氧化白藜蘆醇協(xié)同抗壞血酸抑制余甘子酶促褐變的機(jī)制研究

陳 軍，陳洪彬，郭鳳仙，鄭瑞生，林河通，鄭宗平*

（1 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院 福建泉州 362000 2 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

余甘子（Phyllanthus emblica）為大戟科植物余甘子的果實(shí)，為熱帶、亞熱帶地區(qū)特色水果，在我國主要分布在福建、廣西、廣東、云南、海南等省份[1]。 余甘子具有健胃止咳、清熱涼血、治療血瘀、減輕腹疼、緩解喉嚨干疼、清新口腔的藥用價(jià)值[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，余甘子對高血壓[5]、糖尿病[6]具有一定的預(yù)防和治療作用，并且具有抗病毒[7]、抗炎[8]、抗腫瘤[9]、抗氧化[10]、抗癌[11]、護(hù)肝[12]等功效。 現(xiàn)有研究主要集中在余甘子的藥理作用和藥用價(jià)值，而對余甘子采后加工貯藏及抗褐變鮮有研究。余甘子采后在加工和貯藏過程中逐漸變黃，形成果實(shí)褐變，在余甘子果汁飲料加工過程中，隨著時(shí)間的延長，會(huì)出現(xiàn)褐色沉淀，影響其感官、營養(yǎng)價(jià)值。因此，減緩余甘子在采后貯藏和加工過程中的褐變問題，對余甘子資源的開發(fā)具有重要意義。

酶促褐變是引起果蔬褐變的重要原因，主要通過多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶等酶以及氧氣的參與，將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進(jìn)一步氧化聚合或通過非酶促褐變反應(yīng)與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)聚合縮合，形成褐變物質(zhì)，導(dǎo)致果蔬的營養(yǎng)、感官、經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低[13]。 抑制酶促褐變可從氧氣、酚類物質(zhì)和褐變酶等3 個(gè)方面入手，通過隔絕氧氣、鈍化酶活性、抑制酶的活性等手段抑制或減緩酶促褐變的發(fā)生，通過阻止酶、底物、氧氣同時(shí)存在且相互接觸的方法阻止酶促褐變的發(fā)生[14]。

氧化白藜蘆醇（Oxyresveratrol，OXY）為二苯乙烯類物質(zhì)，前期研究表明，OXY 對多酚氧化酶有很強(qiáng)抑制作用，抑制活性遠(yuǎn)勝于曲酸[15-16]。 Wang等[17]以酪氨酸為底物，研究OXY 對PPO 的抑制機(jī)制為可逆的混合型抑制。 近幾年，OXY 被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜的抗褐變研究，結(jié)果表明其有很好的效果。 陳春等[18]研究OXY 對蘋果鮮切片及鮮榨果汁的抗褐變作用，表明OXY 對貯藏期蘋果的多酚氧化酶活性、 過氧化物酶活性有較好的抑制作用，能顯著降低褐變度。 在實(shí)際應(yīng)用中，復(fù)合護(hù)色劑對果蔬的鮮切片或鮮榨果蔬汁進(jìn)行護(hù)色有更好的效果，He 等[19-20]利用OXY 和抗壞血酸（VC）對藕片、葡萄汁的抗褐變效果，研究表明，復(fù)合使用的抗褐變效果比單獨(dú)使用OXY 更好。 Li 等[21]也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用OXY 對蘋果鮮切片抗褐變效果沒有聯(lián)合使用OXY+VC 的效果好。 到目前為止，研究者多以單一抑制劑對多酚氧化酶進(jìn)行抑制研究，而利用復(fù)合抑制劑對多酚氧化酶抑制機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。 本研究采用OXY 聯(lián)合VC 對余甘子切片進(jìn)行抗褐變研究，同時(shí)研究其酶抑制動(dòng)力學(xué)，探明OXY 聯(lián)合VC 對余甘子的多酚氧化酶的協(xié)同抑制機(jī)理，為余甘子采后貯藏和加工過程中抗褐變提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子（品種為“玻璃甘”），泉州水果批發(fā)市場；二甲基亞楓（DMSO）、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、抗壞血酸（VC）、創(chuàng)愈木酚、苯丙氨酸、焦性沒食子酸、4-己基間苯二酚（4-HR）、PPO，Sigma 公司；30%過氧化氫、鹽酸（分析純級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧化白藜蘆醇，上海源葉生物有限公司；試驗(yàn)用水為去離子水。

ZRX-260 低溫人工氣候箱，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H2050R 型臺式高速大容量冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；ADCI 系列全自動(dòng)色差計(jì)，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 余甘子切片的L 值、△E 的測定 挑選大小、成熟度一致，無機(jī)械損傷的新鮮余甘子，洗凈，切成直徑約為2～3 cm 的余甘子果片，將切好的余甘子切片浸泡于500 mL 待護(hù)色溶液中，3 min 后取出瀝干，放于塑料平板上，于室溫下晾干后，置于相對濕度為85%，溫度為25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，測試樣品包括去離子水（CK）、0.02%OXY、0.01%4-HR、0.15%VC、0.02%OXY+0.15%VC、0.01%4-HR+0.15%VC 溶液。

將浸泡護(hù)色液后晾干的余甘子切片用ADCI色差計(jì)測量余甘子切片的L（亮度）、a（紅-綠）和b（黃-藍(lán)）值，在間隔時(shí)間為0，6，12，18，24，30，36 h 時(shí)，分別測出其色差值，不同組樣品各測量10個(gè)不同余甘子切片，取平均值，△E 代表不同樣品總色差度，計(jì)算公式如下[22]：

式中，△E——總色差度；Lt、at、bt——t 時(shí)刻的L、a、b 值；L0、a0、b0——0 時(shí)刻的L、a、b 值。

1.2.2 余甘子切片褐變度的測定 參照關(guān)正萍等[23]的方法略有改動(dòng)，將經(jīng)液氮處理的余甘子果片用萬能粉碎機(jī)粉碎，各組稱取2 g 余甘子粉末，冰浴研磨，12 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液，定容10 mL 后，經(jīng)酶標(biāo)儀測定在420 nm 波長處的吸光值，平行操作3 次，以每克鮮重在波長420 nm 處吸光值表示褐變度（OD420nm/g）。

1.2.3 余甘子切片PPO、POD、PAL 的提取 將經(jīng)液氮處理的余甘子果片用萬能粉碎機(jī)粉碎，各組稱取2 g 余甘子粉末用含2%PVPP，0.1%VC，磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制而成，pH 6.8）冰浴研磨，經(jīng)2 000 r/min 離心15 min，取上清液，定容至10 mL，制得粗酶液。

1.2.4 余甘子切片PPO 活性的測定 酶的活性測定方法參照謝征蕓等[24]的方法略有改動(dòng)，即向試管中加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）配成的0.1 mol/L 的焦性沒食子酸溶液，1.5 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），放入30 ℃水浴2 min 后，以去離子水做參比液，加入0.5 mL 酶液，立刻測試在420 nm 波長下的吸光值，測試之后立刻倒回試管，放入30 ℃水浴鍋中，反應(yīng)5 min 后，立刻測定420 nm 波長下的吸光值，平行操作3 次，定義每分鐘每克余甘子酶促反應(yīng)吸光值增加0.001 為1 個(gè)酶活力單位（U），PPO 活性單位為U/g·min。

式中，△A420nm——酶反應(yīng)前、 后吸光值之差；VT——酶液提取的總體 （mL）；M——待測材料的質(zhì)量（g）；Vs——測定時(shí)所取樣品提取液體積（mL）；T——反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.5 余甘子切片POD 的測定 過氧化物酶活性測定參照曹健康等[25]方法略有改動(dòng)，吸取3.0 mL 由磷酸鹽緩沖液 （pH 6.8） 配成的25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液和0.1 mL 酶液，置于30 ℃水浴2 min，加入0.1 mL 2 mol/L 的H2O2溶液，將反應(yīng)混合液迅速倒入比色皿，在475 nm 波長下測定吸光值，結(jié)果記為OD0，以去離子水為參比液，測量后倒回試管，在30 ℃下水浴預(yù)熱5 min 后，測量反應(yīng)溶液吸光值，記為OD1，做差得△A475nm，以每分鐘每克余甘子酶促反應(yīng)吸光值增加0.01 為1 個(gè)過氧化物酶活性單位（U），平行操作3 次，POD 活性單位為U/g·min。

式中，△A475nm——酶反應(yīng)前、 后吸光值之差；V——酶液提取的總體和（mL）；Vs——測定時(shí)所取樣品提取液的體積（mL）；t——反應(yīng)時(shí)間（min）；m——待測材料的質(zhì)量（g）。

1.2.6 余甘子切片PAL 活性的測定 酶液提取同1.2.3 節(jié)的方法，PAL 活性測定參照曹健康等[25]的方法，平行操作3 次，PAL 活性單位為U/g·h。

式中，OD1——反應(yīng)60 min 后的吸光值；OD0——反應(yīng)0 min 時(shí)的吸光值；V——樣品液提取的總體積（mL）；Vs——測定時(shí)所取樣品提取液體積（mL）；T——酶促反應(yīng)時(shí)間（h）；m——樣品質(zhì)量（g）。

1.2.7 OXY、OXY+VC 對PPO 抑制活性的測定 參考張龍[26]的方法，并做適當(dāng)修改。 將抑制劑樣品溶解于DMSO 中配制成1 mmol/L 的溶液，用去離子水稀釋成所需濃度。 然后將底物L(fēng)-DOPA 和PPO溶解在磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）中，分別配成濃度為1 mmol/L 和200 U/mL 的溶液，4 ℃避光保存待用。 先在試管中加入3.0 mL 底物L(fēng)-DOPA 溶液，然后向其中添加100 μL 不同濃度的OXY、OXY+VC 溶液，用漩渦混勻器混勻，放置于30 ℃水浴鍋中溫浴2 min，最后加入100 μL PPO 溶液，立刻混勻，用紫外可見分光光度計(jì)于475 nm波長處測定吸光值，在30 ℃恒溫條件下繼續(xù)反應(yīng)10 min 后，再次測定體系在475 nm 波長處吸光度，平行操作3 次。 100 μL DMSO 代替體系中的OXY、OXY+VC 溶液作為空白對照；不同濃度曲酸（KA）、KA+VC 溶液作為陽性對照。 IC50為使PPO活力下降至50%時(shí)OXY、OXY+VC 的濃度。 采用公式（5）計(jì)算化合物對PPO 活性的抑制率：

式中，A1——空白組0 min 的吸光度；A2——空白組10 min 后的吸光度；B1——樣品組0 min的吸光度；B2——樣品組10 min 后的吸光度。

1.2.8 OXY+VC 相互作用的評價(jià) 參考王慶華等[27]的方法略有改動(dòng)，兩種復(fù)合抑制劑對PPO 的作用，用相互作用系數(shù)γ 表示，當(dāng)γ﹥1 時(shí)，表示為拮抗作用，當(dāng)γ﹤1 時(shí)，表示為協(xié)同作用。 γ 值越大，表明拮抗作用越強(qiáng)，γ 值越小，表示協(xié)同作用越強(qiáng)。

式中，IC50A、IC50B——分別表示抑制劑A、B 單獨(dú)使用時(shí)，對PPO 抑制率為50%時(shí)的質(zhì)量濃度（μmol/L）；IC50a、IC50b——分別表示抑制劑A、B 復(fù)合使用時(shí)，對PPO 抑制率為50%時(shí)的質(zhì)量濃度（μmol/L）。

1.2.9 OXY、OXY+VC（1∶7）對PPO 抑制作用方式的測定 參照張龍[26]方法略有改動(dòng)。 加入3.0 mL由磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）配成的濃度為1 mmol/L的L-DOPA，然后加入100 μL 不同濃度的抑制劑，30 ℃水浴2 min，加入100 μL 不同濃度的PPO，立刻混勻，用紫外可見分光光度計(jì)于475 nm 波長處測定吸光值，在30 ℃恒溫條件下繼續(xù)反應(yīng)10 min 后，再次測定體系吸光度，測定體系吸光值變化，用酶促反應(yīng)速度V （OD475nm/min）與PPO 的濃度作圖，根據(jù)曲線特點(diǎn)判斷該抑制劑對PPO 的抑制作用方式。 若得到一組相交于原點(diǎn)的直線，則抑制劑對PPO 的抑制方式為可逆抑制；若得到一組不相交的平行直線，則為不可逆抑制。

1.2.10 OXY、OXY+VC 對PPO 抑制類型和抑制常數(shù)的測定 參照張龍[26]方法略有改動(dòng)，向試管中加入3 mL 不同濃度的L-DOPA 溶液，在30 ℃水浴條件下，測定不同濃度的抑制劑對PPO 活力的影響，此時(shí)PPO 溶液加入量是0.1 mL，濃度為200 U/mL，最后采用以L-DOPA 濃度的倒數(shù)S-1為橫坐標(biāo)，以酶促反應(yīng)速率（OD475nm/min）的倒數(shù)V-1為縱坐標(biāo)的雙倒數(shù)作圖法作圖，根據(jù)圖形特點(diǎn)來判斷抑制類型。 以直線的斜率（Slope）和縱坐標(biāo)的截距（Intercept）分別對抑制劑濃度進(jìn)行二次作圖，可求得相應(yīng)的抑制劑對游離酶的抑制常數(shù)KI以及對酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)KIS，如公式（7），（8）所示：

式中，Km——米氏常數(shù)；Vmax——最大反應(yīng)速度 （mol/L·min）；[I]——抑制劑濃度（mol/L）；KI——抑制劑對游離酶的抑制常數(shù)（μmol）；KIS——酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)（μmol）。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 處理，經(jīng)Sigma.Plot 12.5 軟件繪制，顯著性差異經(jīng)SPSS Statistics 22.0 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 OXY 協(xié)同VC 對余甘子L 值、△E 值的影響

從圖1a 可以看出，隨著時(shí)間的延長，各處理組的L 值均呈下降趨勢，對照組（CK）L 值下降最快且最低，OXY+VC 處理組的L 下降最慢且最高，OXY、4-HR+VC、VC、4-HR 處理組的余甘子L 值依次降低。 0～6 h，OXY、VC、OXY+VC、4-HR+VC處理 組的L 值相差不大；6～12 h 期間，OXY 和OXY+VC 聯(lián)合處理組的L 值仍相差不大，然而VC、4-HR+VC 處理組L 值下降速度變快；從12 h開始，OXY 處理組L 值與OXY+VC 聯(lián)合處理組差距逐漸加大，OXY+VC 復(fù)合處理組的余甘子L 值均高于OXY、VC 單獨(dú)處理組，表明OXY 聯(lián)合VC后，對抑制余甘子切片L 值下降的效果比單獨(dú)使用更佳。

圖1 OXY 協(xié)同VC 對余甘子L 值（a）、△E 值（b）的影響Fig.1 Effects of OXY + VC on L value （a），△E （b） values of P.emblica

從圖1b 可以看出，各組的△E 值均隨著時(shí)間的延長而增加。 在0～12 h，OXY、VC、OXY+VC、4-HR、4-HR+VC 組的△E 值相差不大；12～36 h，4-HR 組的△E 值高于VC、4-HR+VC。 總體來看，CK、4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 組 的△E 值依次降低，表明4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 均對余甘子的△E 值的上升有抑制作用，單獨(dú)組余甘子切片的△E 值高于聯(lián)合組，表明聯(lián)合使用對余甘子切片△E 值升高的抑制作用比單獨(dú)使用強(qiáng)。

2.2 OXY 協(xié)同VC 對余甘子褐變度的影響

褐變度是褐變現(xiàn)象最直觀的表現(xiàn)，褐變度高表示褐變程度大，對產(chǎn)品造成的視覺效果最為明顯，是影響感官價(jià)值的直接指標(biāo)。 從圖2 可以看出，各組的褐變度值均隨著時(shí)間的延長而增加，在0～6 h，各組的褐變度緩慢增加，6～24 h 期間快速增加，24～36 h 呈緩慢增加的趨勢。 在0～12 h，OXY、OXY+VC 組的褐變度沒有明顯變化且兩組的褐變度值相差不大，其它組的褐變度值快速增加且高于OXY、OXY+VC 組，說明在0～12 h，OXY、OXY+VC 能明顯抑制余甘子切片褐變現(xiàn)象的發(fā)生；12～36 h，OXY、OXY+VC 組的褐變度快速增加，且OXY+VC 組的褐變度值略低于OXY 單獨(dú)組，說明OXY 聯(lián)合VC 處理和OXY 單獨(dú)處理對余甘子切片的褐變度值的影響在貯藏后期相差不大。

圖2 OXY 協(xié)同VC 對余甘子褐變度的影響Fig.2 Effects of OXY + VC on browning degree of P.emblica

2.3 OXY 協(xié)同VC 對余甘子PPO、POD、PAL的影響

PPO 是引起褐變的關(guān)鍵酶，其活性的高、低與褐變程度呈正相關(guān)。 從圖3a 可以看出，在0～6 h，除CK 組外，各組的余甘子PPO 活性較低且變化不大，相差不明顯，說明在貯藏早期，各組對余甘子PPO 的活性有較好的抑制作用；6～18 h，各組的余甘子PPO 活性劇烈增加；18～36 h，各組的余甘子PPO 活性緩慢降低，在18 h 時(shí)，PPO 活性達(dá)到最高。 與各組相比，CK 組的余甘子PPO 活性最高，OXY+VC 組的余甘子PPO 活性最低，由此可知，聯(lián)合處理組的余甘子PPO 活性低于其單獨(dú)處理組的PPO 活性，說明OXY+VC 聯(lián)合處理對余甘子中的PPO 的抑制活性能力強(qiáng)于OXY、VC 單獨(dú)處理組。

圖3 OXY 協(xié)同VC 對余甘子PPO（a），POD（b），PAL（c）活性的影響Fig.3 Effects of OXY+ VC on PPO（a），POD （b），PAL （c） activity of P.emblica

POD 是引起余甘子褐變現(xiàn)象的另一關(guān)鍵性酶，在細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的條件下，產(chǎn)生過氧化氫，能作為過氧化物酶反應(yīng)的啟動(dòng)子，能使過氧化物酶迅速與酚類物質(zhì)反應(yīng)，形成褐變物質(zhì)，從而影響感官。 從圖3b 可以看出，各組POD 活性均呈先增加后減少的趨勢，在18 h 時(shí)活性最高。 在0～6 h，各組的余甘子POD 活性較低且相差不大；在6～36 h，4-HR+VC 組的POD 活性遠(yuǎn)低于4-HR 組，OXY 單獨(dú)組的POD 活性遠(yuǎn)高于OXY+VC 組。 在整個(gè)貯藏期間，OXY+VC 組的POD 維持在較低水平，數(shù)據(jù)表明，各組均對余甘子切片的POD 活性有抑制作用，OXY、VC 聯(lián)合處理比單獨(dú)處理對余甘子POD 活性抑制效果強(qiáng)。

PAL 能將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)能作為酶促反應(yīng)的底物，因此苯丙氨酸與褐變現(xiàn)象的發(fā)生有密切關(guān)系，其活性最高，表明非酚類物質(zhì)向酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化越多，酶促褐變反應(yīng)底物越充足。 從圖3c 可以看出，各組的PAL 活性隨著時(shí)間的延長，均呈下降趨勢，CK 組的PAL 活性保持較高水平，高于其它組，在0～6 h，4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 組的余甘子切片PAL 活性迅速下降； 在6～18 h，4-HR、VC、4-HR+VC、OXY、OXY+VC 組的余甘子切片PAL 活性緩慢下降；18～36 h，又快速下降。 在整個(gè)貯藏期內(nèi)，OXY、VC 與OXY+VC組相比，VC、OXY單獨(dú)處理組PAL 活性高于OXY+VC 處理組，表明OXY+VC 聯(lián)合處理對余甘子切片中的PAL 活性抑制作用強(qiáng)于OXY、VC 單獨(dú)處理。

2.4 OXY 協(xié)同VC 對PPO 活性的抑制作用

從圖4 可以看出，在OXY、OXY+VC（1 ∶7）溶液濃度為0～5 μmol/L 時(shí)，隨著濃度的增加，PPO活性迅速減少，其中在相同濃度下，OXY+VC（1 ∶7） 對PPO 活性的抑制作用強(qiáng)于OXY、VC 單獨(dú)處理。 KA、KA+VC（1∶7）、OXY、OXY+VC（1 ∶7）溶液處理的IC50值分別為 （70.005±0.805）μmol/L，（48.300 ±1.300）μmol/L，（3.300 ±0.010）μmol/L，（1.600±0.020）μmol/L。 與陽性對照KA 和KA+VC（1 ∶7） 相比，KA 的IC50是OXY 的21.210 倍，是OXY+VC（1 ∶7）的43.750 倍；而KA+VC（1 ∶7）是OXY 的14.630 倍，是OXY+VC （1∶7） 的30.188倍。 綜合來看，各抑制劑對PPO 的抑制強(qiáng)弱能力為OXY+VC﹥OXY﹥KA+VC（1∶7）﹥KA。 OXY 為強(qiáng)PPO 抑制劑，OXY 聯(lián)合VC 處理后對PPO 抑制作用加強(qiáng)且差異顯著（P﹤0.05）。

圖4 曲酸（a）和氧化白藜蘆醇（b）對余甘子PPO 的抑制作用Fig.4 Inhibition effects of kojic acid （a） and oxyresveratrol （b） on PPO of P.emblica

2.5 OXY、VC 對PPO 抑制的相互作用的評價(jià)

經(jīng)計(jì)算得到γ OXY+VC （1∶7）=0.5044＜1，表明OXY 與VC 對PPO 的抑制作用有較好的協(xié)同作用，這可能與OXY 和VC 均有不飽和乙烯類共價(jià)鍵有關(guān)，既可以失去電子，又可以得到電子，兩者相互促進(jìn)，加強(qiáng)了對PPO 的抑制作用。

2.6 OXY、OXY+VC 對PPO 抑制方式的研究

從圖5 可以看出，通過對酶濃度和酶促反應(yīng)速度作圖，所有的圖形均經(jīng)過原點(diǎn)，隨著抑制劑濃度的增加，斜率逐漸降低，表明OXY、OXY+VC 對PPO 活性的抑制作用均為可逆的，PPO 的活性下降是由于抑制劑的濃度增加所致，而不是由于PPO 有效酶活力減少所致。

圖5 OXY （a）和OXY+VC （1∶7） （b）對PPO 的抑制方式Fig.5 Inhibition mode of OXY （a） and OXY+VC （1∶7） （b） on PPO

2.7 OXY、OXY 協(xié)同VC 對PPO 抑制類型及抑制常數(shù)的測定

2.7.1 OXY 對PPO 抑制類型及抑制常數(shù)的測定

由圖6a 可知，通過雙倒數(shù)研究OXY 對PPO 作用獲得在第二象限相交的一組直線，說明隨著OXY 濃度的增加，導(dǎo)致Km值變大而Vmax逐漸變小，說明OXY 對PPO 的抑制類型是混合型抑制，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。 表明OXY 既可以與游離的PPO 活性中心結(jié)合，阻止底物與酶接觸，又可以與PPO 和底物形成的復(fù)合物結(jié)合，阻止褐變物質(zhì)的形成。 以O(shè)XY 濃度和各直線的斜率進(jìn)行二次作圖，得到圖6b，結(jié)合公式（7，8）可求出OXY 對游離的PPO 的抑制常數(shù)KI為0.904 μmol/L；以各直線y 軸的截距對OXY 濃度進(jìn)行二次作圖得圖6c，并結(jié)合公式（7，8）求出OXY 對酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)KIS值為14.285 μmol/L。 抑制常數(shù)越小越好，KIS﹥KI，表 明OXY 對PPO 的 結(jié)合能力比OXY 對PPO-底物復(fù)合物的結(jié)合能力強(qiáng)。

圖6 OXY 對PPO 抑制類型（a）、抑制常數(shù)KI（b）、KIS（c）測定Fig.6 Determination of PPO inhibition type （a） and inhibition constant KI （b），KIS （c） of OXY

2.7.2 OXY+VC 對PPO 抑制類型及抑制常數(shù)的測定 通過雙倒數(shù)作圖法研究OXY+VC （1∶7）對PPO 的抑制類型，可得到一組相交于y 軸同一點(diǎn)的直線，如圖7a 所示，說明OXY+VC（1∶7）對PPO的作用是競爭性抑制類型。 以各直線的斜率對OXY+VC（1 ∶7）濃度進(jìn)行二次作圖可得到一條線性良好的直線，如圖7b 所示，表明OXY+VC（1∶7）對PPO 的抑制位點(diǎn)是單一的或單一類型的位點(diǎn)。通過這條直線結(jié)合公式（7，8），求得OXY+VC（1 ∶7）對PPO 的抑制常數(shù)KI值為0.840 μmol/L。

圖7 OXY+VC（1∶7）對PPO 抑制類型（a）及抑制常數(shù)KI（b）的測定Fig.7 Determination of PPO inhibition type （a） and inhibition constant KI （b） of OXY+VC （1∶7）

3 結(jié)論

氧化白藜蘆醇（OXY）和抗壞血酸（VC）能減緩余甘子在加工和貯藏過程中褐變現(xiàn)象的發(fā)生，二者聯(lián)合處理對余甘子切片的褐變有較好的抑制效果，其途徑主要通過抑制余甘子中的PPO、POD、PAL 活性，尤其是抑制PPO 的活性。 通過酶抑制動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OXY 和OXY+VC 對PPO的抑制方式均為可逆抑制，OXY 對PPO 的抑制為混合型抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道[16]一致。有趣的是，通過添加VC 后，OXY 與VC 聯(lián)合使用對PPO 的抑制由混合型抑制變?yōu)楦偁幮砸种?，這種聯(lián)合使用方式不僅提高了OXY 抗褐變能力，同時(shí)也改變了其對酶的作用方式。