優(yōu)良本土釀酒酵母的釀造特性研究

劉沛通，丁子元，于慶泉，范佳碩，喬 巖，王海綺，鄭曉衛(wèi)*

（1 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司 北京 102209 2 中糧長城桑干酒莊（懷來）有限公司 河北張家口 075499）

酵母菌是葡萄酒發(fā)酵中的核心微生物，代謝葡萄中的糖生成酒精，同時產(chǎn)生多種風味物質(zhì)，影響葡萄酒的香氣和口感[1]。 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是參與葡萄酒酒精發(fā)酵的核心酵母菌[2]，在發(fā)酵過程中可以代謝合成醇類、酸類、酯類、醛類、萜烯類等多種風味物質(zhì)，構成了葡萄酒的主要香氣風格，為葡萄酒帶來獨特而又復雜的風味[3]。醇類物質(zhì)主要包括己醇、苯乙醇、異戊醇等高級醇，含量適中（<400 mg/L）的高級醇可增加葡萄酒香氣的復雜性[4]。乙酸酯類和乙酯類物質(zhì)是葡萄酒中主要的酯類化合物，前者包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等，后者包括己酸乙酯、辛酸乙酯等，為葡萄酒帶來果香、花香等愉快的風味[5]。 揮發(fā)性脂肪酸以己酸、辛酸、癸酸等為主，可保持葡萄酒的平衡感，增加葡萄酒的香氣復雜度[4]。

近年來，“風土” 成為表征葡萄酒產(chǎn)區(qū)特征的關鍵詞。作為葡萄酒釀造中的關鍵微生物之一，產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母直接影響葡萄酒的風土特征[6-7]。釀酒酵母在全世界不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)具有顯著的地理分化現(xiàn)象[8-12]，不同產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母種群間表現(xiàn)出較高的遺傳差異[13]。 如：B?rlin 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在同一產(chǎn)區(qū)的不同地塊，釀酒酵母種群間也存在顯著的遺傳差異。 Schuller 等[14]甚至在同一地塊的不同取樣點之間發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母的遺傳差異性。 產(chǎn)區(qū)本土釀酒酵母會顯著影響葡萄酒的香氣風格和口感特性，不同遺傳性狀的本土酵母可以突出葡萄酒的產(chǎn)區(qū)風格，形成葡萄酒的風土特征[15]。

當前，我國葡萄酒工廠普遍使用進口商業(yè)活性干酵母進行釀造生產(chǎn)。 商業(yè)活性干酵母可以加強發(fā)酵過程控制，降低腐敗風險，應對葡萄酒香氣不可預測的變化。 然而，研究表明，長期連續(xù)使用商業(yè)酵母，顯著降低了葡萄酒的香氣復雜性和本土菌株的多樣性，極大削弱了葡萄酒的風土特征[16-17]。 本土酵母具有獨特的區(qū)域特性[18]。 我國本土酵母資源豐富、種類繁多，是我國種業(yè)資源的重要部分，篩選和應用本土酵母有利于不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒風格的表達，發(fā)揮我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)的風土特征。本研究通過小試發(fā)酵、中試釀造評價本土酵母的發(fā)酵特性和產(chǎn)香特性，旨在獲得性能優(yōu)良的本土酵母，為提升本土葡萄酒的香氣豐富度和復雜度，提高葡萄酒品質(zhì)提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：“雷司令”葡萄（2020年采收于河北沙城，還原糖221.1 g/L），“西拉”葡萄果實（2020年采收于河北沙城，還原糖238.0 g/L）。

試驗菌株：11 株本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）篩選自3 個不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)酵過程中，保藏于中糧營養(yǎng)健康研究院酒業(yè)技術中心（表1）。

表1 本土釀酒酵母分離來源Table 1 Sources of Saccharomyces cerevisiae strains tested

商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）VL2、商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）RX60，法國Laffort 公司；商業(yè)釀酒酵母（S.cerevisiae）EC1118，法國Lallemand公司。

YPD 培養(yǎng)基（1 L）：酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，pH 6.0，115 ℃高壓滅菌20 min。

葡萄汁模擬培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖100 g，果糖100 g，檸檬酸0.3 g，L-蘋果酸0.3 g，酒石酸3 g，一水合硫酸錳4 mg，COCl2·6H2O 0.4 mg，一水合硫酸鋅4 mg，（NH4）6MO7O24·4H2O 1 mg，五水合硫酸銅1 mg，硫酸銨0.3 g，天冬酰胺0.6 g，磷酸二氫鉀2 g，碘化鉀1 mg，硼酸1 mg，肌醇0.3 g，對氨基苯甲酸1 mg，生物素0.04 mg，維生素B11 mg，維生素B61 mg，泛酸1 mg，煙酸1 mg，pH 值調(diào)至5.8，過濾除菌。

1.2 儀器與設備

安捷倫1260 系列高效液相色譜儀、可變波長紫外檢測器 （G7114A）、 示差折光檢測器（G7162A）、8890-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；T6 新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器公司； 離子交換色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），美國Bio-Rad Laboratories 公司；HP-INNOWAX （60 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管柱，美國J&W Scientific 公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，美國Supelco 公司；PAL-RSI85-SPME 自動進樣器，瑞士CTC Analytics 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化 取保藏菌株在YPD 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)獲得單菌落，挑取單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期。以1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期。

1.3.2 小試發(fā)酵試驗 低溫（4 ℃）離心（8 000 r/min，10 min） 收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌后以106CFU/mL 接種于300 mL 葡萄汁模擬培養(yǎng)基中，使用發(fā)酵栓液封，靜置培養(yǎng)10 d 左右（25 ℃），至最終還原糖含量小于4 g/L 即為發(fā)酵終點。在發(fā)酵過程中，測定菌體密度（OD600nm）及發(fā)酵液還原糖含量以監(jiān)測發(fā)酵進程[19]。 發(fā)酵結(jié)束后離心取上清葡萄酒，分別檢測理化指標（3 mL 葡萄酒）及揮發(fā)性物質(zhì)含量（15 mL 葡萄酒）。 每個處理設置3 個生物學重復。

1.3.3 中試釀造試驗 分別使用“雷司令”葡萄和“西拉” 葡萄在長城桑干酒莊中試平臺進行100 L中試釀造試驗。葡萄果實經(jīng)過穗選、粒選后，“雷司令”葡萄輕度破碎，入氣囊壓榨機，取自流汁入發(fā)酵容器，澄清后分離清汁轉(zhuǎn)至100 L 發(fā)酵罐；“西拉”葡萄除梗、破碎后，加入100 L 發(fā)酵罐進行5 d冷浸漬（10 ℃），自然回溫至20 ℃左右，帶皮發(fā)酵。

取保藏菌株和商業(yè)酵母在YPD 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)獲得單菌落，挑取單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下180 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期。以1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下180 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)中期，以106CFU/mL 活菌數(shù)接種于5 L 葡萄汁中，靜置培養(yǎng)24 h，溫度回升至22 ℃后，得到活化的本土酵母和商業(yè)酵母種子液。 之后將其加入100 L 發(fā)酵罐中啟動發(fā)酵，“雷司令” 發(fā)酵溫度14 ℃左右，“西拉”發(fā)酵溫度26～28 ℃。 發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度和比重，發(fā)酵結(jié)束（還原糖質(zhì)量濃度<4 g/L）后，取20 mL 葡萄酒檢測理化指標（3 mL 葡萄酒）及揮發(fā)性物質(zhì)含量（15 mL 葡萄酒）。 每個處理設置3 個生物學重復。

1.3.4 葡萄酒理化指標分析 葡萄酒總酸、 揮發(fā)酸測定參考國標方法（GB/T 15038-2006）[19]。

使用0.22 μm 濾膜過濾發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒，使用高效液相色譜1200 測定葡萄糖、果糖、甘油、乙醇及有機酸（乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸）含 量[20]。 進樣量2 μL，流動相為5 mmol/L 的H2SO4溶液，離子交換色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），等度洗脫，流速0.6 mL/min。

乙醇、果糖、葡萄糖、甘油使用示差折光檢測器測定，柱溫45 ℃，分析時間30 min；有機酸使用可變波長紫外檢測器測定，柱溫60 ℃，分析時間30 min。 每個樣品設置2 個獨立重復。

1.3.5 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)分析 參考Lan 等[21]的方法檢測葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)。 使用50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭萃取。 15 mL 樣品瓶中加入1 g 氯化鈉和10 μL內(nèi)標（4-甲基-2-戊醇），將5 mL 待測葡萄酒迅速加入樣品瓶后擰緊密封。 180 r/min 平衡30 min（40 ℃），將已活化過的萃取頭（270 ℃老化1 h）插入樣品瓶的頂空部分，攪拌萃取30 min（40 ℃）后，將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜進樣口，熱解吸8 min（250 ℃），不分流進樣。

用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)。 具體條件為：使用HP-INNOWAX 毛細管柱，高純氦氣作為載氣，流速1 mL/min。 柱溫箱按照以下升溫程序運行：5 min（40 ℃）后以3 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持2 min。 質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質(zhì)量掃描范圍20～450 u。 每個樣品設置2 個獨立重復。

對于已有標準品的物質(zhì)，依據(jù)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時間、 保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進行定性分析。 使用化合物在模擬酒溶液中的標準曲線進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2013 作圖。 使用SPSS 25.0 進行單因素方法分析（ANOVA），采用Duncan檢驗兩兩比較 （P ＜0.05）。 使 用https：//www.metaboanalyst.ca/進行PLSDA 分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 本土酵母的小試發(fā)酵試驗

分析11 株本土酵母的小試發(fā)酵表現(xiàn)，檢測其發(fā)酵葡萄酒的理化指標及揮發(fā)性物質(zhì)，篩選發(fā)酵性能和產(chǎn)香性能良好的本土酵母。

2.1.1 酵母的生長及發(fā)酵特性 11 株本土酵母發(fā)酵結(jié)束時葡萄酒中殘?zhí)呛烤∮? g/L，符合干型葡萄酒的標準[19]（表2）。 8 株本土酵母的最大生物量顯著高于商業(yè)酵母。60250、60276 和60282的最大生物量顯著低于商業(yè)酵母，且達到最大生物量的時間早于商業(yè)酵母。 11 株本土酵母中，60177、60258 的最大生長速率最高，其中60258的最大發(fā)酵速率也最高，具有較強的生長發(fā)酵活力。

表2 酒精發(fā)酵中不同酵母菌株生長及發(fā)酵動力學參數(shù)Table 2 Growth and fermentation kinetic parameters of different yeasts during alcoholic fermentation

2.1.2 葡萄酒的理化指標 箱式圖展示了不同酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中乙醇、甘油和主要有機酸（乙酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸）的含量分布（圖1）。11 株本土酵母和1 株商業(yè)酵母的乙醇產(chǎn)量相似，從9.18～9.52 g/L 不等。 所有酵母的甘油產(chǎn)量均處于正常范圍（5～14 g/L）[4]。 乙酸是葡萄酒中主要的揮發(fā)酸，各酵母的乙酸產(chǎn)量在0.2～0.7 g/L，對葡萄酒香氣有積極貢獻[23]。 檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸是葡萄酒中重要的非揮發(fā)性酸。 檸檬酸在葡萄酒中的含量一般為0.1～0.7 g/L[4]，12 種葡萄酒的檸檬酸含量處于正常范圍。 蘋果酸的含量通常為2～6.5 g/L[24]，60124的蘋果酸含量過高（7.75 g/L），其 余10 株本土酵母的蘋果酸產(chǎn)量均在正常范圍內(nèi)。 琥珀酸在葡萄酒中的含量通常為0.5～1.5 g/L[25]，所有葡萄酒的琥珀酸含量均正常。

圖1 不同酵母菌株發(fā)酵葡萄酒的乙醇、甘油和主要有機酸含量箱式圖Fig.1 Boxplots of the concentration of ethanol，glycerol and main organic acids in wines fermented with different yeast strains

2.1.3 揮發(fā)性物質(zhì)含量 測定酒精發(fā)酵結(jié)束時葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，共檢測到20 種香氣物質(zhì)，包括6 種高級醇，9 種酯類，3 種揮發(fā)性脂肪酸和1 種萜烯類物質(zhì)。 基于揮發(fā)性物質(zhì)的聚類分析，根據(jù)酵母的香氣風格可以分為2 個大類（圖2）。

Cluster1 類物質(zhì)主要由乙酯類物質(zhì) （乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）、乙酸酯類物質(zhì)（乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯）、其它酯類物質(zhì)（癸酸異戊酯、辛酸異戊酯）、高級醇（異丁醇、異戊醇）和萜烯類物質(zhì)（香茅醇）組成。 60258 和60268 的Cluster1 類物質(zhì)含量顯著高于其余本土酵母和商業(yè)酵母。

Cluster2 類物質(zhì)主要包括高級醇（丁醇、辛醇、癸醇）和揮發(fā)性脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸、異戊酸）。 與商業(yè)酵母和其它本土酵母相比，60124 和60250 的Cluster2 類物質(zhì)含量較高。

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，將主要的呈香物質(zhì)整理為6 個香氣類型，即果香、花香、脂肪味、化學味、生青味和焦糖味[26]。 將氣味相似的呈香物質(zhì)香氣值累加到一起后，得到不同酵母發(fā)酵葡萄酒的特征香氣雷達圖（圖3）。

圖3 基于香氣活性值的葡萄酒香氣雷達圖Fig.3 Aromatic series of wines based on OAVs

本土酵母60258、60250、60268、60282、60244等10 株本土酵母的花香果香得分高于商業(yè)酵母，而60250 的脂肪味得分較高，會給葡萄酒帶來不愉悅的風味。 綜合評價，60268、60258 的花香果香得分高，且不良風味較少；揮發(fā)性物質(zhì)分析也表明其高產(chǎn)酯類物質(zhì)（圖2），具有發(fā)酵優(yōu)良葡萄酒的潛力，可進行下一步的中試釀造試驗。

圖2 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)熱圖Fig.2 The heatmap of volatile compounds in wines

2.2 優(yōu)選本土酵母的中試釀造試驗

研究60258 和60268 在白葡萄品種“雷司令”和紅葡萄品種“西拉”中的發(fā)酵和產(chǎn)香特性。

2.2.1 酵母的生長及發(fā)酵特性 分別監(jiān)測 “雷司令”和“西拉”發(fā)酵中的比重，可以看出，本土酵母60258、60268 均可正常完成發(fā)酵（圖4）。 在“雷司令”發(fā)酵中，60258、60268 與商業(yè)酵母的發(fā)酵趨勢基本一致；在“西拉”發(fā)酵中，發(fā)酵初期60268 的發(fā)酵速率顯著高于60258 和商業(yè)酵母，隨著發(fā)酵時間的延長，3 株酵母的發(fā)酵速率趨于一致。

圖4 “雷司令”（a）和“西拉”（b）發(fā)酵過程中的比重變化Fig.4 Specific gravity of Riesling （a） and Syrah （b） during fermentation

2.2.2 葡萄酒的理化指標 發(fā)酵結(jié)束后，本土釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒中還原糖含量均低于4 g/L，完成發(fā)酵（表3）。 總酸、揮發(fā)酸等理化指標處于正常范圍內(nèi)[19]。 在“雷司令”葡萄酒中，60258 的酒精產(chǎn)量顯著低于其余酵母，然而在“西拉”葡萄酒中并未存在該現(xiàn)象。與商業(yè)酵母相比，本土釀酒酵母60268 發(fā)酵的“雷司令”和“西拉”葡萄酒的甘油產(chǎn)量較高，存在顯著性差異。 60258 和60268 的蘋果酸產(chǎn)量顯著高于商業(yè)酵母，60268 的檸檬酸產(chǎn)量顯著高于60258 和商業(yè)酵母，在2 個品種的葡萄酒中的表現(xiàn)一致。

表3 葡萄酒理化指標Table 3 Physicochemical parameters of wine

2.2.3 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)分析 發(fā)酵結(jié)束后，從葡萄酒中共檢測到17 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括4 種高級醇、10 種酯類和3 種酸類物質(zhì)（表4）。

己醇和苯乙醇在“西拉”和“雷司令”葡萄酒中的含量超出了閾值（表4）。 在“雷司令”葡萄酒中，60258 的己醇產(chǎn)量顯著高于其它2 株酵母，苯乙醇產(chǎn)量也顯著高于60268。 在“西拉”葡萄酒中，60258 的己醇和苯乙醇產(chǎn)量分別是商業(yè)酵母的2.2 倍和1.6 倍。 60258 和60268 在“西拉”葡萄酒中高產(chǎn)異戊醇，且含量超出閾值，顯著高于商業(yè)酵母。 其中60258 的異戊醇含量是商業(yè)酵母的1.97倍。

“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯含量均高出閾值 （表4）。60258 在“雷司令”葡萄酒中的乙酸己酯含量超出閾值，是商業(yè)酵母的3.92 倍。 60258 高產(chǎn)乙酸酯，其在“雷司令”、“西拉”葡萄酒中的乙酸酯產(chǎn)量均顯著高于商業(yè)酵母。

“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的己酸乙酯和辛酸乙酯均高于閾值（表4）。60258 在雷司令中辛酸乙酯的產(chǎn)量是商業(yè)酵母的1.8 倍，在“西拉”葡萄酒中是商業(yè)酵母的1.7 倍。

己酸、辛酸和癸酸是在“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的濃度均高于閾值（表4）。 在“雷司令”葡萄酒中，商業(yè)酵母的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量最高，在“西拉” 葡萄酒中，60258 產(chǎn)生更多的揮發(fā)性脂肪酸。

表4 酒精發(fā)酵結(jié)束后“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 4 The mass concentrations of volatile compounds in Riesling and Syrah wines after alcoholic fermentation

為了進一步分析不同酵母對葡萄酒風格的影響，分別基于“雷司令”和“西拉”葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進行偏最小二乘分析（圖5、圖6）。 由圖可知，不同酵母發(fā)酵葡萄酒的風格有顯著區(qū)分。 在“雷司令”葡萄酒中，揮發(fā)性脂肪酸（辛酸、癸酸）和酯類物質(zhì)（乙酸酯）是不同酵母間差異的主要揮發(fā)性物質(zhì)。 在“西拉”葡萄酒中，高級醇（辛醇、己醇、異戊醇）和酯類物質(zhì)（辛酸乙酯）是造成酵母間差異的主要物質(zhì)。 整體而言，在“雷司令”葡萄酒中，本土酵母60258、60268 可產(chǎn)生較高濃度的總酯、乙酸酯等；在“西拉”葡萄酒中，本土酵母60258、60268 可產(chǎn)生較高濃度的酯類物質(zhì)（辛酸乙酯、乙酸異戊酯等）。

圖5 基于“雷司令”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的偏最小二乘判別分析Fig.5 Partial least squares - discriminant analysis （PLS-DA） based on the volatile compounds in the Riesling wine

圖6 基于“西拉”葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的偏最小二乘判別分析Fig.6 Partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA） based on the volatile compounds in the Syrah wine

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，將主要的呈香物質(zhì)整理為6 個香氣類型，將氣味相似的呈香物質(zhì)香氣值累加到一起后，得到不同酵母發(fā)酵葡萄酒的特征香氣雷達圖（圖7）。 在“雷司令”葡萄酒中（圖7a），本土酵母60258 果香和花香較強，脂肪味較弱。 而本土酵母60268 的果香和花香均弱于商業(yè)酵母。 在“西拉”葡萄酒中（圖7b），本土酵母60258、60268 果香和花香較強，優(yōu)于商業(yè)酵母。

圖7 基于香氣活性值的“雷司令”（a）和“西拉”（b）葡萄酒香氣雷達圖Fig.7 Aromatic series of Riesling （a） and Syrah （b） wine based on OAVs

3 討論

葡萄酒產(chǎn)區(qū)不同的微氣候塑造了不同特點的本土酵母，表現(xiàn)出各異的區(qū)域特征，從而影響葡萄酒最終的香氣特性和口感特性。本研究中，采用小試發(fā)酵試驗評估了11 株本土酵母的發(fā)酵特性和產(chǎn)香特性。 11 株本土酵母中均可完成干型葡萄酒的發(fā)酵（殘?zhí)呛?4 g/L）[19]，其中60258 生長活力和發(fā)酵活力較強（表2）。 11 株本土酵母的乙醇產(chǎn)量與商業(yè)酵母相似，甘油、有機酸（乙酸、檸檬酸和琥珀酸）產(chǎn)量均處于葡萄酒的正常范圍內(nèi)（圖1）。通過揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析將11 株本土酵母分為兩大類，其中60258 和60268 高產(chǎn)酯類物質(zhì)，60124 和60250 高產(chǎn)高級醇和揮發(fā)性脂肪酸 （圖2）。結(jié)合基于葡萄酒香氣雷達圖，最終篩選出2 株果香、花香得分最高，且脂肪味和化學味得分較低的本土酵母（60258 和60268）進行中試釀造試驗。60258 和60268 在“雷司令”和“西拉”中的發(fā)酵趨勢一致（圖4），均可完成干型葡萄酒的發(fā)酵。 甘油主要在酒精發(fā)酵初期產(chǎn)生，是酵母正常發(fā)酵副產(chǎn)物之一，具有甜味和黏稠度，可提高葡萄酒圓潤飽滿的口感[33]。 葡萄酒中的甘油通常為4～15 g/L[4]。60268 在“雷司令”和“西拉”中的甘油產(chǎn)量分別是商業(yè)酵母的1.2 倍和1.1 倍，在一定程度上可以改善葡萄酒的口感（表3）。 檸檬酸和蘋果酸是葡萄酒中重要的非揮發(fā)性酸。 檸檬酸由酵母在發(fā)酵初期產(chǎn)生，在葡萄酒中的含量為0.1～0.7 g/L[4]。2 株本土酵母的檸檬酸產(chǎn)量均在正常范圍，顯著低于商業(yè)酵母。蘋果酸具有生青味和尖苛感，可通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵被乳酸菌降解為更為柔和的乳酸[24]。 酒精發(fā)酵結(jié)束后，60258 和60268 的蘋果酸含量顯著高于商業(yè)酵母（表3），可為蘋果酸-乳酸發(fā)酵提供更多的底物。

高級醇主要由釀酒酵母通過Ehrlich 途徑代謝氨基酸生成[34]，是葡萄酒中重要的發(fā)酵香氣物質(zhì)。 當高級醇濃度適宜時可增加葡萄酒香氣的復雜性，然而當質(zhì)量濃度高于400 mg/L 時，會給葡萄酒帶來不愉快的醇味和溶劑味[4]。中試釀造結(jié)果表明，60258 高產(chǎn)己醇和苯乙醇（表4）。 己醇為葡萄酒貢獻植物味，苯乙醇可給葡萄酒帶來玫瑰花香和蜂蜜味[35]。 這也導致了西拉葡萄酒中60258的高級醇總量顯著高于商業(yè)酵母，而并未超過400 mg/L，不會給葡萄酒帶來不良風味[4]。60268 在雷司令葡萄酒中的高級醇產(chǎn)量較低，然而在西拉葡萄酒中其產(chǎn)量顯著高于商業(yè)酵母，可以增加葡萄酒的香氣復雜性（表4）。

酯類物質(zhì)主要包括乙酸酯和乙酯[5]。乙酸酯由高級醇和乙酰輔酶A 在醇?；D(zhuǎn)移酶的催化下縮合而成，主要包括乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯、2-乙酸苯乙酯等[4]，可為葡萄酒帶來果香、花香[35-37]。 60258 在“雷司令”中的乙酸己酯含量是商業(yè)酵母的3.92 倍，該物質(zhì)可為葡萄酒貢獻蘋果、櫻桃等果香[35]。60258 在“雷司令”和“西拉”中的乙酸酯總量分別是商業(yè)酵母的3 倍、1.6 倍。 60268的乙酸酯總量與商業(yè)酵母無顯著性差異。 乙酯由脂酰CoA 和乙醇在?；D(zhuǎn)移酶的作用下縮合而成，常見乙酯包括丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯[4-5]。 60258 在“雷司令”和“西拉”中均高產(chǎn)辛酸乙酯，提升葡萄酒的花香、果香[36]，這也導致其乙酯產(chǎn)量顯著高于其余2 株酵母，是商業(yè)酵母乙酯總量的近2 倍。 與60258 不同，60268 的乙酯產(chǎn)量較低（表4）。 60258 高產(chǎn)酯類物質(zhì)，也使其與60268 和商業(yè)酵母的風格顯著區(qū)分開（圖5、圖6）。 結(jié)合葡萄酒香氣雷達圖（圖7） 可看出，60258 的果香和花香得分高于商業(yè)酵母和60268，與小試結(jié)果一致（圖3）。 60258 可較穩(wěn)定地高產(chǎn)酯類物質(zhì)。

揮發(fā)性脂肪酸為葡萄酒帶來奶酪味、 脂肪味等香氣特征[4]。 在2 種葡萄酒中，60258 產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸總量均顯著高于商業(yè)酵母，而60268僅在“西拉”葡萄酒中高產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸（表4），可在一定程度上提升葡萄酒的香氣復雜性和平衡性。

整體來看，60258 可穩(wěn)定產(chǎn)生豐富的酯類、高級醇類及其它揮發(fā)性物質(zhì)，賦予葡萄酒愉悅的果香和花香。 60268 高產(chǎn)甘油，在紅葡萄酒品種“西拉”中的香氣表現(xiàn)優(yōu)于白葡萄品種“雷司令”（圖7）。

4 結(jié)論

開發(fā)中國本土酵母資源，篩選應用優(yōu)良本土酵母，對充分發(fā)揮葡萄酒的風土特征，改變國外商業(yè)酵母壟斷的局面具有重要意義。 本研究通過小試發(fā)酵從11 株本土酵母中篩選出2 株發(fā)酵和產(chǎn)香性能良好的本土酵母60258 和60268，應用2個品種的葡萄（白葡萄品種“雷司令”和紅葡萄品種“西拉”）進行中試釀造。 結(jié)果表明：60258 可以穩(wěn)定地高產(chǎn)酯類物質(zhì)，提升葡萄酒的花香和果香風味特征；60268 可以高產(chǎn)甘油，更適合提升紅葡萄酒的香氣品質(zhì)。 2 株酵母在實際生產(chǎn)中具有較大的應用前景。