乳鐵蛋白與納米脂質(zhì)體的相互作用及對(duì)磷脂膜結(jié)構(gòu)的影響

李日升，唐文婷，孫 玥，蒲傳奮

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109）

納米脂質(zhì)體（Nano-liposome，N-lip）是磷脂及其結(jié)構(gòu)類似物在水相中自發(fā)形成的一種具有雙分子層結(jié)構(gòu)的超微球狀粒子[1]。 N-lip 結(jié)構(gòu)中含有親水核心和磷脂雙分子層，可同時(shí)包埋疏水性和親水性營(yíng)養(yǎng)素，已被用于活性蛋白質(zhì)[2]、維生素[3]、多酚[4]、黃酮[5]等食品營(yíng)養(yǎng)因子的傳輸載體。 此外，Nlip 雙分子層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，是一種生物相容性高、安全性能好的傳輸載體[6-7]。

N-lip 的遞送特性取決于其與所處環(huán)境介質(zhì)的相互作用。 食品蛋白與N-lip 的界面互作及其遞送特性干預(yù)效應(yīng)已有相關(guān)研究報(bào)道。 如Yi 等[8]發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白可插入脂質(zhì)體雙層膜，降低膜的流動(dòng)性，提高脂質(zhì)體對(duì)滲透壓、 胃消化的耐受性；Chen 等[9]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白水解物不僅能抑制N-lip 氧化產(chǎn)物的形成，而且能直接與N-lip 雙分子層相互作用，對(duì)N-lip 的穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響；Ragnhildur 等[10]研究表明，涂有冷水魚皮明膠的N-lip 在脫水過程中，可增加脂雙層結(jié)構(gòu)的物理穩(wěn)定性。上述研究主要基于自組裝原理，將蛋白沉積于脂質(zhì)體表面或采用蛋白/磷脂混合物共同構(gòu)建穩(wěn)定的疏水性雙層微結(jié)構(gòu)。 對(duì)于N-lip 與食品蛋白相互作用及對(duì)蛋白及磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)特性的影響仍缺乏系統(tǒng)性研究。 明確N-lip 與食品基質(zhì)蛋白的相互作用對(duì)食品領(lǐng)域脂質(zhì)體的合理設(shè)計(jì)及廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）廣泛分布于動(dòng)物乳汁，分子質(zhì)量約80 ku，含有約703 個(gè)氨基酸殘基[11]，等電點(diǎn)約為8.5，高于絕大多數(shù)的牛乳蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)約為5），使其能夠在較大pH 范圍內(nèi)帶正電荷[12]，可與帶負(fù)電的脂質(zhì)體產(chǎn)生靜電相互作用。 Lf具有廣譜抗菌能力，抗菌模式多樣，被認(rèn)為是一種新型的抗菌藥物和極具開發(fā)潛力的食品添加劑[13-14]。

本研究以Lf 為模型蛋白，采用薄膜分散法制備N-lip，在優(yōu)化N-lip 制備配方的基礎(chǔ)上，測(cè)定不同蛋白濃度和滴加方式下形成的納米脂質(zhì)體/乳鐵蛋白（N-lip/Lf）復(fù)合物的粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位。 采用隱形率（Fraction of stealthiness，F(xiàn)s）為指標(biāo)，估計(jì)N-lip 與Lf 的結(jié)合程度；利用透射電子顯微鏡觀察Lf 和N-lip 作用前、 后的尺度形貌；采用紫外光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜、X 射線衍射、圓二色譜，分析Lf 與N-lip 的相互作用及對(duì)蛋白和磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆卵磷脂 （>95%，CAS-號(hào)：800243-5）、Tween-80 （CAS-號(hào)：9005-65-6）、 乳鐵蛋白（>95%，CAS-號(hào)：112163-33-4）、 膽固醇（CAS-號(hào)：57-88-5），源葉生物技術(shù)有限公司（中國(guó)上海）；磷鎢酸（CAS-號(hào)：12067-99-1），北京中鏡科技有限公司；所有其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

YRE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中國(guó)鞏義市鞏義市雨花儀器有限公司；SM-150D 細(xì)胞破碎儀，上海曙木技術(shù)有限公司；Nano-ZS90 動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀，美國(guó)馬爾文儀器有限公司；JE M-2200FS透射電子顯微鏡、F-27000 熒光分光光度計(jì)，日本日立有限公司；UV-2600 紫外-可見分光光度計(jì)，上海衡平技術(shù)有限公司；Vertex 70v 傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)熱電尼高力公司；AXS D8 ADVANCE X 射線衍射儀，德國(guó)布魯克AXS 有限公司；Chirascan 圓二色光譜儀，英國(guó)Applied Photophysics 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 N-lip 的制備及條件確定

1.3.1.1 N-lip 的制備 采用薄層分散法制備Nlip[15]。 按不同的質(zhì)量比稱取大豆卵磷脂、膽固醇和Tween-80，加入20 mL 乙醇在超聲波破碎條件下，將混合物均勻混合溶于乙醇。 將溶液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在40 ℃下對(duì)乙醇進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至形成均勻薄膜，然后將干燥的脂質(zhì)膜用40 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4，0.01 mol/L）水合。 在冰?。▽⑷芤簻囟瓤刂圃?0 ℃以下）條件下使用細(xì)胞破碎儀在50%的振幅下（工作1 s，停止1 s）進(jìn)行超聲波處理15 min。 最終磷脂在PBS 中的質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3.1.2 N-lip 制備條件的確定

1） 膽固醇含量對(duì)N-lip 平均粒徑和Zeta-電位的影響 固定磷脂與Tween-80 的質(zhì)量比為4∶1，磷脂與PBS（pH = 7.4，0.01 mol/L）的油水比為10.0 mg/mL，磷脂與膽固醇質(zhì)量比分別設(shè)為8∶1，10∶1，12∶1，采用薄層分散法制備N-lip，用動(dòng)態(tài)光散射激光粒度分析儀 （Dynamic light scattering laserparticle size analyzer，DLS）測(cè)試N-lip 的平均粒徑和Zeta-電位。

2） Tween-80 含量對(duì)N-lip 平均粒徑和Zeta-電位的影響 固定磷脂與膽固醇質(zhì)量比例為10∶1，磷脂與PBS（pH = 7.4，0.01 mol/L）的油水比為10.0 mg/mL，再設(shè)磷脂與Tween-80 的質(zhì)量比分別為4∶1，5∶1，6∶1。 采用薄層分散法制備脂質(zhì)體，用DLS 測(cè)試N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI。

1.3.2 N-lip/Lf 復(fù)合物的形成條件對(duì)其平均粒徑和Zeta-電位的影響

1.3.2.1 Lf 濃度對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑和Zeta-電位的影響 稱取一定質(zhì)量的Lf 溶解到PBS（pH=7.4，0.01 mol/L）中，按1∶1（N-lip ∶Lf）的體積比，按30 滴/min 的速度將質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的N-lip 分別滴加到0.1，0.5，2，10，20，50，100 mg/mL 的Lf 溶液中，形成N-lip/Lf 復(fù)合物，用DLS 測(cè)試N-lip/Lf 復(fù)合物的平均粒徑和Zeta-電位。

1.3.2.2 滴加方式對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物形成的影響

其它條件不變，N-lip 的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，Lf 的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。 分別采用N-lip 滴加至Lf 和Lf 滴加至 N-lip 兩種方式形成N-lip/Lf復(fù)合物，采用DLS 測(cè)定復(fù)合物的平均粒徑和Zeta-電位。

1.4 N-lip/Lf 復(fù)合物的性質(zhì)表征

1.4.1 Zeta-電位、平均粒徑分析 使用DLS 在散射角為90°，溫度為25 ℃時(shí)，測(cè)量粒度、Zeta-電位和分散度。 檢測(cè)前，將N-lip/Lf 復(fù)合物用PBS（pH=7.4，0.01 mol/L）稀釋100 倍，加至專用比色皿或電位皿中測(cè)試。 每次測(cè)試重復(fù)3 遍[16]。

1.4.2 透射電子顯微鏡 （Transmission electron microscope，TEM） 將N-lip/Lf 復(fù)合物經(jīng)PBS（pH=7.4，0.01 mol/L）稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，將樣品滴加在銅網(wǎng)正面直至干燥完全，再滴加2%磷鎢酸溶液負(fù)染再干燥，采用TEM 觀察N-lip、N-lip/Lf 復(fù)合物的形態(tài)。 用NanoMeasure 軟件TEM 圖進(jìn)行分析。

1.4.3 紫外可見分光光度計(jì) （Ultraviolet-visible spectrophotometry，UV） 按30 滴/min 的速度分別將1，2，4，5，8 mg/mL 的N-lip 分散液10 mL 按1 ∶1 的體積比，滴加到0.1 mg/mL 的Lf 溶液中，形成N-lip ∶Lf 質(zhì)量比為1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1，5 ∶1，8 ∶1 的Nlip/Lf 復(fù)合物。 以PBS 為空白背景，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫外光譜，測(cè)試波長(zhǎng)范圍為190～300 nm[17]。

1.4.4 熒光光譜 用PBS 作對(duì)照，在激發(fā)波長(zhǎng)285 nm，發(fā)射光譜波長(zhǎng)范圍為300～450 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5.0 nm，掃描速度為300 nm/min 下，通過熒光分光光度計(jì)在25 ℃下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量[18]。

1.4.5 衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜（Attenuated total reflectance Fourier transform infrared，ATR-FTIR） 紅外光譜是通過配備了（SMART iTR）ATR 附件的傅顯葉變換紅外光譜儀而獲得。將凍干的N-lip/Lf 復(fù)合物樣品涂抹到ATR 附件上，將波長(zhǎng)范圍設(shè)為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64 次，用空氣做背景進(jìn)行FTIR測(cè)試[19]。

根據(jù)蛋白質(zhì)紅外圖譜分析方法，使用PeakFit Version 4.12 軟件對(duì)Lf 酰胺Ⅰ帶（1700～1600cm-1）特征峰的圖譜進(jìn)行分析。 確定各子峰與各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量[20]。

1.4.6 X 射線衍射（Diffraction of X-rays，XRD）

在室溫下采用Cu Kα 靶作為放射源（λ=1.5458 ?）進(jìn)行X 射線衍射測(cè)試。 測(cè)試前，將樣品置于樣品槽中，并將其表面刮平。 操作電壓為40 kV，測(cè)試電流為40 mA，在5°～60°（2θ）之間記錄樣品的XRD 光譜，步速為0.1006 s/step。

1.4.7 圓二色光譜 （Circular dichroism，CD） 將N-lip/Lf 復(fù)合物（蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）樣品注射到直徑0.1 cm 體積200 μL 的石英試管中，樣品在遠(yuǎn)紫外掃描范圍260～180 nm 下進(jìn)行CD 光譜測(cè)試，重復(fù)掃描3 次，PBS 做空白對(duì)照。 使用CDNN 軟件對(duì)Lf 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示。 數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件 （IBM SPSS Statistics 26）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），處理方法采用后鄧肯多元方差檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05 為顯著。 使用Origin 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-lip 制備條件的選擇

2.1.1 膽固醇與磷脂質(zhì)量比不同對(duì)N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響 不同膽磷脂/膽固醇的質(zhì)量比對(duì)N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響如表1 所示，隨著磷脂/膽固醇的質(zhì)量比 從8 ∶1 增 加12 ∶1，N-lip 平均粒徑從95.69 nm減小到了85.97 nm（圖1），可能是膽固醇插入磷脂中使脂質(zhì)體粒徑減小。 郭潤(rùn)發(fā)等[22]也研究發(fā)現(xiàn)在脂質(zhì)體制備過程中，膽固醇比例的增加有利于增大磷脂膜的剛性和減小N-lip 的粒徑，使卵磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固。 隨著磷脂/膽固醇的質(zhì)量比從8∶1 增加到12∶1，N-lip 的Zeta-電位絕對(duì)值從26.9 mV 增加到了42.3 mV，之后減小到了21.5 mV。 一般認(rèn)為Zeta-電位絕對(duì)值越大，納米粒子間靜電斥力越大，脂質(zhì)小泡不容易聚集，該體系就穩(wěn)定[23]。PDI 先從0.228 減小到0.216 后增大到0.263且均小于0.3，說明在這一范圍內(nèi)N-lip 的分散度較好[24]。 從表中可以看出磷脂/膽固醇比值為10∶1時(shí)，制備的N-lip 平均粒徑相對(duì)較小，Zeta-電位絕對(duì)值最大，PDI 最小，證明當(dāng)磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為10∶1 時(shí)，制備的N-lip 最穩(wěn)定。

圖1 不同磷脂/膽固醇質(zhì)量比的納米脂質(zhì)體粒徑分布圖Fig.1 Size distribution plots of Nano-liposomes with different mass ratios of phospholipids/ cholesterol

表1 不同磷脂/膽固醇質(zhì)量比對(duì)納米脂質(zhì)體的Zeta-電位、平均粒徑和PDI 的影響Table 1 The effects of different phospholipid/ cholesterol mass ratios on the Zeta-potential，average particle size and PDI of nanoliposomes

2.1.2 Tween 80 與磷脂質(zhì)量比不同對(duì)N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響 不同磷脂/Tween 80 的質(zhì)量比對(duì)N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響如表2 所示，隨著磷脂/Tween 80的質(zhì)量比從4 ∶1 到6 ∶1，N-lip 平均粒徑從94.93 nm 增加到了109.33 nm（圖2），N-lip 的Zeta-電位的絕對(duì)值先從39.33 mV 先減小至34.97 mV，之后增加到了46.43 mV，PDI 均小于0.3。 在磷脂/Tween 80 比值為4∶1 時(shí)，N-lip 的粒徑最小，囊泡的布朗運(yùn)動(dòng)速率與其粒徑呈負(fù)相關(guān)，小粒徑的脂質(zhì)體表現(xiàn)出較快的布朗運(yùn)動(dòng)，可抵御重力沉降作用[25]。 上述結(jié)果表明當(dāng)磷脂和Tween 80 的質(zhì)量比值為4∶1 時(shí)，制備的脂質(zhì)體較為穩(wěn)定。

圖2 不同磷脂/Tween 80 質(zhì)量比的納米脂質(zhì)體粒徑分布圖Fig.2 Size distribution plots of Nano-liposomes with different mass ratios of phospholipids/ Tween 80

表2 不同磷脂/Tween 80 質(zhì)量比對(duì)N-lip 的Zeta-電位、平均粒徑和PDI 的影響Table 2 The effect of different phospholipid/ Tween 80 mass ratios on the Zeta-potential，average particle size and PDI of N-lip

2.2 N-lip/Lf 復(fù)合物的形成

2.2.1 Lf 質(zhì)量濃度對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響 N-lip/Lf 復(fù)合物的形成以及Lf 的吸附對(duì)N-lip 的尺度和電荷特性的影響，見表3。 使用DLS 對(duì)Lf 質(zhì)量濃度不同的Nlip/Lf 復(fù)合物的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 進(jìn)行測(cè)量，觀察到當(dāng)Lf 質(zhì)量濃度變化時(shí)，N-lip/Lf 復(fù)合物的平均粒徑先從100.80 nm 減小到95.16 nm，之后增加到114.70 nm（圖3）。 為估計(jì)N-lip 與Lf 的結(jié)合程度，依據(jù)文獻(xiàn)[26]引入了參數(shù)隱形率（Fraction of stealthiness，F(xiàn)s），其計(jì)算公式如下：

圖3 不同Lf 質(zhì)量濃度的N-lip/Lf 復(fù)合物粒徑分布圖Fig.3 The particle size distribution of N-lip/Lf complexes with different Lf mass concentration

式中，Dh （N-lip）——N-lip 平均粒徑（nm）；Dh（N-lip/Lf）——N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑（nm）；Fs——N-lip 滴加到Lf 溶液后與Lf 的相互作用。Lf 和N-lip 之間的相互作用可以分為2 種，一種是由于Lf 吸附到N-lip 表面而導(dǎo)致N-lip/Lf 復(fù)合物的平均粒徑增加，另一種是由于滲透驅(qū)動(dòng)將Lf插到N-lip 內(nèi)部而導(dǎo)致N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑減小。 Fs 值對(duì)Lf 存在時(shí)脂質(zhì)體的大小變化很敏感，當(dāng)Fs 值為1 時(shí)，表明N-lip 具有隱形特性，即在蛋白存在的情況下，N-lip 仍然保持自身穩(wěn)定性不與蛋白發(fā)生相互作用。 當(dāng)Fs 值在0～1 之間時(shí)，表明N-lip 與蛋白通過氫鍵和疏水作用吸附在N-lip 表面。將N-lip 滴加到不同質(zhì)量濃度的Lf 溶液后，隨著Lf 質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)s 值先增大后減小且均在0～1 之間（表3）。 說明Lf 吸附在N-lip表面，隨著Lf 質(zhì)量濃度的增加，Lf 在N-lip 表面包裹的復(fù)合物涂層先變薄后變厚，這可能是由于隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，Lf 和N-lip 之間的氫鍵、范德華力和疏水作用增強(qiáng)，部分Lf 鑲嵌到了Nlip 的磷脂雙分子層中，Lf 滴加質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，達(dá)到飽和，隨著Lf 質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，Lf不再嵌入到磷脂雙分子層中，而是堆積在N-lip 表面，因此Fs 值減小。從表3 中可以看出，在Lf 質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，N-lip/Lf 復(fù)合物Zeta-電位絕對(duì)值最大，PDI 小于0.3。 確定在穩(wěn)定的Zeta-電位下獲得足夠的表面覆蓋率和較小的粒徑以及Nlip/Lf 復(fù)合物粒徑分布均勻所需的Lf 質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。

表3 不同質(zhì)量濃度的Lf 對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物Zeta-電位、平均粒徑和PDI 的影響Table 3 Effects of different mass concentrations of LF on zeta potential，average particle size and PDI of N-lip/Lf complexes

2.2.2 滴加方式對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物Zeta-電位、平均粒徑和PDI 的影響 不同滴加方式對(duì)N-lip/Lf復(fù)合物的影響如圖4 所示，N-lip/Lf 復(fù)合物與Nlip 的粒徑分布圖相比，N-lip 的平均粒徑在滴加Lf 至N-lip 或被滴加至N-lip 后平均粒徑均有所增加，而N-lip 滴加至Lf 中比Lf 滴加至N-lip 中的平均粒徑小。 通過這一結(jié)果初步推測(cè)N-lip 和Lf 發(fā)生了相互作用，且使N-lip 的平均粒徑增大了。滴加方式對(duì)納米N-lip 的平均粒徑、Zeta-電位和PDI 的影響如表4 所示，N-lip 滴加Lf 形成的N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑為100.80 nm，Zeta-電位的絕對(duì)值為54.9 mV，PDI 為0.213，Lf 滴加至Nlip 形成的N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑為104.73 nm，Zeta-電位的絕對(duì)值為38.2 mV，PDI 為0.225。二者相比Lf 滴加至N-lip 形成的N-lip/Lf 復(fù)合物平均粒徑和PDI 更小，Zeta-電位的絕對(duì)值更大。證明N-lip 滴加至Lf 形成的N-lip/Lf 復(fù)合物比Lf滴加至N-lip 形成的N-lip/Lf 復(fù)合物體系更加穩(wěn)定。

圖4 不同滴加方式對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物粒徑分布的影響Fig.4 Effect of different dropping methods on particle size distribution of N-lip/Lf complexes

表4 不同滴加方式對(duì)N-lip/Lf 復(fù)合物Zeta-電位、平均粒徑和PDI 的影響Table 4 Effects of different dropping methods on zeta potential，average particle size and PDI of N-lip/Lf complexes

2.3 TEM 分析

為了研究N-lip 和Lf 是否發(fā)生了相互作用，以及作用前、 后的形態(tài)學(xué)差異，采用透射電鏡對(duì)N-lip 和N-lip/Lf 復(fù)合物2 個(gè)樣品的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。 如圖5a 所示，N-lip 囊泡呈球狀，粒徑分布較為均勻，粒徑約為90 nm。 圖5b 顯示的N-lip/Lf復(fù)合物TEM 圖仍呈球狀，然而與N-lip 相比粒徑有所增大，約為100 nm，與上述DLS 的測(cè)量結(jié)果一致。 插圖可見脂質(zhì)體球形周圍出現(xiàn)了一層淺色的包覆層。 參考Wagner 等[27]對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體吸附作用的研究，推測(cè)Lf 可能通過氫鍵、范德華力和疏水作用吸附在了N-lip 表面形成了一層淺色的包覆層。

圖5 N-lip 的TEM 圖（a）；N-lip/Lf 復(fù)合物的TEM 圖（b），圖中插圖為對(duì)應(yīng)區(qū)域的放大圖Fig.5 The TEM diagram of N-lip （a）； The TEM image of the N-lip/Lf complexes （b），the inset in the figure is an enlarged view of the corresponding area

2.4 UV 分析

紫外光譜能夠有效的監(jiān)測(cè)Lf 中色氨酸和酪氨酸殘基所處微環(huán)境變化。 如果Lf 和N-lip 之間未發(fā)生相互作用，Lf 在滴加N-lip 后N-lip/Lf 復(fù)合物的光譜應(yīng)與N-lip 或Lf 的圖譜重合[28]。 從圖6a 可以觀察到N-lip/Lf 復(fù)合物的紫外光譜峰強(qiáng)度和位置與N-lip、Lf 紫外光譜峰存在明顯差異，表明N-lip 和Lf 之間的相互作用，致使Lf 中色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生變化。從圖6b 可以看出，隨著N-lip ∶Lf 的質(zhì)量比從1 ∶1 增加到了8 ∶1，N-lip/Lf 復(fù)合物的最大吸收峰從210 nm 紅移到了242 nm，吸光度強(qiáng)度從0.235 增加到了0.792。 導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于N-lip 對(duì)Lf 的構(gòu)象產(chǎn)生影響[29]，導(dǎo)致Lf 中色氨酸和酪氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)[30]。N-lip 進(jìn)入Lf 中的疏水性氨基酸殘基之間，通過疏水相互作用形成疏水口袋，Lf 的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)暴露到表面，使得紫外吸光度不斷增強(qiáng)。

圖6 Lf、N-lip 和N-lip/Lf 復(fù)合物的紫外光譜（a）；Lf 和N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的N-lip/Lf 復(fù)合物的紫外光譜（b）Fig.6 UV spectrum of Lf，N-lip and N-lip/Lf complexes （a）； UV spectrum of N-lip/Lf complexes with different mass ratios of Lf and N-lip∶Lf （b）

2.5 熒光光譜分析

Lf 的內(nèi)源熒光主要來自芳香氨基酸殘基，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3 種熒光團(tuán)，其中色氨酸和酪氨酸具有大的疏水表面積，并為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的核結(jié)構(gòu)提供疏水相互作用[31]。 Lf 的內(nèi)源熒光發(fā)射主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基的激發(fā)，且受鄰近氨基酸和周圍疏水性的影響[13]。 圖7 是Nlip 與Lf 相互作用的內(nèi)源熒光光譜圖。 隨著N-lip的質(zhì)量比在N-lip∶Lf 復(fù)合物體系中逐漸增加，Lf的最大發(fā)射峰由332 nm 藍(lán)移至321.5 nm。 色氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)的藍(lán)移可能是N-lip 與Lf 表面的色氨酸殘基結(jié)合改變了其所處微環(huán)境的極性，導(dǎo)致色氨酸周圍環(huán)境的疏水性增強(qiáng)[32]。 蛋白疏水區(qū)的變化可能會(huì)改變其在油水界面上的分散和吸附[33]。 另外，隨著N-lip 的質(zhì)量比在N-lip∶Lf 復(fù)合物體系中逐漸增加，Lf 的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度也從1 583 a.u 減小到了648.7 a.u，這可能是由于N-lip的硝基氧基團(tuán)對(duì)Lf 構(gòu)象產(chǎn)生了潛在影響，導(dǎo)致Lf中色氨酸的內(nèi)源熒光被猝滅[34]。

圖7 Lf、N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的N-lip/Lf 復(fù)合物熒光光譜圖Fig.7 Lf，N- lip∶Lf fluorescence spectra of N-lip/LF complexes with different mass ratios

2.6 ATR-FTIR 分析

由圖8 可以看出隨著N-lip 占比的增加，Nlip/Lf 復(fù)合物的FTIR 在3 200 cm-1附近的特征峰從3 209 cm-1移至3 274 cm-1，表明隨著N-lip 占比增加，N-lip/Lf 復(fù)合物中形成了更多的氫鍵，這可以歸因于Lf 的羰基與磷脂的氧基團(tuán)之間形成了更多的氫鍵。 N-lip/Lf 復(fù)合物的特征峰隨著N-lip占比的增加，對(duì)稱和非對(duì)稱CH2伸縮振動(dòng)的光譜峰從2 853.26 cm-1和2 923.35 cm-1位移到2 853.15 cm-1和2 922.17 cm-1。這可能歸因于Lf 與N-lip 相互作用后的疏水性增強(qiáng)。在1 736 cm-1處的峰可以被認(rèn)為是N-lip 中酯羰基的C=O 伸縮振動(dòng)。 隨著N-lip 占比的增加，N-lip/Lf 復(fù)合物在此處的峰略有增加，說明Lf 與N-lip 發(fā)生了相互作用。 綜上，通過FTIR 光譜圖初步推測(cè)脂質(zhì)體與乳鐵蛋白之間存在氫鍵和疏水性相互作用[35-36]。

圖8 Lf、N-lip、N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的N-lip/Lf 復(fù)合物FTIR 光譜Fig.8 Lf，N-lip，N-lip/Lf protein complexes FTIR spectra with different mass ratios of N-lip ∶Lf

在蛋白質(zhì)的FT-IR 圖譜中，酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）由代表羰基伸縮振動(dòng)的幾個(gè)子帶組成[37]。 將Lf 及N-lip/Lf 復(fù)合物的二階導(dǎo)數(shù)譜圖和曲線擬合譜圖進(jìn)行峰位分析后，得到Lf 振動(dòng)吸收峰在圖譜中對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)百分含量。 變化見表5，隨著N-lip∶Lf 質(zhì)量比從1∶1 增加到8∶1，Lf 中β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例先減少后增加，整體從21.86%降低到14.60%。 無規(guī)則卷曲先減少后增加，整體變化不大。 α-螺旋從21.29%增加到35.89%。 β-轉(zhuǎn)角先增加后減少，整體從27.76%減少到20.50%。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化說明Lf 內(nèi)部有新的二級(jí)結(jié)構(gòu)排列形成，新的結(jié)構(gòu)變化主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)的增加。 通過對(duì)N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以看出，隨著N-lip 添加比例的增加，Lf 內(nèi)部多肽鏈又進(jìn)行了重新自組裝，產(chǎn)生了大量以α-螺旋為主的有序結(jié)構(gòu)[38]。

表5 利用酰胺Ⅰ帶擬合Lf、N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的N-lip/Lf 復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果Table 5 The results of fitting the secondary structure of N-lip/Lf complexes with different mass ratios of Lf and N-lip∶Lf using amide I bands

2.7 XRD 分析

XRD 常被用來檢測(cè)結(jié)晶度和晶體的結(jié)構(gòu)特征，一般來講，尖峰象征晶體結(jié)構(gòu)，寬峰表示為無定形結(jié)構(gòu)[39]。 圖9 顯示Lf、N-lip 和N-lip/Lf 復(fù)合物的XRD 圖，均表現(xiàn)出無尖峰、無定形的特征。 Lf衍射峰的2θ 角為21.67°，N-lip 衍射峰的2θ 角為19.69°。 N-lip/Lf 復(fù)合物表現(xiàn)出一個(gè)寬的的衍射峰，2θ 角為19.83°，表明N-lip 和Lf 的復(fù)合物仍為非晶體結(jié)構(gòu)。 然而，N-lip/Lf 復(fù)合物的X 衍射峰位置、強(qiáng)度和寬度明顯區(qū)別于N-lip 和Lf 的峰，鄒文潔[39]的研究有類似發(fā)現(xiàn)，這可能是由于Lf 包裹到了N-lip 膜外層后脂質(zhì)體膜體系發(fā)生改變，相互作用并形成了更加穩(wěn)定有序的結(jié)構(gòu)。

圖9 Lf、N-lip 和N-lip/Lf 復(fù)合物的XRD 圖Fig.9 X-ray patterns of Lf，N-lip and N-lip/Lf protein complexes

2.8 CD 分析

CD 光譜是表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段。 Yi 等[40]研究發(fā)現(xiàn)N-lip 加入到蛋白后會(huì)改變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 為了進(jìn)一步探索Lf 和N-lip的相互作用，對(duì)Lf 和含不同質(zhì)量濃度N-lip 的Nlip/Lf 復(fù)合物溶液進(jìn)行了CD 光譜掃描。如圖10 所示，Lf 在208 nm 左右有一處負(fù)的吸收峰，是α-螺旋構(gòu)象[41]。 在加入不同質(zhì)量濃度的N-lip 后，各樣品的CD 光譜的208 nm 處峰強(qiáng)絕對(duì)值較Lf 都有所增加，且隨著N-lip 質(zhì)量濃度的增加，峰強(qiáng)絕對(duì)值越大。 Lf 的氨基酸殘基組成50%以上是疏水性氨基酸，且主要處于α-螺旋結(jié)構(gòu)[42]，結(jié)合紫外疏水性結(jié)果分析，N-lip 可能是通過氫鍵、 范德華力與Lf 相互作用促使疏水性氨基酸環(huán)境改變，并影響到Lf 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Lf 的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加[43]。 這一觀察結(jié)果表明，N-lip/Lf 復(fù)合物和Lf 相比二級(jí)結(jié)構(gòu)變化主要發(fā)生在α-螺旋結(jié)構(gòu)上，且α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的增加具有N-lip 質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，這一結(jié)論和紅外分析結(jié)果一致。

圖10 LF、N-lip∶Lf 質(zhì)量比不同的N-lip/Lf 復(fù)合物CD 光譜Fig.10 Lf，N-lip∶N-lip/Lf protein complexes CD spectra with different mass ratios of Lf

3 結(jié)論

本文在優(yōu)化N-lip 制備配方的基礎(chǔ)上，研究了N-lip 與Lf 形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性及不同質(zhì)量濃度的N-lip 與Lf 之間的相互作用。N-lip 在與Lf形成復(fù)合物后，粒徑增大，電位絕對(duì)值增加，PDI<0.3，仍保持較好分散性。形貌觀察表明Lf 在N-lip邊緣形成淺色包裹，致使體系平均粒徑增大。這可能是由于Lf 可以通過氫鍵和疏水作用與N-lip 雙層膜發(fā)生相互作用，吸附到磷脂膜表面。 N-lip/Lf復(fù)合物的形成導(dǎo)致Lf 中色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，改變其在油水界面上的分散和吸附。 N-lip 的作用改變了Lf 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的增加。 N-lip 與Lf結(jié)合形成了一種新的、更加穩(wěn)定有序的結(jié)構(gòu)。 Nlip 與Lf 之間的相互作用隨著N-lip 質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。 本研究以Lf 為模型蛋白，證實(shí)了食品蛋白與N-lip 之間能夠通過分子互作形成復(fù)合物，進(jìn)而改變其結(jié)構(gòu)和理化特性。結(jié)果可為納米脂質(zhì)體作為傳輸載體與食品蛋白的相互作用及其應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。