糖基化對(duì)分離乳清蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

張園園，王 聰，馬 琴，李冬冬，李佩佩，劉敦華

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

分離乳清蛋白（Whey protein isolate，WPI）是將濃縮乳清蛋白經(jīng)工藝處理得到的高純度乳清蛋白[1]，具有優(yōu)良的乳化性、起泡性和凝膠性等，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)之一[2]。 目前，WPI 不僅可以作為活性成分應(yīng)用于食品中，增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也可以作為載體用于生物活性物質(zhì)的傳遞體系的構(gòu)建[3]，然而WPI 單獨(dú)構(gòu)建的傳遞體系化學(xué)穩(wěn)定性通常較差，并存在生物活性物質(zhì)易發(fā)生氧化降解等缺點(diǎn)[4]，而蛋白-多糖復(fù)合物可以彌補(bǔ)以上缺陷[5]。 研究證實(shí)，蛋白-多糖的共價(jià)接枝可以改善單一蛋白的乳化性能和其水包油乳液的物理穩(wěn)定性[6]。

沙蒿膠 （Artemisia sphaerocephala Krasch.gum，ASG） 是從沙蒿籽中提取的一種親水性雜多糖，主要由葡萄糖、半乳糖和木糖等糖基以及糖醛酸組成，不溶于水、一般有機(jī)溶劑和熱的稀酸、稀堿溶液[7-8]。 沙蒿膠具備天然乳化劑的潛力[9]，常作為增稠劑、穩(wěn)定劑和保水劑等，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)[10-11]。沙蒿膠與外源蛋白結(jié)合可以通過(guò)美拉德反應(yīng)改變外源蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其乳化性、溶解性、凝膠性和熱穩(wěn)定性等[12]。袁程程等[13]研究證實(shí)添加一定量的沙蒿膠可明顯增強(qiáng)蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠的保水性和凝膠彈性； 沙蒿膠的黏度為明膠的1 800 倍，并具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性[14]。

蛋白質(zhì)通常作為乳化劑存在于乳液中，具有快速降低油-水界面的表面張力以及防止液滴絮凝和聚集的能力，而多糖主要作為穩(wěn)定劑。蛋白質(zhì)改性主要有物理、化學(xué)和生物酶法，本文運(yùn)用的糖基化法屬于化學(xué)改性[15]。 蛋白質(zhì)的糖基化改性是蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基與糖分子還原末端的羰基之間發(fā)生的羰氨反應(yīng)[16]，以共價(jià)鍵結(jié)合的方式將糖類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)分子上的ε-或α-氨基連接，反應(yīng)后所得的糖蛋白同時(shí)具備蛋白質(zhì)大分子特性和糖類(lèi)物質(zhì)的親水性，其乳化能力、熱穩(wěn)定性和凝膠性等功能特性均相對(duì)提高[17]。 有研究表明，利用糖和蛋白質(zhì)通過(guò)糖基化交聯(lián)，可以改善蛋白質(zhì)部分功能特性[18-19]。 An 等[20]發(fā)現(xiàn)卵清蛋白與羧甲基纖維素經(jīng)糖基化反應(yīng)，其乳化特性明顯增強(qiáng)。

糖基化修飾可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)改性，而利用沙蒿膠與蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)復(fù)合的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 本試驗(yàn)利用分離乳清蛋白和沙蒿膠混合，通過(guò)美拉德反應(yīng)途徑制備糖基化產(chǎn)物，測(cè)定其在不同條件下的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。 采用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定WPI-ASG 共價(jià)復(fù)合物的最佳工藝參數(shù)，并分析比較分離乳清蛋白和沙蒿膠在反應(yīng)前、后分子結(jié)構(gòu)及功能特性方面的差異，以期為分離乳清蛋白的乳化性能提升和蛋白-多糖共價(jià)復(fù)合物的制備，物理穩(wěn)定性的提高，應(yīng)用蛋白或糖類(lèi)的開(kāi)發(fā)提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

分離乳清蛋白，鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司；野生沙蒿籽，農(nóng)戶收購(gòu)；菜籽油，當(dāng)?shù)爻?；SDSPAGE 試劑及耗材，Biorad 公司； 其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DXR 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；T6紫外分光光度計(jì)，北京普析儀器有限公司；微型旋渦混合儀、DSC 800003061404 差示掃描量熱儀（DSC），美國(guó)Perkin Elmer； 傅里葉紅外光譜儀（FTIR-ATR）、Mastersizer30000303081002全自動(dòng)激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海雙旭電子有限公司；L-8900 型全自動(dòng)氨基酸自動(dòng)分析儀、Ultra-Turrax T25 超高速電子攪拌機(jī)，德國(guó)IKA 公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品的準(zhǔn)備

分別準(zhǔn)備分離乳清蛋白 （WPI），沙蒿膠（ASG），蛋白和膠混合物（MIX）及反應(yīng)產(chǎn)物（WPI-ASG），MIX 和WPI-ASG 在相同溫度（75，80，85，90，95 ℃） 和時(shí)間（0，30，60，90，120，150，180，210，240 min）條件下處理，主要為蛋白和膠共價(jià)復(fù)合，產(chǎn)物裂解以及類(lèi)黑精等物質(zhì)生成3 個(gè)反應(yīng)階段。

2.1.1 沙蒿膠的制備 沙蒿籽以1∶100 的體積比在蒸餾水中溶解，用5%鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 值至2.0，將溶液在80 ℃水浴1.5 h，高速攪打至膠質(zhì)與種皮分離，4 000 r/min 離心15 min 后，取沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到沙蒿膠。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將分離乳清蛋白與沙蒿膠以體積比5∶1 混合，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，依次確定不同的反應(yīng)時(shí)間（0，30，60，90，120，150，180，210，240 min），反應(yīng)溫度（75，80，85，90，95 ℃），反應(yīng)初始pH 值（9.5，10，10.5，11，11.5），在磁力攪拌器中進(jìn)行美拉德反應(yīng)，對(duì)其中間產(chǎn)物、褐變值、乳化活性進(jìn)行測(cè)定，并按公式（1）計(jì)算其乳化穩(wěn)定性。

式中，ES——乳狀液乳化穩(wěn)定性（min）；C0，C10——乳狀液0 min 和10 min 時(shí)，500 nm 波長(zhǎng)處的吸光值。

2.1.3 WPI-ASG 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為確定分離乳清蛋白改性的最佳工藝條件，運(yùn)用Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取時(shí)間（A）、溫度（B）、反應(yīng)初始pH 值（C）為因素，以乳化活性和乳化穩(wěn)定性為響應(yīng)指標(biāo)建立模型，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Box-Benhnken test factors and level

2.2 糖基化產(chǎn)物的鑒定

2.2.1 糖基化不同反應(yīng)階段指標(biāo)測(cè)定 將樣液與蒸餾水以體積比1∶9 混合，加入體積分?jǐn)?shù)10%的菜籽油，10 000 r/min 均質(zhì)2 min 制得乳狀液，均質(zhì)后分別在0 min 和10 min 吸取乳狀液底部50 μL，與5 mL SDS 溶液（1 g/L）混勻，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定294，420 nm 以及500 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，分別表示為中間產(chǎn)物含量、褐變指數(shù)和乳狀液乳化活性[21-22]，重復(fù)測(cè)定3 次。按公式（1）計(jì)算乳狀液乳化穩(wěn)定性。

2.2.2 交聯(lián)產(chǎn)物氨基酸組成的測(cè)定 樣品氨基酸組成采用L-8900 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，測(cè)定前先將樣品進(jìn)行預(yù)處理： 取樣品約5 mg 于試管中，與10 mL 鹽酸溶液（6 mol/L）混勻，于110 ℃水解24 h 后，冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋溶液至50 mL。 取1 mL 稀釋液進(jìn)行冷凍干燥，將所得干粉末在5 mL 蒸餾水中溶解，再次冷凍干燥，重復(fù)3 次，該過(guò)程以除去鹽酸[23]。

2.3 紅外光譜（FTIR-ATR）分析

將2 mg 冷凍干燥樣品粉末與200 mg 溴化鉀混合并研磨均勻，壓片測(cè)定FTIR。 測(cè)量樣品前記錄背景，以空氣的吸收光譜為準(zhǔn)，并在樣品光譜中自動(dòng)減去，測(cè)樣期間用干燥N2不斷淋洗測(cè)量室，以防止水蒸汽光譜吸收干擾。 在4 cm-1分辨率，4 000～450 cm-1頻率范圍內(nèi)，測(cè)定吸收光譜，掃描16 次[24]。

2.4 凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取凍干的各樣品粉末100 mg，與500 μL 氯化鈉-磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）充分混勻，3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液保存于冷藏條件下。 取上清液200 μL，沸水浴3 min，樣品上樣量15 μL，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。 調(diào)節(jié)樣品濃縮膠階段電壓為60 V，保持該電壓電泳40 min，分離膠階段調(diào)至電壓為120 V，至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。 浸泡染色液中染色2 h 后，于50%乙酸-甲醇溶液中脫色12 h，至蛋白質(zhì)條帶清晰，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析結(jié)果[25]。

2.5 乳液粒徑測(cè)定

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的各樣品粉末充分溶解于純水中，緩慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%菜籽油于樣品溶液中，在15 000 r/min 轉(zhuǎn)速下，利用超高速電子攪拌機(jī)冰浴攪拌3 min，制備乳液。 利用Mastersizer 激光粒度儀在室溫條件下測(cè)量乳液的粒徑，用平均粒徑（nm）表示。

2.6 熒光光譜

采用熒光光譜測(cè)定稀釋50 倍樣品的熒光強(qiáng)度。 設(shè)置275 nm 為激發(fā)波長(zhǎng)，入射狹縫寬為10 nm，靈敏度為3，中速熒光光譜掃描，波長(zhǎng)為200～650 nm[26]。

2.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

調(diào)節(jié)掃描電鏡（SEM） 加速電壓為20 kV，在200 倍，20 μm 放大倍數(shù)下，觀察樣品粉末微觀結(jié)構(gòu)。

2.8 差示掃描熱量分析

參考文獻(xiàn)[27]的方法并略作改進(jìn)，采用差示掃描熱量?jī)x（DSC）測(cè)定樣品的熱學(xué)特性。稱(chēng)取5～10 mg 樣品粉末，分別放入鋁盒中并加蓋密封，鋁蓋中央扎孔，以空盒作為空白對(duì)照。 在30 mL/min 氮?dú)饬魉僦?，? ℃/min 的升溫速率，在30～250 ℃范圍內(nèi)升溫，分析樣品變性溫度及熱焓值變化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)取均值，采用Design Expert 11、Origin 9.8 以及SPSS 26 軟件進(jìn)行試驗(yàn)作圖和數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 WPI-ASG 的效果

3.1.1 反應(yīng)時(shí)間 如圖1a 所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH 值的變化可能抑制了反應(yīng)，使部分產(chǎn)物發(fā)生降解，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為0～150 min 時(shí)，糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物含量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為150～240 min 時(shí)，糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物含量呈降低趨勢(shì)；溶液的褐變指數(shù)顯著性增大（P<0.05），之后有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定；乳化性逐漸升高，在120 min 左右時(shí)達(dá)到最大。 同時(shí)，圖1b 表明乳化穩(wěn)定性在120 min 左右時(shí)達(dá)到最大，可能由于分離乳清蛋白與沙蒿膠中的糖或糖降解產(chǎn)物反應(yīng)發(fā)生了交聯(lián)，使得溶液的乳化性逐漸提高。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子的乳化性能緩慢下降，一方面是由于蛋白質(zhì)分子中的Lys 被破壞，另一方面，蛋白質(zhì)間的相互作用增加，導(dǎo)致溶解度下降[28]，從而引起乳化性的降低，故確定最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min。

圖1 時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)各指標(biāo)的影響Fig.1 The effect of time on each index of Maillard reaction

3.1.2 反應(yīng)溫度 如圖2a 所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物含量和褐變指數(shù)逐漸增加；在90～95 ℃時(shí)，產(chǎn)物的乳化能力最高，由于溫度越高，美拉德反應(yīng)速度越快，反應(yīng)程度也越大，容易生成交聯(lián)的大分子產(chǎn)物。 如圖2b 所示，乳狀液乳化穩(wěn)定性在75～90 ℃，呈先增加后降低的趨勢(shì)，后隨著溫度的升高，乳化穩(wěn)定性上升，而水浴溫度超過(guò)95 ℃后，溶液極易沸騰，嚴(yán)重影響設(shè)備的穩(wěn)定性，并且難以繼續(xù)提升溫度，導(dǎo)致成本消耗增加，故確定反應(yīng)溫度90 ℃為最適條件。

圖2 溫度對(duì)美拉德反應(yīng)各指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of temperature on each index of Maillard reaction

3.1.3 反應(yīng)初始pH 如圖3a 所示，糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物含量和褐變指數(shù)隨起始pH 值的增大呈上升趨勢(shì)，pH 值為11 時(shí)，乳化能力最強(qiáng)，當(dāng)pH 值至11.5 時(shí)，乳化能力有所下降；如圖3b 所示，pH值在9.5～10.5 時(shí)，乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)，pH 值在10.5～11.5 時(shí)，乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)。 由于氨基酸在堿性介質(zhì)中呈陰離子，反應(yīng)活性較強(qiáng)，易發(fā)生褐變，因此，一般在偏堿性環(huán)境下有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，而在偏酸性環(huán)境中美拉德反應(yīng)被抑制，反應(yīng)速率降低[29]。 此外，較高的pH 值離WPI的等電點(diǎn)較遠(yuǎn)，會(huì)引起較強(qiáng)的分子內(nèi)靜電排斥力，蛋白質(zhì)逐漸變性，導(dǎo)致變性蛋白所含氨基酸殘基暴露和更高的溶解度，增強(qiáng)了與油相之間的作用，有助于改善接枝反應(yīng)，使得蛋白乳化活性更好[30-31]。因此，選擇pH 11 為最適條件。

圖3 pH 值對(duì)美拉德反應(yīng)各指標(biāo)的影響Fig.3 The effect of pH value on each index of Maillard reaction

3.1.4 WPI-ASG 工藝優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 方法，確定自變量為時(shí)間（A）、溫度（B）、初始pH 值（C），響應(yīng)值為乳化活性（Y1）和乳化穩(wěn)定性（Y2），設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and result

將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到乳化活性（Y1）和乳化穩(wěn)定性（Y2）對(duì)時(shí)間（A）、溫度（B）和反應(yīng)初始pH 值的回歸方程：

Y1=0.6008+0.0069A+0.0135B+0.0751C-0.0020AB +0.0013AC +0.0030BC +0.0070A2+0.0087B2+0.0235C2

Y2=200.60+2.37A+4.37B+25.25C-0.75AB+0.5AC+1BC+2.33A2+2.83B2+7.57C2

由表3 和表4 可知，回歸方程因變量與自變量線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著并與試驗(yàn)擬合良好，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis variance of regression equation

（續(xù)表3）

表4 回歸方程擬合度分析Table 4 Analysis fitting degree of the regression equation

因素A、B、C 對(duì)響應(yīng)值Y1和Y2兩兩交互作用的響應(yīng)面圖如圖4 所示，響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸型曲面，說(shuō)明響應(yīng)值Y1和Y2在因素A、B、C所設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)均存在最大值，等高線均趨向于圓形，響應(yīng)值Y1和Y2隨著另一因素的變化趨勢(shì)相同，表明兩兩因素之間的交互作用均不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。響應(yīng)曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互影響大，而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[32]。 結(jié)合表中交互項(xiàng)值的分析結(jié)果表明，變量A、B、C 對(duì)響應(yīng)值Y1和Y2均有較大影響[33]。

圖4 交互項(xiàng)對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of interaction terms on the emulsifying activity and the emulsification stability

按照最佳工藝參數(shù)取整驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，如表5 所示，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合良好，證明了模型的有效性。

表5 美拉德產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證Table 5 Verification of emulsifying activity and emulsifying stability of Maillard products

3.2 WPI-ASG 接枝物氨基酸組成的測(cè)定

接枝反應(yīng)是糖的還原羰基和蛋白質(zhì)的氨基之間作用，在反應(yīng)過(guò)程中游離氨基酸不斷變化，然而只有部分氨基酸參與反應(yīng)，主要是賴(lài)氨酸（Lys）殘留物ε-氨基和精氨酸（Arg）胍基，其它氨基酸反應(yīng)程度較低[34]。 因此可以通過(guò)氨基酸含量變化來(lái)判斷。 如表6 所示，WPI-ASG 中Lys 和Asg 含量均低于單一蛋白WPI，MIX 中Lys 和Arg 分別減少了11.9%和4.4%，WPI-ASG 中Lys 和Arg 分別減少了23%和31.1%。 表明Lys 和Asg 很可能是蛋白質(zhì)中參與接枝反應(yīng)的游離氨基酸。因此，這兩種氨基酸含量可以判斷美拉德反應(yīng)程度，在MIX和WPI-ASG 中均發(fā)生了不同程度的美拉德反應(yīng)。

表6 各樣品中賴(lài)氨酸和精氨酸含量Table 6 Lysine and arginine content in each sample

3.3 紅外光譜（FTIR-ATR）分析

FTIR-AT 通過(guò)分子振動(dòng)引起輻射吸收，提供大分子的官能團(tuán)和化學(xué)鍵信息，因此可用于研究WPI-ASG 的分子結(jié)構(gòu)和其相互作用。 如圖5 所示，與WPI 相比，MIX 和WPI-ASG 分別在波長(zhǎng)1 000～1 750 cm-1和3 200～3 700 cm-1范圍內(nèi)均出現(xiàn)明顯吸收峰，這可能是肽鏈中羥基和C-O-C 糖苷鍵數(shù)量增加并伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，表明ASG 以共價(jià)鍵與WPI 形成復(fù)合物[35]。WPI-ASG 在波長(zhǎng)2 800～3 000 cm-1范圍內(nèi)，吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，這可能是由于多糖和蛋白質(zhì)之間互相作用導(dǎo)致亞甲基振動(dòng)減弱，進(jìn)一步說(shuō)明ASG 的共價(jià)接枝使WPI 的功能特性因其結(jié)構(gòu)變化得到改善。

圖5 各樣品紅外光譜譜圖Fig.5 Infrared spectrum of each sample

3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙乙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

采用SDS-PAGE 分析ASG 共價(jià)接枝對(duì)WPI分子質(zhì)量的影響，結(jié)果如圖6 所示。 可以看出，泳道2 大約在13.8，18.0，66.0 ku 處顯示為α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白3 種清晰的蛋白質(zhì)條帶[36]，而4 泳道上面部分相比2、3 泳道沒(méi)有相應(yīng)條帶聚集，說(shuō)明有糖蛋白產(chǎn)生。 與WPI 相比，接枝物的條帶強(qiáng)度均有所下降，并在凝膠頂部周?chē)霈F(xiàn)了分子質(zhì)量更高的新條帶，然而接枝物的條帶均沒(méi)有高出WPI 條帶太多，說(shuō)明ASG 的接枝使WPI 的分子質(zhì)量增大，并且每個(gè)蛋白質(zhì)分子共價(jià)接連的ASG 數(shù)量有限。 電泳過(guò)程中所用的SDS 或β-巰基乙醇沒(méi)有將這些高分子質(zhì)量的接枝物分解，說(shuō)明接枝物是由WPI 和ASG 通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成[37]。

圖6 處理后各樣品電泳圖像Fig.6 Electrophoretic image of each sample after treatment

3.5 WPI-ASG 乳狀液粒徑分析

如圖7 所示，WPI 和WPI-ASG 乳狀液粒徑分布相似，均呈單峰分布并在0.3～0.5 μm 之間，表明乳液粒徑具有良好的均一性，WPI-ASG 的共價(jià)接枝可以提高WPI 乳狀液的乳化性。 主要是由于接枝物WPI-ASG 能夠在油-水界面上形成較厚的界面膜，提高WPI 乳化性能；并在液滴間產(chǎn)生排斥作用以阻止液滴聚集，從而提高乳狀液穩(wěn)定性[38]。Yang 等[39]發(fā)現(xiàn)通過(guò)美拉德反應(yīng)途徑制備的蛋白-大豆多糖共價(jià)接枝物，其粒徑變化有效改善了乳狀液穩(wěn)定性，這與本文的研究結(jié)果相吻合。

圖7 處理后各樣品乳液粒徑分布情況Fig.7 Particle size distribution of each sample emulsion after treatment

3.6 內(nèi)源熒光光譜分析

通過(guò)熒光光譜法可以獲得蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，該方法被認(rèn)為是一種有效提供蛋白質(zhì)周?chē)h(huán)境結(jié)構(gòu)信息變化的技術(shù)手段。 色氨酸和酪氨酸是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的主要來(lái)源，均可在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，且色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)在340 nm 左右[40]。 如圖8 所示，各樣品最大發(fā)射波長(zhǎng)均在340 nm 左右，表明WPI-ASG 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光特性的主要來(lái)源是色氨酸殘基。ASG 的共價(jià)接枝導(dǎo)致WPI 熒光強(qiáng)度明顯降低，熒光強(qiáng)度的降低是由于部分色氨酸參與了接枝反應(yīng)，也可能是由于蛋白和多糖的相互作用，包括復(fù)合物的形成、 分子的重排和能量的轉(zhuǎn)移等對(duì)其熒光強(qiáng)度的淬滅作用[41-42]。多糖鏈的屏蔽作用也能引起熒光強(qiáng)度的降低，Jimenez 等[43]在葡聚糖β-乳球蛋白糖基化的研究中也得到了類(lèi)似的結(jié)果。 本文中熒光強(qiáng)度發(fā)生淬滅可能是由于沙蒿多糖的苯環(huán)與分離乳清蛋白中的酪氨酸基團(tuán)共價(jià)復(fù)合，使得溶劑中酪氨酸殘基暴露減少導(dǎo)致。

圖8 各樣品的熒光光譜圖Fig.8 Fluorescence spectrogram of each sample

3.7 掃描電鏡分析

運(yùn)用掃描電鏡（SEM）在200 倍下拍攝各樣品的電鏡圖，如圖9 所示，沙蒿膠在200 倍電子顯微下，分子結(jié)構(gòu)呈落葉狀散布，大小不均勻，表面平整； 分離乳清蛋白結(jié)構(gòu)呈光滑球狀，大小相對(duì)均勻，結(jié)構(gòu)疏松；MIX 結(jié)構(gòu)變小呈碎玻璃狀，表面平整，界限分明；WPI-ASG 結(jié)構(gòu)相比MIX 更小，呈緊密的碎塊狀散落，闡述了美拉德反應(yīng)前、后不同的微觀結(jié)構(gòu)變化。 這一變化可能是因?yàn)榈鞍着c沙蒿多糖共價(jià)結(jié)合，致使分子間聚集減少，也有可能是因?yàn)樵诩訜釛l件下，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[44]。

圖9 各樣品在200 倍-20 μm 條件下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.9 The microstructure of each sample under the condition of 200 times -20 μm

3.8 差示熱量DSC 分析

如表7 所示，與分離乳清蛋白相比，MIX 和WPI-ASG 的峰值溫度分別上升了14.45，17.43℃，熱焓值分別上升了0.73，10.52 J/g，表明分離乳清蛋白引入糖基后其熱穩(wěn)定性升高。 與沙蒿膠相比，其復(fù)合物熱變性峰值溫度分別下降了13.21，10.23 ℃，熱焓值分別下降了85.93，76.14 J/g，表明沙蒿膠自身的熱穩(wěn)定性較好，與蛋白共價(jià)復(fù)合后熱穩(wěn)定性下降。 其復(fù)合物和接枝產(chǎn)物與沙蒿膠和蛋白之間差異顯著（P<0.05），而復(fù)合物和接枝物之間差異不顯著 （P>0.05）。 其原因可能是WPIASG 在復(fù)合接枝過(guò)程中，蛋白質(zhì)內(nèi)氫鍵斷裂，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，這個(gè)過(guò)程發(fā)生時(shí)會(huì)吸收能量，使得MIX 和WPI-ASG 峰值溫度升高，此過(guò)程稱(chēng)之為熱變性。 由于熱變性溫度和熱焓值可以反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，以及蛋白質(zhì)分子的疏水性和親水性[45]，因此，在反應(yīng)過(guò)程中WPI 結(jié)構(gòu)受到影響而發(fā)生變化。

表7 各樣品的峰值溫度和熱焓值Table 7 Peak temperature and enthalpy of each sample

4 結(jié)論

本試驗(yàn)選用沙蒿膠對(duì)分離乳清蛋白進(jìn)行糖基化改性，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分離乳清蛋白改性工藝，得到最佳工藝參數(shù)為：時(shí)間118 min，溫度90 ℃，反應(yīng)初始pH 12，在該條件下WPI-ASG 的乳化活性為0.732，乳化穩(wěn)定性為244.028，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝所得參數(shù)可靠，具備實(shí)用價(jià)值。

用優(yōu)化的工藝參數(shù)制備糖基化產(chǎn)物WPIASG，比較WPI、ASG 和WPI-ASG 的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)，結(jié)果顯示：其微觀結(jié)構(gòu)差異顯著，粒徑分布相似，相比單一蛋白，賴(lài)氨酸和精氨酸含量下降，熒光強(qiáng)度降低；FTIR-ART 光譜圖顯示，對(duì)應(yīng)吸收峰有明顯的減弱或增強(qiáng)，由SDS-PAGE 圖譜顯示蛋白質(zhì)與多糖發(fā)生了反應(yīng)，WPI-ASG 泳道強(qiáng)度下降且上面部分沒(méi)有相應(yīng)條帶聚集，并形成蛋白質(zhì)-多糖共聚物；由DSC 測(cè)得改性后的分離乳清蛋白峰值溫度和熱焓值均高于單一蛋白而低于沙蒿膠。結(jié)果表明，分離乳清蛋白與沙蒿多糖發(fā)生了接枝反應(yīng)，明確了蛋白結(jié)構(gòu)變化和特性改善之間的關(guān)系。