42 種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的選擇 以流動(dòng)注射方式，在電噴霧電離模式下，比較正負(fù)離子模式下的42 種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/L）質(zhì)譜信號(hào)，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下的各目標(biāo)物正離子信號(hào)普遍比負(fù)離子模式強(qiáng)，故選用正離子模式。 分別對(duì)質(zhì)量濃度為100 μg/L 的各目標(biāo)化合物單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定分子離子，然后以分子離子為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，篩選碎片離子，選取響應(yīng)值高、干擾少的2 個(gè)子離子作為特征子離子，其中以響應(yīng)值高的子離子作為定量離子。 在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，確定最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)，使各目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最佳。 各目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 42 種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 42 analytes

2.1.2 色譜條件的選擇 選擇Shim-pack GIST C18-AQ 分析柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）進(jìn)行色譜分離，由于酸性環(huán)境下有利于正離子電離，故以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A 相，并考察甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相B相時(shí)，對(duì)質(zhì)譜信號(hào)及分離的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇時(shí)，42 種目標(biāo)化合物峰響應(yīng)值整體較低，且特丁通峰型分叉；采用0.1%甲酸甲醇時(shí)，峰響應(yīng)值略有提高，特丁通峰型正常。 采用乙腈時(shí)，與甲醇及0.1%甲酸甲醇相比，峰保留時(shí)間略有提前，而峰響應(yīng)值更高，各目標(biāo)化合物峰型尖銳；采用0.1%甲酸乙腈時(shí)，峰響應(yīng)值、峰保留時(shí)間及峰型較乙腈差別較小，故最終采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相。 圖1 為空白菲律賓蛤仔基質(zhì)溶液中加標(biāo)42 種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖。

圖1 菲律賓蛤仔樣品中添加42 種目標(biāo)化合物（添加水平為5 μg/kg）的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the 42 analytes in Ruditapes philippinarum sample（5 μg/kg for each analyte）

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

乙腈是農(nóng)藥殘留分析中常用提取液[18-19]，對(duì)于動(dòng)物源性樣品的提取，相比較丙酮、正己烷等提取液，乙腈具有良好的沉降蛋白效果，且萃取出的脂類雜質(zhì)較少[20]，并有利于后續(xù)樣品凈化。 在空白菲律賓蛤仔中添加質(zhì)量濃度為5 μg/kg 的目標(biāo)化合物，考察乙腈、0.1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈的提取效率，結(jié)果表明，采用乙腈、0.1%乙酸乙腈及1%乙酸乙腈時(shí)，提取效率差異較小，均可滿足要求，綜合考慮成本及環(huán)保，選用乙腈作為提取溶劑。

貝類等動(dòng)物源性樣品中含有大量脂肪及磷脂類、蛋白質(zhì)等干擾基質(zhì)，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果及儀器性能帶來(lái)影響，需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。在空白菲律賓蛤仔基質(zhì)樣品加標(biāo)量為5 μg/kg 時(shí)，考察了QuEChERS、EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取3 種凈化方式的效果，結(jié)果表明，按照文獻(xiàn)[17]所報(bào)道的QuEChERS 法，采用PSA 及GCB 作為凈化材料，所得凈化液澄清透明（見(jiàn)圖2），這是因?yàn)镚CB 對(duì)色素具有良好的吸附效果，然而15 種磺酰脲類除草劑平均回收率小于20%（見(jiàn)圖3），主要原因可能是由于PSA 含堿性基團(tuán)，磺酰脲類除草劑顯弱酸性，兩者發(fā)生吸附[21]，導(dǎo)致回收率降低。 采用EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取凈化時(shí)，效果比較理想，42 種目標(biāo)化合物平均回收率均在90%～110%之間，見(jiàn)圖3。 與EMR-Lipid 凈化方法相比，因Captiva EMR-Lipid 凈化方法更為便捷高效，且通過(guò)對(duì)比凈化后所得樣品，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Captiva EMR-Lipid 凈化，樣品溶液更為澄清透明 （見(jiàn)圖2），故選用Captiva EMR-Lipid 固相萃取凈化方式。

圖2 經(jīng)不同凈化方式處理后菲律賓蛤仔提取液照片F(xiàn)ig.2 Graphs of the Ruditapes philippinarum extracts cleaned up by different purification methods

圖3 3 種凈化方法的回收率比較Fig.3 Comparison among recoveries of 3 purification methods

2.3 進(jìn)樣體積的選擇

凈化后所得濾液的溶劑為80%乙腈，其洗脫強(qiáng)度強(qiáng)于初始流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，易導(dǎo)致溶劑效應(yīng)，致使柱效降低，峰型變差。 稀釋樣品或減少進(jìn)樣量可降低溶劑效應(yīng)的影響，為簡(jiǎn)化操作步驟，避免稀釋對(duì)方法檢出限的影響，本文采用減小進(jìn)樣量的方法降低溶劑效應(yīng)的影響，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)，50%以上目標(biāo)化合物峰型較差，當(dāng)進(jìn)樣量為2 μL 時(shí)，各目標(biāo)化合物峰型均正常，故最終將進(jìn)樣量確定為2 μL。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在電噴霧電離模式下，基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在離子化時(shí)，會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。 基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)定性、定量結(jié)果造成影響?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式為：基質(zhì)效應(yīng)（ME）=（空白基質(zhì)配制校準(zhǔn)曲線斜率/空白溶劑配制校準(zhǔn)曲線斜率-1）×100%[22]。當(dāng)|ME|＜20%時(shí)，表明為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)20%≤|ME|≤50%時(shí)，表明為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|＞50%時(shí)，表明為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。 考察了目標(biāo)化合物在菲律賓蛤仔中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，未凈化時(shí)有5 種目標(biāo)化合物為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，占比11.9%，14 種目標(biāo)化合物為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，占比33.3%；經(jīng)Captiva EMR-Lipid 凈化后，僅有5 種目標(biāo)化合物（苯噻酰草胺、胺苯磺隆、醚磺隆、玉嘧磺隆、磺?；锹。┍憩F(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)（占比11.9%），其余37 種目標(biāo)化合物均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，這表明Captiva EMR-Lipid 凈化效果顯著，有效降低了基質(zhì)影響。本文采用空白基質(zhì)匹配外標(biāo)校正進(jìn)行定量分析，可進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng)影響。

圖4 菲律賓蛤仔基質(zhì)溶液中目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度等級(jí)分布比率Fig.4 Ratio distribution of different matrix effect strength levels of analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

以空白菲律賓蛤仔樣品提取溶液配制42 種目標(biāo)化合物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用所建立的方法進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積（Y）對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸。 以信噪比S/N=3 確定方法的檢出限，以S/N=10 確定方法的定量限。 結(jié)果見(jiàn)表2，在0.2～20 μg/L 范圍內(nèi)，42 種目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.992。 42 種目標(biāo)化合物的方法檢出限為0.2～0.4 μg/kg，方法定量限為0.5～1.0 μg/kg。

表2 42 種目標(biāo)化合物在空白菲律賓蛤仔基質(zhì)中線性關(guān)系、方法檢出限、定量限Table 2 Correlation equations，limits of detection （LODs） and limits of quantification （LOQs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（續(xù)表2）

2.6 回收率與精密度

應(yīng)用所建立的方法，以空白菲律賓蛤仔樣品為驗(yàn)證基質(zhì)，分別添加1 倍LOQ、2 倍LOQ、10 倍LOQ 的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6 次，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表3，42 種目標(biāo)化合物在實(shí)際空白菲律賓蛤仔樣品中的3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為61.0%～110.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～17.4%。

表3 42 種目標(biāo)化合物在空白菲律賓蛤仔基質(zhì)中加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Average spiked recoveries，and relative standard deviations （RSDs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（續(xù)表3）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)2021年6月份購(gòu)自本地批發(fā)市場(chǎng)及網(wǎng)購(gòu)的23 批次樣品（菲律賓蛤仔5 批次、文蛤4 批次、櫛孔扇貝4 批次、四角蛤蜊3 批次、長(zhǎng)牡蠣3 批次、毛蚶2 批次和紫貽貝2 批次）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 批次菲律賓蛤仔、3 批次文蛤、2批次長(zhǎng)牡蠣中檢出除草劑殘留，櫛孔扇貝、四角蛤蜊、毛蚶及紫貽貝中均未檢出除草劑殘留。陽(yáng)性樣品檢出結(jié)果見(jiàn)表4。 長(zhǎng)牡蠣和文蛤中除草劑檢出率較高，且存在多種除草劑復(fù)合污染的情況，這與文獻(xiàn)[23]報(bào)道相符。

表4 樣品分析結(jié)果Table 4 Analytical results of samples

現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[24]尚未規(guī)定貝類中三嗪類、 酰胺類及磺酰脲類等除草劑殘留限量值。日本《食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》[25]中規(guī)定的“一律標(biāo)準(zhǔn)”限量值為0.01 mg/kg，由表4 得知，一批次文蛤中西草凈及撲草凈檢出結(jié)果（19.2 μg/kg 和20.0 μg/kg）均已超過(guò)此限量要求，1 批次文蛤中撲草凈檢出結(jié)果（9.2 μg/kg）接近此限量要求，貝類中除草劑殘留風(fēng)險(xiǎn)需引起重視。

3 結(jié)論

本文建立了以增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定貝類中14 種三嗪類、13 種酰胺類及15 種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。 研究結(jié)果表明，方法的提取凈化效率快，效果好，靈敏度和準(zhǔn)確度高，平均回收率為61.0%～110.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～17.4%。 可滿足貝類中42 種三嗪類、酰胺類及磺酰脲類除草劑殘留定性、定量分析要求，這為貝類中農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供了新的可行途徑。