辣木異硫氰酸酯改善C2C12肌管細胞胰島素抵抗

毛家英，白玉英，彭麟杰，解 靜，田 洋

（1 云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 昆明 650201 2 云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室 昆明 650201 3 食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程中心 昆明 650201）

2 型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）是一種嚴重威脅人類健康的非傳染性慢性疾病，是臨床上最為常見的糖尿病類型，占所有糖尿病患者的90%～95%。T2DM 的主要特征為持續(xù)高血糖，可造成腎、足、眼和神經(jīng)等多組織臟器損害，并引發(fā)多種并發(fā)癥[1]。世界衛(wèi)生組織最新公布的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者的人數(shù)預(yù)計到2025年將達到3.7 億，并且有夸大化和年輕化的趨勢。 糖尿病已成為影響人體健康的關(guān)鍵因素，如何醫(yī)治糖尿病是人類共同面臨的問題與挑戰(zhàn)[2]。

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是T2DM的主要發(fā)病原因之一，它是胰島素靶器官或組織對正常水平的胰島素敏感性和反應(yīng)性不足的一種病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為外周組織，如脂肪、骨骼肌、肝臟組織等對葡萄糖的攝取和利用效率降低[3]。研究表明，胰島素抵抗貫穿于糖尿病發(fā)生、 發(fā)展過程，是造成各種慢性并發(fā)癥的重要病理基礎(chǔ)。如何對其進行有效調(diào)節(jié)是治療糖尿病的重要靶點之一。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是導致IR 的關(guān)鍵因素，已知在發(fā)生IR 的大鼠中，肝臟超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和總谷胱甘肽（Glutathione peroxidase，GSH）均顯著降低，而代謝產(chǎn)物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）蓄積[4]。

辣木（Moringa oleifera Lam.）為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，在我國的熱帶和亞熱帶地區(qū)，如云南、福建、廣東等地被廣泛種植[5]。 辣木營養(yǎng)價值豐富，且具有較高的藥用價值，其各部位如葉、根、種子、樹皮、果實、鮮花和未成熟的豆莢等都能入藥，具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保肝護腎、抗菌和抗病毒等功能[6]。

異硫氰酸酯是一類含有R-N=C=S 結(jié)構(gòu)的化合物，具有殺菌[7]、抗氧化[8]、抗癌[9]及降血糖和降血脂[10]等生物活性。 最新研究表明，辣木葉和辣木籽中富含異硫氰酸酯[11]，具有與其它十字花科蔬菜中的異硫氰酸酯化合物相同的藥效團 （R-N=C=S），然而，由于辣木異硫氰酸酯存在芳香環(huán)和鼠李糖部分，其在化學結(jié)構(gòu)上與其它異硫氰酸酯化合物有一定區(qū)別[12]。辣木異硫氰酸酯（MIC-1）是辣木中含量最高的一種異硫氰酸酯，已有研究證明其具有體外抗炎和抗氧化活性[13]。 此外，大量證據(jù)顯示MIC-1 可能是辣木調(diào)控糖脂代謝的主要活性物質(zhì)[14-15]。 本研究以MIC-1 為試驗材料，研究其對棕櫚酸（Palmitic acid，PA）誘導的C2C12 肌管細胞胰島素抵抗的改善作用，明確MIC-1 調(diào)控糖代謝的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C2C12 成肌細胞從中國科學院昆明動物研究所獲得。 辣木籽，云南天佑科技開發(fā)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、無酚紅DMEM 培養(yǎng)基，Hyclone 公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、馬血清（Horse serum，HS），BI 公司；青霉素-鏈霉素、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl （pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、BCA 蛋白測定試劑盒，碧云天公司；牛胰島素（Insulin，INS），江蘇萬邦生物醫(yī)藥股份有限公司；胰酶-EDTA 消化液、細胞裂解液、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、棕櫚酸（PA）、 噻唑藍 （MTT）、 一氧化氮 （Nitric oxide，NO）、微量丙二醛（MDA），solarbio 公司；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒、糖原測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所； 丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（Phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）、蛋白激酶B （Protein kinase B，AKT）、 磷酸化AKT（p-AKT）（Ser407） 和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glucose transporter 4，GLUT4）、β-Tubulin 抗體，萬類生物科技有限公司；二抗HRp Rabbit Anti-Goat lgG、HRp Mouse Anti-Goat lgG，ABclonal 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司； 二氧化碳培養(yǎng)箱，蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司；細胞計數(shù)儀，Invitrogen 有限公司；倒置熒光顯微鏡，蔡康光學有限公司；恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司；電子分析天平FA2004，沈陽龍騰電子有限公司； 紫外分光光度計，日本Shimodzu公司；4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱，海爾公司；Z36HK 型高速臺式冷凍離心機，德國Hermle Labortechnik GmbH 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MIC-1 的制備 辣木籽粉碎后用石油醚去油，以料液比（g/mL）1 ∶60，溫度30 ℃，pH 5，時間9 h 的提取條件獲得酶解提取液，采用萃取、減壓濃縮及重結(jié)晶獲取純凈晶體，備用，純度達98%[16]。

1.3.2 C2C12 細胞培養(yǎng)、 傳代與分化生長 細胞傳代：C2C12 成肌細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，至80%～90%時進行胰酶消化，終止消化后加生長培養(yǎng)基懸浮細胞，接種傳代。

細胞分化： 細胞貼壁生長至80%左右，換為2%HS DMEM 分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，隔天換液，C2C12 成肌細胞90%分化為肌管細胞后進行后續(xù)試驗[17]。

1.3.3 C2C12-IR 模型建立 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以1×104個細胞/孔的密度置于96 孔板中。 待細胞分化為肌管細胞后，立即加入2%FBS 無酚紅DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每組8 個平行。 然后用含不同濃度PA（0.25，0.5，0.75 mmol/L）及含100 nmol/L INS 的2%FBS 無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h[18]，取上清培養(yǎng)液，采用葡萄糖氧化酶法測定試劑盒檢測葡萄糖含量，以空白孔葡萄糖含量減去樣品孔葡萄糖含量，計算出各孔葡萄糖消耗量，確定最佳造模濃度。

1.3.4 C2C12-IR 細胞存活率檢測 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以1×104個/孔的密度接板96 孔板，待細胞分化為肌管細胞后，換含2%FBS的無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。然后用含不同濃 度 MIC -1 （0，0.5，1，2，4，8，16 μmol/L），100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞16 h。 棄上清，每孔加入100 μL 的0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，在492 nm 波長處測定吸光值，計算細胞存活率。

1.3.5 C2C12-IR 細胞葡萄糖消耗量檢測 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以1×104個/孔的密度接板96 孔板，待細胞分化為肌管細胞后，換含2%FBS 的無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，按上述方法給藥處理細胞16 h，取上清，采用葡萄糖氧化酶法測定試劑盒，檢測細胞上清葡萄糖含量，并計算得到葡萄糖消耗量。

1.3.6 C2C12-IR 細胞糖原含量檢測 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以5×105個/皿的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿，待細胞分化為肌管細胞后，換含2%FBS 的無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后用含不同濃度MIC-1 （0，2，4，8 μmol/L）、100 nmol/L INS 和0.5 mmol/L PA 的2%FBS無酚紅DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞16 h。每組設(shè)3 個重復，重復3 次。 給藥16 h 后，收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，細胞勻漿后按BCA 法測定蛋白含量，并用硫酸蒽酮法測定各組細胞內(nèi)糖原含量，按照公式（1）計算肌糖原含量：

1.3.7 C2C12-IR 細胞MDA、NO 含量及GSH 活力檢測 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以5×105個/皿的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞分化為肌管細胞后，換含2%FBS 的無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，按1.3.6 節(jié)的給藥方式處理細胞，每組設(shè)3 個重復，重復3 次。 給藥16 h 后，收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，細胞勻漿后按BCA 法測定蛋白含量，MDA、NO 含量及GSH 活力的測定按照試劑盒說明書操作。

1.3.8 C2C12-IR 細胞PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白表達檢測 將對數(shù)生長期的C2C12 成肌細胞以5×105個/孔的密度接種于5 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞分化為肌管細胞后，換含2%FBS 的無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，按1.3.6 節(jié)的給藥方式處理細胞，每組設(shè)3 個重復，重復3 次。 給藥16 h 后，用預(yù)冷的PBS 漂洗細胞，每皿加入100 μL 蛋白質(zhì)裂解液，在冰上裂解30 min，將細胞刮下收集于1.5 mL 離心管中，12 000×g，4 ℃離心10 min，取蛋白質(zhì)上清液，BCA 試劑盒測樣品的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，4 ℃過夜孵育一抗，常溫孵育二抗1 h，顯色拍照，通過Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶，定量檢測蛋白質(zhì)表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用Graphpad prism、ImageJ 等軟件進行分析統(tǒng)計，各項指標均以“平均數(shù)±標準差”表示，組間比較采用單因素方差分析，* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 C2C12-IR 細胞模型的建立

為了明確C2C12-IR 模型的建立方法，用不同濃度的PA（0.25，0.5，0.75 mmol/L 和100 nmol/L INS 共同處理C2C12 肌管細胞16 h，并以葡萄糖消耗量為檢測指標。結(jié)果如圖1 所示，與對照組相比，INS 組葡萄糖消耗量顯著增加 （P<0.01）；與INS 組相比，不同劑量PA 組葡萄糖消耗量均顯著降低（P<0.001），且葡萄糖消耗量從INS 組的8.07 mmol/L 分別降低到4.75 mmol/L （P<0.001），2.87 mmol/L（P<0.001），3.82 mmol/L（P<0.001）。 結(jié)果表明，0.5 mmol/L 的PA 誘導的C2C12 細胞胰島素抵抗程度最強，因此選擇0.5 mmol/L 的PA 作用C2C12 肌管細胞16 h 作為最佳建模條件。

圖1 不同濃度PA 對C2C12 肌管細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PA on glucose consumption of C2C12 myotube cells

2.2 MIC-1 對C2C12-IR 細胞存活率的影響

為研究MIC-1 對C2C12-IR 細胞存活率的影響，用不同濃度的MIC-1（0，0.5，1，2，4，8，16 μmol/L）處理C2C12-IR 細胞16 h，然后采用MTT法檢測細胞存活率。結(jié)果如圖2 所示，與對照組相比，INS 增加了細胞的存活率； 與INS 組相比，PA顯著降低了細胞的存活率，然而與C2C12-IR 組相比，MIC-1 對C2C12-IR 細胞的存活率沒有影響，結(jié)果表明，MIC-1 對C2C12-IR 細胞沒有毒性。

圖2 不同濃度的MIC-1 對C2C12-IR 細胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of MIC-1 on the survival rate of C2C12-IR cells

2.3 MIC-1 對C2C12-IR 細胞葡萄糖消耗量的影響

為了明確MIC-1 是否具有改善胰島素抵抗的作用，用不同濃度的MIC-1（0，0.5，1，2，4，8，16 mol/L）處理C2C12-IR 細胞16 h，采用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖消耗量。結(jié)果如圖3 所示，與對照組相比，INS 顯著增加肌管細胞葡萄糖消耗量（P<0.001）； 與INS 組相比，C2C12-IR 組葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.001）；然而與C2C12-IR 組相比，MIC-1 呈劑量依賴的方式顯著增加C2C12-IR 細胞葡萄糖消耗量，且葡萄糖消耗量從C2C12-IR組的4.48 mmol/L 分別增加到6.33 mmol/L（P<0.001），6.47 mmol/L （P<0.001），7.05 mmol/L（P<0.001），9.43 mmol/L（P<0.001）。 以上結(jié)果表明MIC-1 具有改善IR 的作用。

圖3 MIC-1 對C2C12-IR 細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.3 Effect of MIC-1 on glucose consumption in C2C12-IR cells

2.4 MIC-1 對C2C12-IR 細胞肝糖原含量的影響

為了明確MIC-1 是否能促進C2C12-IR 細胞對糖的儲存能力，通過對C2C12-IR 細胞糖原含量的測定來確定糖原的合成情況。如圖4 所示，與對照組相比，INS 顯著增加了肌管細胞糖原含量（P<0.001）；與INS 組相比，C2C12-IR 組肝糖原含量顯著降低（P<0.01）；然而，用不同濃度的MIC-1（2，4，8 μmol/L） 處 理C2C12-IR 細 胞16 h 后，C2C12-IR 細胞糖原含量顯著增加，且具有明顯的劑量依賴性，糖原含量從C2C12-IR 組的0.089 mg/mg pro 分別增加到0.094 mg/mg pro（P<0.05），0.109 mg/mg pro（P<0.001），0.14 mg/mg pro（P<0.001）。 結(jié)果表明，MIC-1 可通過促進糖原合成提高C2C12-IR 細胞對葡萄糖的攝取利用。

圖4 MIC-1 對C2C12-IR 細胞糖原含量的影響Fig.4 Effect of MIC-1 on C2C12-IR cells glycogen content

2.5 MIC-1 對C2C12-IR 細胞氧化應(yīng)激的影響

如圖5 所示，與對照組相比，INS 對C2C12 肌管細胞MDA 水平、NO 水平和GSH 活力沒有影響。 與INS 組相比，C2C12-IR 組MDA 水平（P<0.01）和NO 水平（P<0.05）顯著升高，GSH 活力（P<0.05）顯著下降，表明C2C12-IR 細胞氧化應(yīng)激增強。 然而與C2C12-IR 組相比，MIC-1 以濃度依賴的方式顯著降低了細胞MDA 和NO 水平，且當MIC-1 劑量為8 μmol/L 時，C2C12-IR 細胞的MDA 水平從2.13 nmol/mg pro 降低到0.63 nmol/mg pro （P<0.01），NO 水平從1.08 μmol/L 降低到0.19 μmol/L （P<0.05），GSH 活力從0.14 μmol/mg pro 增加到0.24 μmol/mg pro（P<0.05）。 結(jié)果表明MIC-1 能改善IR 的氧化損傷。

圖5 MIC-1 對C2C12-IR 細胞氧化應(yīng)激的影響Fig.5 Effect of MIC-1 on oxidative stress of C2C12-IR cells

2.6 MIC-1 對C2C12-IR 細胞PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

如圖6 所示，與INS 組相比，C2C12-IR 組PDK1（P<0.05）、p-AKT（P<0.001）和GLUT4（P<0.05）蛋白表達水平顯著降低；然而與C2C12-IR組相比，MIC-1 劑量為8 μmol/L 時，顯著增加了PDK1（P<0.05）、p-AKT（P<0.05）和GLUT4（P<0.05）的蛋白表達水平，結(jié)果表明MIC-1 對IR 的改善可能與細胞中AKT 蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)有關(guān)，并且MIC-1 通過促進GLUT4 的表達提高細胞對葡萄糖的利用，從而降低血糖。

圖6 MIC-1 對C2C12-IR 細胞PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.6 Effects of MIC-1 on the expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins in C2C12-IR cells

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)辣木各部位的提取物顯示出不同的降血糖作用。 汪芳等[19]發(fā)現(xiàn)辣木葉多糖具有降血糖活性，能顯著增加HepG2 細胞葡萄糖的消耗量。 吉莉莉[20]發(fā)現(xiàn)辣木葉總黃酮中的異懈皮苷具有降低糖尿病大鼠血糖，抑制胰島素抵抗，改善胰島功能的作用。Ndong 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠食用辣木葉粉末后，血糖明顯降低，表明辣木葉可以改善葡萄糖耐量。同時研究證明，辣木籽粉及其提取物有一定的降血糖功效，在糖尿病的預(yù)防和治療方面具有巨大研究潛力[22-23]。然而大量的辣木降糖研究均以粗提物為原材料，辣木降血糖的活性成分仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)富含異硫氰酸酯的辣木籽提取物通過調(diào)節(jié)機體iNOS 和NQO1 等基因表達，從而發(fā)揮減輕體重，減少肥胖，改善葡萄糖耐量，減少炎癥基因表達和增加抗氧化基因表達的作用[24]。 從新鮮辣木葉制得的富含異硫氰酸鹽的辣木濃縮物（含1%～3%異硫氰酸酯）可顯著降低肝脂肪、糖異生、胰島素、膽固醇和炎癥標志物的水平[25]。 因此，本研究對于辣木異硫氰酸酯是否有降糖作用提出了設(shè)想。 以實驗室提取的高純度MIC-1 為試驗材料，通過建立C2C12-IR 細胞模型，明確MIC-1 抑制氧化應(yīng)激改善胰島素抵抗的作用，并且其作用機制可能與PI3K/AKT 信號通路有關(guān)。

T2DM 是一種與高血糖相關(guān)的復雜的代謝紊亂相關(guān)性疾病，高血糖會導致線粒體產(chǎn)生大量活性氧、活性氮，在氧化系統(tǒng)中，主要包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH-）、過氧化氫（H2O2）、一氧化氮（NO-）、過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）等，進而在不同程度對線粒體功能造成損傷，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。 氧化應(yīng)激狀態(tài)的顯著性特征為氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）水平的升高，ROS化學性質(zhì)活潑，不易被檢測，MDA 是ROS 發(fā)生過氧化反應(yīng)生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平的高低可以直接反映機體受ROS 攻擊的程度強弱以及氧化水平的高低[27]。 在眾多的氧化應(yīng)激指標中，MDA 含量可以直接反映機體脂質(zhì)過氧化速率和強度，GSH 與SOD 可以顯示機體的抗氧化強度，均是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的經(jīng)典指標，因此常用于評價機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[28]。 在本研究中，MIC-1 能降低氧化物MDA、NO 的含量，同時提高GSH 的活力，結(jié)果表明MIC-1 能改善IR 的氧化損傷。

IR 是2 型糖尿病的主要特征，大多數(shù)IR 發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中[29]，骨骼肌是負責葡萄糖代謝的主要外周組織。因此，促進肌細胞葡萄糖消耗成為研究降糖的重要指標。 肌糖原是機體中糖原的一種儲存形式，一定程度反映了機體內(nèi)血糖的平衡情況。 本研究以C2C12 肌管細胞構(gòu)建胰島素抵抗模型探究MIC-1 改善胰島素抵抗的作用，從而探究MIC-1 的降糖作用。 研究發(fā)現(xiàn)MIC-1 以劑量依賴性方式增加C2C12-IR 細胞的葡萄糖消耗量。 并且MIC-1 處理C2C12-IR 細胞后發(fā)現(xiàn)細胞糖原含量增加，反映了MIC-1 促進C2C12-IR 細胞糖的儲存能力。 綜上可知，MIC-1能通過促進C2C12-IR 細胞葡萄糖消耗量以及糖原的合成，發(fā)揮降血糖作用，并降低氧化應(yīng)激，改善胰島素抵抗。

在IR 狀態(tài)下，骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用存在障礙，其分子機制主要是PI3K 信號通路活性的下降，表現(xiàn)為PI3K 活性及AKT 磷酸化水平明顯下降。PDK1 和AKT 是PI3K 下游的信號分子[30]。PDK1 被激活后可進一步使AKT 被激活，磷酸化的AKT 將GLUT4 轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)膜上，從而促進葡萄糖吸收[31]。 在本研究中MIC-1 顯著升高了PDK1、p-AKT 和GLUT4 的蛋白表達，刺激PI3K/AKT 通路的信號轉(zhuǎn)導，增強了細胞周圍的葡萄糖轉(zhuǎn)運水平。

綜上所述，PA 誘導的IR 中，MIC-1 會緩解氧化應(yīng)激造成的細胞損傷，通過激活PI3K/AKT 信號通路，增加GLUT4 的表達，進而促進細胞對葡萄糖的攝取，從而改善IR。 研究結(jié)果可為MIC-1調(diào)控糖代謝作用的深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為辣木資源的深加工奠定科學依據(jù)。