益生菌臍橙全果汁工藝優(yōu)化及香氣成分分析

黃 帆，林 軍，袁洪燕，周麗玲，羅佳倩，李高陽，5*

（1 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長(zhǎng)沙 410125 2 湖南大學(xué)研究生院隆平分院 長(zhǎng)沙 410125 3 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410125 4 湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地 長(zhǎng)沙 410125 5 湖南省洞庭實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410125）

近年來，隨著人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)與健康的關(guān)注，含有益生菌的果蔬汁逐漸贏得大眾青睞。 利用果蔬汁制作益生菌產(chǎn)品，不僅可以提供菌體生長(zhǎng)繁殖需要的基本物質(zhì)，還適用于乳糖不耐癥或乳糖酶缺乏人群食用[1-2]。 發(fā)酵果蔬汁飲品富含大量的有益代謝產(chǎn)物，促使有益活性因子被人體腸道充分吸收，增強(qiáng)人體內(nèi)的益生菌效應(yīng)，維持腸道微生物群的生態(tài)平衡[3-4]。此外，乳酸菌在果蔬汁中繁殖至106CFU/mL 以上，就能達(dá)到延長(zhǎng)飲品貨架期的作用[5]。

臍橙是我國(guó)的大眾水果，富含大量對(duì)人體有益的成分，色澤誘人，酸甜適口，是最受歡迎的水果之一[6]。 目前臍橙加工以制汁為主，產(chǎn)生大量的果渣副產(chǎn)物，占臍橙鮮果總質(zhì)量50%左右[7]。 果渣中含有大量功能性成分，如果膠、膳食纖維、類黃酮、多酚等，對(duì)人體具有疏肝理氣、止咳潤(rùn)肺和預(yù)防心血管疾病等作用[8-9]。 開發(fā)臍橙全果產(chǎn)品不僅可以實(shí)現(xiàn)資源的全利用，而且可以保留果渣中的功能活性成分，從而提高橙汁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，實(shí)現(xiàn)“變廢為寶”。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)益生菌發(fā)酵臍橙汁的研究主要為壓榨取汁后進(jìn)行輕度發(fā)酵，而對(duì)臍橙全果制汁研究較少，果渣部分的營(yíng)養(yǎng)素及活性組分未得到利用[10-11]。在開發(fā)功能性益生菌臍橙全果飲品時(shí)，其工藝條件不僅對(duì)益生菌的生長(zhǎng)和生理功效起關(guān)鍵作用，還會(huì)影響產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和典型風(fēng)味。 本研究以臍橙全果汁為原料，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵，以活菌數(shù)和風(fēng)味為指標(biāo)優(yōu)化，分析最佳工藝條件下的風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，以期開發(fā)一款具有益生活性的臍橙全果汁飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

崀山臍橙，購(gòu)于邵陽市新寧縣，無損傷和腐爛。

菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），實(shí)驗(yàn)室分離保存。

MRS 培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

九陽高速破壁調(diào)理機(jī)JYL-Y99，九陽股份有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；高壓均質(zhì)機(jī)SRH，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；SPX-150 培養(yǎng)箱，中儀國(guó)科科技有限公司；50/30 μm 固相萃取儀，德國(guó)CNW 公司；GC-MS 聯(lián)用儀（7890A-5975C 型），美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 臍橙全果汁制備工藝流程[12]臍橙→洗凈→打漿→配比→過濾→高壓均質(zhì)→調(diào)配→巴氏殺菌→冷卻→發(fā)酵→益生菌臍橙全果汁。

操作要點(diǎn)[13-14]：臍橙經(jīng)自來水清洗、瀝水后打漿，剝皮后打汁；經(jīng)預(yù)試驗(yàn)得到臍橙全果汁的質(zhì)量比為全果漿∶果汁∶水=2∶8∶5。 用120 目尼龍紗布過濾得到臍橙全果汁，高壓均質(zhì)25～30 MPa，6 min，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH=4.5，加果葡糖漿8%進(jìn)行調(diào)配，于80 ℃巴氏殺菌10 min。

1.3.2 臍橙全果汁的發(fā)酵[15]將實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌和干酪乳桿菌分別置于MRS 肉湯中，36℃培養(yǎng)48 h，按照一定菌種比例，將活菌數(shù)約1×107CFU/mL 的菌液接種于100 mL 臍橙全果汁中。

1.3.3 臍橙全果汁的活菌計(jì)數(shù)和感官評(píng)分 活菌數(shù)參照GB 4789.35-2016《乳酸菌檢驗(yàn)》計(jì)數(shù)。 建立感官評(píng)定小組（10 人），從飲品的顏色、組織、風(fēng)味和口感進(jìn)行評(píng)分[16]。 評(píng)分細(xì)則見表1。

表1 全果汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria of whole juice

1.3.4 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 菌種比例的確定 根據(jù)工藝流程調(diào)配每份100 mL 臍橙全果汁，對(duì)菌種比例進(jìn)行單因素優(yōu)化。 將植物乳桿菌和干酪乳桿菌的比例設(shè)定為0∶1，1∶2，1∶1，2∶1，1∶0，接種量3%，35 ℃下靜置24 h，對(duì)臍橙全果汁進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.2 發(fā)酵溫度的確定 根據(jù)工藝流程調(diào)配每份100 mL 臍橙全果汁，對(duì)溫度進(jìn)行單因素優(yōu)化。按照菌種比例1∶1，接種量3%，將溫度設(shè)定為29，32，35，38，41 ℃，靜置發(fā)酵24 h，對(duì)臍橙全果汁進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.3 發(fā)酵時(shí)間的確定 根據(jù)工藝流程調(diào)配每份100 mL 臍橙全果汁，對(duì)時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化。按照菌種比例1∶1，接種量3%，溫度35 ℃，將靜置時(shí)間設(shè)定為6，12，24，36，48 h，對(duì)臍橙全果汁進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.4 接種量的確定 根據(jù)工藝流程調(diào)配每份100 mL 臍橙全果汁，對(duì)接種量進(jìn)行單因素優(yōu)化。按照菌種比例1∶1，將接種量設(shè)定為1%，2%，3%，4%，5%，35 ℃下靜置24 h，對(duì)臍橙全果汁進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.5 Box-Behnken 優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)，通過響應(yīng)面法獲得最優(yōu)發(fā)酵溫度、時(shí)間和接種量，以活菌數(shù)（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為模型響應(yīng)值[17-18]。 賦予權(quán)重各50%[19-20]。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面發(fā)酵工藝水平Table 2 Response surface fermentation technology level

1.3.6 GC-MS 取10 mL 樣品于進(jìn)樣瓶中，加入20 μL 環(huán)己酮（0.1894 mg/mL）和4 g 氯化鈉，在50℃水浴中平衡15 min，頂空吸附40 min，插入GC解吸5 min[21-22]。

色譜條件[23-24]： 色譜柱DB-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，以4 ℃/min 升至200 ℃（2 min），最終以10 ℃/min 升至250 ℃（10 min）； He 流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI 電離源，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，掃描范圍35～500 amu。

1.3.7 香氣成分分析[25]定性分析： 將數(shù)據(jù)與NIST 2011 質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)分析。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法，按照如下公式計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)重復(fù)3 次，用SPASS 22.0 軟件進(jìn)行方差

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的影響 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，逐步抵達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，活菌數(shù)明顯增大，隨后趨于平顯著性分析，OriginPro 2021b 軟件作圖，Design-Expert 8.0.6 軟件分析Box-Behnken。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菌種比例的影響 如圖1 所示，混合菌株能更好地適應(yīng)臍橙全果汁，比單一菌株發(fā)酵活菌數(shù)高，且混合菌株發(fā)酵飲品的喜愛度高。飲品中以1∶2 添加植物乳桿菌和干酪乳桿菌時(shí)，發(fā)酵后的活菌數(shù)增至最高值，然而，過多的乳酸菌會(huì)加快產(chǎn)品的發(fā)酵進(jìn)程，導(dǎo)致臍橙全果汁pH 值急速下降，酸甜比例失衡；當(dāng)配比為1∶1 時(shí)，酸甜適中，風(fēng)味濃郁，此條件下的飲品獲得最高評(píng)分（85.05 分）。全果汁中添加的菌種比例最優(yōu)為1∶1。

圖1 菌種比例與活菌數(shù)和感官評(píng)分的關(guān)系Fig.1 Relationship between bacteria proportion and viable count and sensory score

2.1.2 發(fā)酵溫度的影響 溫度升高，乳酸菌活力充分發(fā)揮作用，達(dá)到最大活菌數(shù)而后下降，然而，過高的溫度會(huì)導(dǎo)致臍橙全果汁發(fā)酵味濃郁，遮蓋了本身的果香味。 圖2 所示，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，果汁發(fā)酵適中，具有臍橙自身的風(fēng)味和典型的發(fā)酵味，兩種風(fēng)味相互融合，飲品達(dá)到最優(yōu)值為88.24分；溫度升至38 ℃時(shí)，乳酸菌繁殖速率最大，活菌數(shù)為1.15×109CFU/mL，而溫度在38～41 ℃時(shí)飲品中活菌逐漸下降。 全果汁發(fā)酵的最優(yōu)溫度為35℃。緩；然而，臍橙全果汁的發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致果汁顏色褐變，酸甜比例失衡，口感粗糙，飲品風(fēng)味差。圖3 所示，當(dāng)全果汁發(fā)酵24 h 時(shí)，乳酸菌增長(zhǎng)至7.9×108CFU/mL，之后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，飲品的感官特性為最優(yōu)值88.35 分；到發(fā)酵后期，果汁中的糖大量消耗，發(fā)酵過度，飲品的感官和風(fēng)味急劇下降。 全果汁發(fā)酵的最優(yōu)時(shí)間為24 h。

圖2 發(fā)酵溫度與活菌數(shù)和感官評(píng)分的關(guān)系Fig.2 Relationship between fermentation temperature and viable count and sensory score

圖3 發(fā)酵時(shí)間與活菌數(shù)和感官評(píng)分的關(guān)系Fig.3 Relationship between fermentation time and viable count and sensory score

2.1.4 接種量的影響 接種量過大，使飲品中的乳酸菌超過可容納最適值，加速乳酸菌死亡，導(dǎo)致感官特性下降。 圖4 所示，1%～3%接種量增加導(dǎo)致活菌數(shù)增加，果汁發(fā)酵未完全，使果香和發(fā)酵味較為寡淡；接種量3%～5%時(shí)，果汁中活菌數(shù)增加量趨于平緩，此時(shí)臍橙全果汁口感過酸，發(fā)酵風(fēng)味過重，導(dǎo)致感官接受度差。全果汁的最優(yōu)接種量為3%。

圖4 接種量與活菌數(shù)和感官評(píng)分的關(guān)系Fig.4 Relationship between inoculation amount and viable count and sensory score

2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken 結(jié)果分析 應(yīng)用Box-Behnken 設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn) （表3），分析不同溫度（A）、時(shí)間（B）、接種量（C）條件下的活菌數(shù)（Y1）和感官評(píng)分（Y2），根據(jù)模型可得響應(yīng)面的回歸方程為：

表3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-behnken design and results

Y1=9.01-0.068A+0.11B+0.019C+0.12AB-0.043AC+0.005BC-0.071A2-0.043B2-0.089C2

Y2=85.03-4.52A-3.48B+1.11C+1.35AB+1.79AC+2.84BC-8.52A2-6.62B2-3.69C2

根據(jù)表4 和表5 可知，活菌數(shù)和感官評(píng)分模型均有差異極顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)分別為0.2827>0.05 和0.2887>0.05 均差異不顯著，且兩個(gè)模型的R12=98.70%，R22=98.84%，說明模型用于此飲品發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化可信度高，擬合較好。由飲品中活菌數(shù)的方差分析可知，模型的A、B、AB、AC 及A2、B2、C2均存在極顯著差異（P<0.01），一次項(xiàng)C 差異顯著，而交互項(xiàng)BC 不顯著。 對(duì)飲品中感官評(píng)分進(jìn)行方差分析，模型A、B、BC 及A2、B2、C2均存在極顯著差異（P<0.01），一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC 差異顯著，而交互項(xiàng)AB 不顯著。 對(duì)模型中的F 值進(jìn)行判斷，對(duì)飲品中活菌數(shù)的影響排序?yàn)锽（時(shí)間）>A（溫度）>C（接種量），對(duì)感官特征影響排序?yàn)锳（溫度）>B（時(shí)間）>C（接種量）。

表4 活菌數(shù)方差分析Table 4 Analysis of variance of viable count

表5 感官評(píng)分方差分析Table 5 Sensory score analysis of variance

（續(xù)表3）

2.2.2 因素間交互作用分析 圖5 顯示不同因素間強(qiáng)、弱的等高線圖和三維曲面圖，響應(yīng)面的陡峭程度決定該因素的影響程度。 圖5a、5c、5e、5g 等高線橫向跨度較大，且非圓形，表明因素間具有交互影響。 圖5b、5h 相對(duì)5d、5f 較為陡峭，分析圖形可知接種量對(duì)響應(yīng)值均存在較小影響； 且隨著各因素的增加，響應(yīng)值增加到極值，然后隨著各因素的增加而降低。 這與上述Box-Behnken 模型分析具有一致性。

圖5 各因素間的交互關(guān)系Fig.5 The interaction between the factors

2.2.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，分析模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)發(fā)酵條件： 溫度34.06 ℃、時(shí)間22.73 h、接種量3.03%，預(yù)測(cè)的響應(yīng)值為活菌數(shù)9.01 lg（CFU/mL），感官評(píng)分86.14分。為了更好控制生產(chǎn)條件，取整后得到：溫度34℃、時(shí)間23 h、接種量3%。 驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)結(jié)果，測(cè)得飲品中實(shí)際活菌數(shù)為（8.91±0.11）lg（CFU/mL），感官評(píng)為84.8 分。 模型的驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)性好，表明優(yōu)化后的工藝參數(shù)對(duì)益生菌臍橙全果汁生產(chǎn)具有參考意義。

2.3 最佳發(fā)酵條件下臍橙全果汁的風(fēng)味測(cè)定

益生菌臍橙全果汁中的揮發(fā)性成分變化主要是乳酸菌利用原料進(jìn)行代謝，使原有香味物質(zhì)增加或減少，并產(chǎn)生新的香味物質(zhì)，如苯乙醇、香葉醇、3-羥基己酸乙酯等。采用GC-MS 技術(shù)，對(duì)發(fā)酵前、后的飲品進(jìn)行風(fēng)味分析，共鑒定出48 種香氣物質(zhì)。 由表6 可知，臍橙全果汁發(fā)酵后，醇類化合物的相對(duì)含量大量增加，部分物質(zhì)是未發(fā)酵組的2 倍及以上，特別是α-松油醇相對(duì)含量提高至1.590%。 經(jīng)益生菌作用后，酯類化合物種類減少，而總相對(duì)含量上升至2.050%，主要為3-羥基己酸乙酯；同時(shí)檢測(cè)到新的醛類、酚類化合物，3，4-二甲基苯甲醛（0.232%）、5-羥甲基糠醛（0.240%）、4-乙基苯酚（0.071%）等均只在發(fā)酵果汁中出現(xiàn)。烯烴能被氧化為醇、醛酮等物質(zhì)，與未發(fā)酵果汁相比，發(fā)酵果汁中酮類揮發(fā)性物質(zhì)總相對(duì)含量增加了0.629%，而烯類化合物的總相對(duì)含量大幅降低了15.811%。 巴西倫亞橘烯相對(duì)含量降至15.980%，而（d）-檸檬烯相對(duì)含量大幅增至23.346%，且出現(xiàn)新的α-愈創(chuàng)木烯（0.455%）、α-律草烯（0.079%）。原汁相對(duì)含量最高的雙戊烯，呈現(xiàn)松節(jié)油香，在發(fā)酵汁中并未被檢測(cè)到。

表6 發(fā)酵前、后臍橙全果汁香氣物質(zhì)Table 6 Aroma of navel orange before and after fermentation

OAV 值不僅與嗅覺閾值有關(guān)，還受物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響。 由表7 可知，醇類物質(zhì)發(fā)酵后OAV值普遍增加，而呈現(xiàn)鈴蘭香、木香的芳樟醇含量下降，這是由于在發(fā)酵過程中，芳樟醇主要降解為α-松油醇，并有部分降解為香葉醇、橙花醇，使發(fā)酵后的飲品花香更濃郁；酯類物質(zhì)閾值較低，發(fā)酵后3-羥基己酸乙酯含量上升，對(duì)臍橙全果汁風(fēng)味影響較為明顯，呈現(xiàn)水果香、菠蘿香。其次，臍橙全果汁中的醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，在發(fā)酵過程中將其還原為醇或氧化為酸，導(dǎo)致發(fā)酵后臍橙全果汁醛類物質(zhì)種類減少。 左旋香芹酮是（d）-檸檬烯氧化產(chǎn)生的異位酮，而臍橙全果汁發(fā)酵后的（d）-檸檬烯含量大于未發(fā)酵的，因此賦予發(fā)酵果汁更多留蘭香風(fēng)味。臍橙中含有大量的烯類化合，如（d）-檸檬烯、月桂烯、（+）-α-蒎烯等。 （d）-檸檬烯廣泛存在于臍橙果渣中，且發(fā)酵后全果汁的（d）-檸檬烯相對(duì)含量激增，呈現(xiàn)鮮橙子香、檸檬香。 發(fā)酵后月桂烯稍雖有減少，但仍是發(fā)酵果汁中的主要風(fēng)味特征，賦予果汁草香及橙花油的風(fēng)味，而（+）-α-蒎烯對(duì)發(fā)酵后橙汁的香氣有積極貢獻(xiàn)，呈現(xiàn)一定的松木、樹脂的風(fēng)味。這些來自臍橙汁本身的揮發(fā)性成分經(jīng)乳酸菌的代謝，使呈香物質(zhì)發(fā)生改變，賦予益生菌臍橙全果汁典型的風(fēng)味。

表7 益生菌臍橙全果汁風(fēng)味物質(zhì)OAV 分析Table 7 OAV analysis of probiotic navel orange whole juice flavor compounds

（續(xù)表6）

（續(xù)表6）

3 結(jié)論

利用復(fù)合乳酸菌，建立崀山臍橙全果汁飲品的最優(yōu)發(fā)酵工藝。 根據(jù)Box-behnken 試驗(yàn)結(jié)果，獲得最優(yōu)工藝條件為溫度34 ℃，時(shí)間23 h，接種量3%，此時(shí)飲品中活菌數(shù)（8.91±0.11）lg（CFU/mL），感官評(píng)分84.8 分，生產(chǎn)的益生菌臍橙全果汁風(fēng)味優(yōu)良，濃郁飽滿，回味悠長(zhǎng)。

益生菌臍橙全果汁的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要來自本身的香氣成分以及利用乳酸菌代謝，各類香氣成分相互協(xié)調(diào)，形成飲品的最佳風(fēng)味。 采用HSPME-GC-MS 檢測(cè)發(fā)酵前、后的風(fēng)味物質(zhì)，共檢出48 種風(fēng)味成分。發(fā)酵果汁中（d）-檸檬烯為主香氣成分，占23.346%，呈現(xiàn)鮮橙子香、檸檬香；其次，乳酸菌利用基質(zhì)中的各類成分，在發(fā)酵時(shí)不斷發(fā)生酯化反應(yīng)、醇化反應(yīng)等，使發(fā)酵后香氣種類成分更復(fù)雜，含量更豐富，如苯乙醇、香葉醇、3-羥基己酸乙酯等。結(jié)合感官評(píng)價(jià)可知，發(fā)酵后的臍橙全果汁口感更柔順，花果香更濃郁，并伴隨有發(fā)酵產(chǎn)品的典型風(fēng)味。