山藥提取物對烤馬友魚中雜環(huán)胺的抑制作用

李 夢，林松毅，2，3，王睿純，王新艷，張思敏，2，3*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034 2 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034）

馬友魚，又稱四指馬鲅 （Eleutheronema tetradactylum），多分布在湛江徐聞地區(qū)。因具有較廣的鹽度適應(yīng)范圍與較快的生長速度，而使其具有較好的經(jīng)濟開發(fā)價值，又因其肉質(zhì)鮮美而深受消費者喜愛[1]。馬友魚在魚類中屬于脂肪含量較高的一種，口感極其肥美，入口綿密、細膩，十分受食客們的歡迎。 然而，馬友魚鰓絲面積小且疏離，氧氣交換能力較差，一旦被捕撈上岸便立即死亡，且難以運輸，導(dǎo)致人們幾乎吃不到鮮活的馬友魚，若將其制成烤魚，既能品嘗到馬友魚鮮美的味道，又可以讓其更易保存和運輸[2]，然而，高蛋白、高脂肪魚類在烤制過程中易產(chǎn)生一類多環(huán)芳香族化合物——雜環(huán)胺。

雜環(huán)胺是魚、 肉制品經(jīng)高溫烹飪產(chǎn)生的一類具有致突變性、 致癌性及心肌毒性的芳香族雜環(huán)化合物。影響雜環(huán)胺形成的主要因素有溫度、時間及加工方式等。 目前，從物質(zhì)中分離的雜環(huán)胺有30 余種。 依據(jù)生成條件將雜環(huán)胺分為兩類[3-4]，分別為氨基-咪唑-氮和氨基咔啉。其中，加熱溫度在100～250 ℃范圍內(nèi)形成的雜環(huán)胺稱為氨基-咪唑-氮雜芳烴類，其主體均是具有1 個主體N-甲基-氨基咪唑，氨基-咪唑-氮類又可細分為喹啉類：Trp-P-1，Aac，Trp-P-2，MeAac；喹啉類：IQ，MeIQ；喹喔啉類：IQx，MeIQx，4，8 -DiMelQx，7，8 -DiMelQx；吡啶類：PhlP；呋喃吡啶類：IFP。 而氨基咔啉類雜環(huán)胺是氨基酸經(jīng)過300 ℃高溫?zé)峤到夂笮纬傻姆菢O性雜環(huán)胺，其按結(jié)構(gòu)細分為α-咔啉類（AαC，MeAαC），β-咔啉類（Harman，Norharman）、γ-咔啉類（Trp-P-1 等）、δ-咔啉類。 一般來說，魚肉制品中蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類以及它們加熱后生成的葡萄糖、肌酸、肌酸酐等都是雜環(huán)胺形成的前體物質(zhì)，再進一步通過自由基途徑及美拉德反應(yīng)等途徑形成[5]。

控制雜環(huán)胺在食物中的生成，是科研人員研究的一大課題，其中添加外源抗氧化物質(zhì)是一種有效的降低雜環(huán)胺的手段。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過添加植物（如越桔葉[6]、玫瑰茶[7]、綠茶[8]、馬齒莧[9]、洋薊[10]、鼠尾草[11]、山楂[12]、香辛料[13]等）提取物，使用腌制液（如冰糖、醬油、米酒[14]、啤酒、白酒[15]、紅酒[16]）腌制等方式可降低烤制肉餅中雜環(huán)胺的生成。 山藥具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，抗糖尿病，抗突變[17]等生物活性，且山藥的抗氧化作用十分優(yōu)異。 尚曉婭等[18]制備白色山藥精制多糖粉末（CYP），以其對羥自由基清除率為指標(biāo)，結(jié)果表明：當(dāng)CYP 質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時，對羥自由基的清除率高達97%，可有效抑制小鼠肝勻漿的自氧化。 本試驗選用山藥提取物來研究其對烤馬友魚雜環(huán)胺的抑制效果。 以雜環(huán)胺前體物（肌酸、肌酐、葡萄糖、游離氨基酸）、脂質(zhì)氧化和蛋白氧化為指標(biāo)，研究添加山藥提取物對烤馬友魚中雜環(huán)胺的抑制機理。通過揮發(fā)性風(fēng)味變化，評估添加山藥提取物對烤馬友魚風(fēng)味的影響。 本研究旨在為烤馬友魚的合理加工提供理論參考，為其它魚肉制品加工中雜環(huán)胺形成和抑制提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬友魚購于大連長興市場，-20 ℃冷凍待用；山藥提取物由河南宣新生物科技有限公司提供。

雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢：2-氨基-3 甲基咪唑并[4，5-f]喹啉（IQ）、2-氨基-3 甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉（IQx）、2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉（MeIQ）、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉（8-MeIQx）、2-胺基-3，4，8-三甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹喔啉（4，8-DiMeIQx）、2-胺基-3，7，8-三甲基-3H-咪唑并 [4，5-f] 喹喔啉 （7，8-DiMeIQx）、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（Trp-P-2）、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（AaC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚 （MeAaC）、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-b] 吡啶 （PhIP）、9H-吡啶并[3，4-b] 吲哚（Norharman）、1-甲基-9H 吡啶并 [3，4-b] 吲哚（Harman）； 蛋白質(zhì)羰基含量檢測試劑盒，Solarbio公司；肌酐試劑盒，南京建成生物工程研究所；肌酸、肌酐、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉；2-硫代巴比妥酸，上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸、無水乙醚、氫氧化鈉等試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜質(zhì)譜儀，Agilent 公司；高速冷凍離心機，Thermo 公司；LA8080 高速氨基酸分析儀，HITACHI；FlavourSpecR風(fēng)味分析 儀，Gesellschaft für Analytische Sensorysteme mbH。

1.3 方法

1.3.1 馬友魚的制備 將馬友魚切成4 cm×5 cm×0.5 cm 的魚片，分成2 組，分別為對照組與添加山藥提取物組，每3 片為一組用作平行試驗。腌料比例：1 勺生抽（約6.8 g），2 勺朗姆（約14.6 g），6 勺橄欖油（約31.0 g），2 勺料酒（約15.4 g），0.2 g 味精，1.0 g 糖，1.5 g 鹽，用于腌制3 片魚片。 山藥提取物組中加入調(diào)料總量1%（0.5 g）的山藥提取物。在240 ℃條件下烤制10 min。

1.3.2 脂肪氧化的測定（TBARS） 稱取1 g 攪碎的魚肉，加入5 mL 的TBARS 溶液（0.375%的2-硫代巴比妥酸，15%的三氯乙酸，0.25 mol/L 鹽酸）沸水浴20 min，待溶液變?yōu)榉奂t色后流水冷卻。在4 ℃條件下8 000 r/min 離心15 min，取上清液在532 nm 波長下測吸光度。 按式（1）計算脂肪氧化量：

1.3.3 蛋白氧化的測定（蛋白質(zhì)羰基試劑盒） 蛋白氧化采用蛋白質(zhì)羰基試劑盒測定。 測定原理為羧基與2，4-二硝基苯腙，在370 nm 波長處有特征吸收峰。

1.3.4 pH 值的測定 根據(jù)GB 5009.237-2016 規(guī)定的方法對食品中pH 進行測定[19]。取切碎的魚肉樣品2 g 于50 mL 離心管中，加入20 mL 的0.1 mol/L 氯化鉀溶液后，均質(zhì)2 min，利用pH 計測定（應(yīng)確保待測試驗溫度在20±2 ℃）pH 值，待pH 計數(shù)字穩(wěn)定后，讀數(shù)。 平行3 次，準(zhǔn)確至0.01。

1.3.5 前體物測定

1.3.5.1 肌酸測定 稱取 （0.25±0.00）g 切碎的魚肉放入燒杯中，加入100 mL 的30 g/L 三氯乙酸后均質(zhì)5 min（8 000 r/min）取上清液，經(jīng)過濾紙過濾，用于除去蛋白質(zhì)沉淀。然后取20 mL 濾液置于50 mL 離心管中，之后加入10 mL 乙醚，對20 mL 的提取液進行脫脂處理，振蕩均勻后靜置10 min，以分離各相。取4 mL 的脫脂層即底層，加入2 mL 的丁二酮和2 mL 的1-萘酚。 再將這個混合物在40℃下超聲提取5 min，最后在520 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定各個樣品的吸光度。 之后用標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品的肌酸含量，單位為mg/g。

1.3.5.2 肌酐測定 將1 g 切碎的魚肉樣加入20 mL 的30 g/L 三氯乙酸，用均質(zhì)機以9 000 r/min 均質(zhì)5 min，取上清液用濾紙過濾，除去蛋白質(zhì)沉淀。取8 mL 濾液置于離心管中，加入4 mL 乙醚，振蕩搖勻，靜置10 min，取底層液體作為樣本。

使用肌酐試劑盒測定，在96 孔孔板中滴定，測定組加入6 μL 樣本后加入試劑1（酶溶液A）取180 μL，標(biāo)準(zhǔn)組加入6 μL 試劑3（標(biāo)準(zhǔn)品）再加入180 μL 試劑1（酶溶液A），空白組6 μL 雙蒸水加入180 μL 試劑1 （酶溶液A），之后37 ℃孵育5 min 后，在546 nm 波長處測定吸光度A1。 之后3種都加入60 μL 試劑2（酶溶液B），在37 ℃恒溫5 min，在546 nm 波長處測定吸光度A2。 按式（3）計算樣品肌酐含量：

式中，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為442 μmol/L。

1.3.5.3 還原糖測定 取5 g 剁碎的魚肉樣品，加入30 mL 的去離子水再加入5 mL 乙酸鋅溶液，最后加入5 mL 亞鐵氰化鉀溶液（沉淀蛋白質(zhì)），置于2 個50 mL 離心管中，之后渦旋混勻，在50 ℃水浴中加熱20 min，之后配平，以4 000 r/min 離心5 min。 取上清液，置于100 mL 容量瓶中。 將剩余沉淀加入20 mL 水，混勻后再以4 000 r/min 離心5 min，將此次上清液也倒入之前的100 mL 容量瓶中，定容至刻度線。 搖勻后倒入燒杯中，靜置一段時間后，取1 mL 中間層清液，加入1.5 mL DNS 溶液于玻璃試管中，沸水加熱5 min，之后取出流水沖涼后，加入7.5 mL 去離子水，搖勻。 之后在540 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算葡萄糖含量。

1.3.5.4 氨基酸測定 樣品前處理：取3 g 樣品加入到15 mL 0.02 mol/L 的鹽酸中，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，勻漿1 min。 在4 ℃，轉(zhuǎn)速10 000 r/min 條件下，離心10 min。 取2 mL 上清液加入8 mL 丙酮，搖勻后靜置，10 000 r/min 離心10 min。 取3 mL 上清液在60 ℃下進行旋蒸后，加入2 mL 的0.02 mol/L HCl，對樣品進行復(fù)溶，最后通過0.22 μm膜過濾，采用LA8080 高速氨基酸分析儀進行測定。

1.3.6 雜環(huán)胺測定 稱取2 g 左右的剁碎魚肉樣品，加入1 mL 去離子水，振蕩混勻靜置10 min，加入9 mL 乙腈溶液 （其中包含1%乙酸），振蕩10 min，加入萃取包（4 g 無水硫酸鎂和1 g 無水醋酸鈉），用手振蕩1 min。用離心機以6 000 r/min 離心10 min。 取上清液6 mL 加入離心管中（包含900 mg 無水硫酸鎂、300 mg PSA 和300 mg C18EC），振蕩1 min，用離心機以6 000 r/min 離心5 min。取1 mL 上清液用氮吹儀吹干，加入1 mL 甲醇溶液，渦旋復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜后上機測定。進樣量：5 μL，流動相A 為5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈，流速為0.3 mL/min。 流動相梯度見下表：

表1 雜環(huán)胺檢測過程流動相梯度Table 1 Mobile phase gradient of HAs detection

1.3.7 氣相色譜-離子遷移譜分析（GC-IMS） 將烤馬友魚捏碎，稱取1 g 置于20 mL 頂空瓶中，80℃孵化15 min 后進樣測試。 進樣針溫度為85 ℃，進樣體積200 μL，孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。 氣相色譜條件見表2。

表2 氣相色譜條件Table 2 GC-IMS conditions

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05 表示差異顯著。 采用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥提取物對烤馬友魚雜環(huán)胺生成的影響

由表3 所示，一共檢測了13 種雜環(huán)胺，對照組總共檢測出4 種雜環(huán)胺，為IQ、8-MeIQx、Norharman 與Harman，這4 種雜環(huán)胺含量分別為0.294，0.754，14.967 ng/g 和15.767 ng/g。 添加了山藥提取物后，雜環(huán)胺含量顯著降低，IQ 與8-MeIQx 含量降低到檢測線以下，Norharman 與Harman 分別降低59.08%和47.99%。 可能是由于山藥提取物的自由基清除能力，在反應(yīng)的不同途徑上，作為雜環(huán)胺的抑制劑，從未減少雜環(huán)胺的形成。

表3 山藥提取物對烤馬友魚雜環(huán)胺含量的影響（ng/g）Table 3 Effect of yam extracts on the content of HAs in roasted Eleutheronema tetradactylum （ng/g）

2.2 山藥提取物對烤馬友魚理化指標(biāo)的影響

烤制后失重反映其烹飪損失，是考察肉類質(zhì)量的重點參數(shù)。 肌纖維柱和肌漿蛋白、多磷酸鹽、鹽、 脂質(zhì)等可以隨著高溫條件下水含量的降低而減少[20]。 由表4 可知，添加了山藥提取物的烤馬友魚的質(zhì)量與對照組相比無明顯差異，證明添加山藥提取物對烤馬友魚烤制損失無影響。 對照組與生肉相比，pH 值明顯降低，而添加了山藥提取物組與對照組相比，pH 值顯著升高（P<0.05）。

表4 山藥提取物對烤制后馬友魚失重及pH 值的影響Table 4 Effects of yam extract on weight loss and pH value of roasted Eleutheronema tetradactylum

2.3 山藥提取物對雜環(huán)胺前體物（肌酸、肌酐、葡萄糖、氨基酸）的影響

由表5 可知，對照組馬友魚烤制后的肌酸含量與生肉相比顯著減少，肌酐含量顯著增多，這可能是由于馬友魚在加工過程中，肌酸在高溫下轉(zhuǎn)化為肌酐，雜環(huán)胺含量增多。 由表3 可知，雜環(huán)胺主要含量集中在Norharman 及Harman 中，而IQ、8-MeIQx 和其它雜環(huán)胺含量較少，有研究表明Norharman 與Harman，其形成主要來自色氨酸等氨基酸，幾乎不受肌酸和肌酐的影響[21]。 山藥提取物組相比對照組，肌酸、肌酐等前體物含量均有不同程度增加，說明山藥提取物的添加可能阻礙了前體物向雜環(huán)胺的轉(zhuǎn)化，從而抑制了雜環(huán)胺的生成。肌肉中的糖類多以糖原的形式存在，這可能是生肉組葡萄糖含量低的主要原因。 Skog 等[22]用14C 同位素標(biāo)記法證實來自于葡萄糖的碳原子與咪唑喹喔啉衍生物結(jié)合形成IQx、8-MeIQx 和4，8-DiMeIQx。本研究可能是山藥提取物阻止了雜環(huán)胺前體物葡萄糖的轉(zhuǎn)化，從而降低了雜環(huán)胺的含量。

表5 馬友魚烤制后及生肉中肌酸、肌酐、葡萄糖的含量Table 5 Concentration of creatine，creatinine and glucose in roasted and raw Eleutheronema tetradactylum

添加了山藥提取物后，對游離氨基酸的含量產(chǎn)生了影響。 有研究證明甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸及蘇氨酸等氨基酸是雜環(huán)胺的前體氨基酸[23-25]。生肉中的氨基酸含量顯著高于烤制后的氨基酸含量，添加了山藥提取物組中甘氨酸的含量高于對照組，甘氨酸已被證明是MeIQx 的前體氨基酸[26]，甘氨酸含量的增加說明添加山藥提取物可能阻礙了甘氨酸前體物向雜環(huán)胺的轉(zhuǎn)化。 因此對MeIQx有一定的抑制作用。

表6 馬友魚烤制后及生肉中氨基酸的含量（mg/g）Table 6 Concentration of amino acid in roasted and raw Eleutheronema tetradactylum （mg/g）

2.4 山藥提取物對脂肪氧化的影響

脂質(zhì)氧化是通過測量各組烤馬友魚中的TBARS 值來進行表示。 由圖1 可知，其中生肉組的脂質(zhì)氧化程度最低為（0.560±0.006） mg MDA/kg，對照組烤馬友魚的TBARS 值為（1.068±0.026）mg MDA/kg。 而添加了山藥組烤馬友魚的TBARS值顯著小于對照組。 TBARS 值的降低表示添加物對脂質(zhì)氧化有較好的抑制作用，與肉類脂肪氧化程度有很強的相關(guān)性[27]。 山藥中的山藥多糖可以通過清除羥基自由基等途徑來減少油炸魚中脂質(zhì)氧化的生成[28]。 結(jié)果表明，雜環(huán)胺含量變化與脂質(zhì)氧化變化呈正相關(guān)。已有研究表明，脂質(zhì)氧化對肉制品中雜環(huán)胺的形成有促進功能，可能是由于氧化產(chǎn)物羰基化合物與氨基酸結(jié)合，發(fā)生了Strecker降解，從而使樣品中苯乙醛等的前體物質(zhì)增多，從而對雜環(huán)胺的生成產(chǎn)生促進作用[29]。 說明通過山藥提取物來降低烤馬友魚的脂質(zhì)氧化是一種有效減少雜環(huán)胺的手段。

圖1 烤馬友魚中硫代巴比妥酸值含量Fig.1 TBARS values in roasted Eleutheronema tetradactylum with yam extracts

2.5 山藥提取物對蛋白氧化的影響

羰基化是一種非酶促不可逆的蛋白質(zhì)氧化修飾，由氧化應(yīng)激或其它機制誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的羰基形成過程，是蛋白質(zhì)氧化最重要的表征模式[30]。 圖2為樣品蛋白質(zhì)的羰基含量，由圖可知，與對照組的羰基值（0.0036±0.0003） nmol/mg 相比，添加山藥提取物的烤馬友魚中的蛋白質(zhì)羰基含量明顯降低，為（0.0027±0.0006）nmol/mg。結(jié)果表明，雜環(huán)胺含量變化與蛋白氧化變化呈正相關(guān)。 在烹飪過程中，不僅抗氧化防御系統(tǒng)受損，自由基也隨之產(chǎn)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化[31]。 這可能是由于添加山藥提取物后，使烤馬友魚中自由基含量降低，從而使蛋白質(zhì)羰基值與雜環(huán)胺含量變化一致。

圖2 烤馬友魚中蛋白質(zhì)羰基含量Fig.2 Protein carbonyl values in roasted Eleutheronema tetradactylum with yam extracts

2.6 山藥提取物對揮發(fā)性風(fēng)味的影響

由表7 可知，烤馬友魚中的揮發(fā)性有機物主要包括醛類、吡嗪類、酮類和酯類等。 圖3 可以明顯看出，不同烤馬友魚中的揮發(fā)性有機物存在差異；為了明確具體哪些物質(zhì)存在差異，選取所有峰進行指紋圖譜（圖4）對比。 圖4 紅框中的物質(zhì)，添加了山藥的烤馬友魚的含量低于對照，包括辛醛、2-丁酮、異丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、庚醛、己醛、壬醛和2，3-二甲基吡嗪等，多數(shù)為醛類。 結(jié)果顯示添加了山藥的烤馬友魚中多種醛類物質(zhì)含量降低。 圖5 為空白和添加了山藥的馬友魚的PCA 分析圖，該圖可以直觀的顯示不同樣品間的差異，樣品之間距離近則代表差異小，距離遠則代表差異明顯。 由圖5 可知，添加了山藥后，烤馬友魚中的揮發(fā)性有機物變化很大。

圖3 對照組和山藥組中揮發(fā)性有機物的GC-IMS 譜圖（差異對比）Fig.3 GC-IMS spectra of volatile organic compounds in the control group and the yam group （difference comparison）

圖4 對照組和山藥組中揮發(fā)性有機物的指紋譜圖Fig.4 Fingerprint spectra of volatile organic compounds of control group and yam extract group via GC-IMS gallery plot

圖5 對照組和山藥組主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis （PCA） plot of volatile organic compounds of the control group and the yam extract group via GC-IMS

表7 化合物列表Table 7 List of inorganic compounds

3 結(jié)論

本研究選用營養(yǎng)價值高的馬友魚作為原料，將山藥提取物添加到腌泡汁中，對將馬友魚腌泡后進行烤制，顯著降低了烤馬友魚中雜環(huán)胺的含量，其中IQ 與8-MeIQx 含量降低到檢測線以下，Norharman 與Harman 分別降低59.08%和47.99%。通過失重與pH 值結(jié)果可得，添加了山藥提取物對其理化指標(biāo)無明顯影響； 通過硫代巴比妥酸值與蛋白質(zhì)羰基值分析，添加山藥提取物后可以顯著降低烤制馬友魚過程中的脂質(zhì)氧化與蛋白氧化，且與雜環(huán)胺含量呈正相關(guān)； 添加山藥提取物后，肌酸、肌酐、還原糖和氨基酸含量的變化，證明了添加山藥提取物抑制了前體物向雜環(huán)胺的轉(zhuǎn)換，從而降低了雜環(huán)胺含量。此外添加山藥提取物后，對烤馬友魚風(fēng)味有一定影響，包括辛醛、2-丁酮、異丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、庚醛、己醛、壬醛和2，3-二甲基吡嗪等物質(zhì)有一定程度的降低。 本研究為烤馬友魚的合理加工提供理論依據(jù)與參考，在防止食品高溫?zé)峒庸るs環(huán)胺危害，提高食品加工安全性方面具有重要意義。