頻復發(fā)腎病綜合征患兒外周血記憶B細胞亞群分布變化

袁文君 程巾 劉春梅 劉君晗 石夢月 陸書文 關(guān)鳳軍

（徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州 221000）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童常見的腎小球疾病之一，微小病變型是其最常見的病理類型。初發(fā)微小病變型PNS患兒主要應用糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）治療，70%～90%的患兒對GC敏感，但其中約50%患兒表現(xiàn)為頻復發(fā)腎病綜合 征 （frequently relapsing nephrotic syndrome，F(xiàn)RNS）［1］。頻繁復發(fā)會對PNS患兒長期預后產(chǎn)生不良影響，但其發(fā)生機制仍不清楚。

B細胞清除劑利妥昔單抗（rituximab，RTX）治療可顯著降低FRNS患者的復發(fā)率，提示B細胞可能在FRNS患兒的疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［2］。但是，我們在臨床上觀察到，部分FRNS患兒經(jīng)RTX治療后，即便外周血B細胞數(shù)目已經(jīng)恢復正常，仍能保持長久無復發(fā)；而一些患兒即使外周血B細胞數(shù)量被清除至極低水平（<5%），仍不能獲得臨床緩解。因此，雖然臨床上常通過監(jiān)測總B細胞數(shù)目來確定進一步的治療，但其并不能作為真正反映PNS臨床疾病活動的有效指標。

與GC治療相似，部分FRNS患兒在RTX治療后，疾病仍會復發(fā)，其中伴隨記憶B細胞在RTX介導的B細胞耗竭期發(fā)生迅速重建［3-4］。前期我們課題組研究也發(fā)現(xiàn)，總記憶B細胞數(shù)量在FRNS患兒活動期顯著增高，與疾病活動相關(guān)［5］。以上證據(jù)提示，記憶B細胞可能在FRNS患兒疾病活動中發(fā)揮了重要作用，而監(jiān)測記憶B細胞亞群可能有助于預測PNS的復發(fā)，有助于指導再次用藥時間。然而，記憶B細胞和其不同亞群在GC治療PNS患兒前后的變化，以及其與FRNS患兒疾病復發(fā)的臨床相關(guān)性尚未見報道。

因此，在本研究中，我們應用流式細胞檢測技術(shù)，分析了FRNS患兒在GC治療前后外周血記憶B細胞亞群的分布變化，進一步探索記憶B細胞在預測PNS患兒GC治療后復發(fā)的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選擇2020年10月—2021年10月就診于徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科的初發(fā)PNS患兒35例，根據(jù)GC治療后的反應及復發(fā)頻次，分為FRNS組（20例）、非頻復發(fā)腎病綜合征（non-frequently relapsing nephrotic syndrome，NFRNS）組（15例）；另選擇同期15例健康體檢兒童為健康對照組。PNS診斷符合中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟學組發(fā)布的《兒童激素敏感、復發(fā)/依賴腎病綜合征診治指南（2016）》的標準［6］。排除標準：（1）有腎臟病家族史；（2）患有自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及惡性腫瘤等繼發(fā)性因素；（3）應用過免疫抑制劑；（4）GC耐藥者。FRNS組男15例，女5例，平均年齡（6.7±2.5）歲；NFRNS組男10例，女5例，平均年齡（7.2±2.0）歲；健康對照組男9例，女6例，平均年齡（6.9±2.6）歲；三組患兒的性別 （χ2=0.976，P=0.642）、 年 齡 （F=0.067，P=0.935）比較差異均無統(tǒng)計學意義。所有患兒家長均知情同意，本研究已獲徐州醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準（XYFY2022-KL136-01）。

1.2 治療及療效判定

PNS患兒確診后在誘導緩解階段給予潑尼松2 mg/(kg·d)，分3次口服；待尿蛋白轉(zhuǎn)陰后，每晨頓服，共4周；鞏固維持階段潑尼松2 mg/(kg·d)，隔日晨頓服，維持4周，逐漸減量，總療程12個月。完全緩解以實驗室檢查正常、臨床癥狀消失為標準。在患兒達到完全緩解后1周復查各項指標。

PNS復發(fā)的診斷標準：連續(xù)3 d，晨尿蛋白由陰性轉(zhuǎn)為（+++）~（++++），或晨尿的尿蛋白/肌酐 （mg/mg） ≥2.0，或24 h尿蛋白定量≥50 mg/kg。NFRNS：首次完全緩解后半年內(nèi)復發(fā)1次，或1年內(nèi)復發(fā)≤3次。FRNS：經(jīng)GC標準療程治療后緩解，但病程中半年內(nèi)復發(fā)≥2次，或1年內(nèi)復發(fā)≥4次［7］。

1.3 流式細胞術(shù)檢測記憶B細胞亞群

所有患兒入院第2天清晨采取靜脈血1 mL，取1根流式管，加入全血300 μL，磷酸鹽緩沖液2 mL，洗滌2次。依次向流式管內(nèi)加入BV510標記的抗人CD20單克隆抗體（302340）、BV650標記的抗人CD19單克隆抗體（563226）、PE標記的抗人CD27單克隆抗體（302842）、APC標記的抗人IgM抗體（314546）、Alexa Fluor 700標記的抗人IgD抗體（561302）、Percp?cy7抗人IgE抗體（325510）、BV421標記的抗人IgG抗體（5625581）；室溫避光孵育15 min。每管加入磷酸鹽緩沖液2 mL，2 500 r/min，離心2 min，洗滌1次。加入紅細胞裂解液2 mL，室溫避光裂紅8 min，上機檢測。上述單克隆抗體均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，LSRFortessaTM型流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司，采用流式細胞分析軟件FlowJo v10.8.1進行分析處理。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用IBM SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組治療前后比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法；不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［P50（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni法。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估兩變量間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GC治療前各組記憶B細胞亞群表達情況比較

FRNS組及NFRNS組總B細胞、總記憶B細胞、IgD+記憶B細胞、IgE+記憶B細胞比例均較健康對照組增高，且FRNS組較NFRNS組增高更為明顯（P<0.05）。FRNS組類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞較NFRNS組及健康對照組降低（P<0.05）。三組IgM+IgD+記憶B細胞、IgM+記憶B細胞、IgG+記憶B細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、表1。

表1 FRNS組、NFRNS組GC治療前與健康對照組記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

表1 FRNS組、NFRNS組GC治療前與健康對照組記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

注：a示與健康對照組比較，P<0.05；b示與NFRNS組比較，P<0.05。［NFRNS］非頻復發(fā)腎病綜合征；［FRNS］頻復發(fā)腎病綜合征。

images/BZ_72_273_449_1043_560.pngimages/BZ_72_1043_449_1334_560.pngimages/BZ_72_1334_449_1626_560.pngimages/BZ_72_1626_449_1917_560.pngimages/BZ_72_1917_449_2098_560.pngP值images/BZ_72_273_619_1043_678.pngimages/BZ_72_273_737_1043_796.pngimages/BZ_72_273_855_1043_915.pngimages/BZ_72_273_974_1043_1033.pngimages/BZ_72_1043_619_1334_678.pngimages/BZ_72_1043_737_1334_796.pngimages/BZ_72_1043_855_1334_915.pngimages/BZ_72_1043_974_1334_1033.pngimages/BZ_72_1334_619_1626_678.pngimages/BZ_72_1334_737_1626_796.pngimages/BZ_72_1334_855_1626_915.pngimages/BZ_72_1334_974_1626_1033.pngimages/BZ_72_1626_619_1917_678.pngimages/BZ_72_1626_737_1917_796.pngimages/BZ_72_1626_855_1917_915.pngimages/BZ_72_1626_974_1917_1033.pngimages/BZ_72_1917_619_2098_678.pngimages/BZ_72_1917_737_2098_796.pngimages/BZ_72_1917_855_2098_915.pngimages/BZ_72_1917_974_2098_1033.png總B細胞 (CD19+)IgD+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgD+IgM-)類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞 (CD19+CD27+IgM-IgD-)IgE+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgE+IgM-IgD-)4.97±2.50 12.59±4.96 68.44±6.84 7.09±2.59 9.40±3.04a 17.29±7.19a 63.45±8.39 12.71±7.74a 12.64±4.02a,b 23.47±10.20a,b 55.78±10.09a,b 18.88±8.08a,b 22.560 8.009 9.390 20.184<0.001<0.001 0.001 0.970 0.011 0.878<0.001 0.109

圖1 流式細胞術(shù)分析圖 A門為淋巴細胞，B門為總B細胞（CD19+），C門為總記憶B細胞（CD19+CD27+），Q1為IgD+記憶B細胞 （CD19+CD27+IgD+IgM-），Q2為 IgM+IgD+記憶 B細胞 （CD19+CD27+IgM+IgD+），Q3為IgM+記憶B細胞（CD19+CD27+IgM+IgD-），Q4為類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞（CD19+CD27+IgM-IgD-），D門為IgG+記憶B細胞（CD19+CD27+IgG+IgM-IgD-），E門為IgE+記憶B細胞（CD19+CD27+IgE+IgM-IgD-）。

2.2 GC治療后各組記憶B細胞亞群表達情況比較

FRNS組及NFRNS組總B細胞、總記憶B細胞、IgE+記憶B細胞、IgD+記憶B細胞、IgG+記憶B細胞比例較治療前降低（P<0.05），與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IgM+IgD+記憶B細胞、IgM+記憶B細胞較治療前降低，且低于健康對照組（P<0.05）。類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞較治療前增高，且高于健康對照組（P<0.05）。FRNS組與NFRNS組各B細胞亞群比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2~3。

表2 FRNS組、NFRNS組GC治療后與健康對照組記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

表2 FRNS組、NFRNS組GC治療后與健康對照組記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

注：a示與健康對照組比較，P<0.05。［NFRNS］非頻復發(fā)腎病綜合征；［FRNS］頻復發(fā)腎病綜合征。

images/BZ_72_273_1663_1050_1774.pngimages/BZ_72_273_1833_1050_1892.pngimages/BZ_72_273_1951_1050_2010.pngimages/BZ_72_273_2069_1050_2128.pngimages/BZ_72_273_2187_1050_2246.pngimages/BZ_72_1050_1663_1335_1774.pngimages/BZ_72_1050_1833_1335_1892.pngimages/BZ_72_1050_1951_1335_2010.pngimages/BZ_72_1050_2069_1335_2128.pngimages/BZ_72_1050_2187_1335_2246.pngimages/BZ_72_1335_1663_1619_1774.pngimages/BZ_72_1335_1833_1619_1892.pngimages/BZ_72_1335_1951_1619_2010.pngimages/BZ_72_1335_2069_1619_2128.pngimages/BZ_72_1335_2187_1619_2246.pngimages/BZ_72_1619_1663_1904_1774.pngimages/BZ_72_1619_1833_1904_1892.pngimages/BZ_72_1619_1951_1904_2010.pngimages/BZ_72_1619_2069_1904_2128.pngimages/BZ_72_1619_2187_1904_2246.pngimages/BZ_72_1904_1663_2091_1774.pngimages/BZ_72_1904_1833_2091_1892.pngimages/BZ_72_1904_1951_2091_2010.pngimages/BZ_72_1904_2069_2091_2128.pngimages/BZ_72_1904_2187_2091_2246.png總B細胞 (CD19+)IgD+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgM-IgD+)類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞 (CD19+CD27+IgM-IgD-)IgE+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgE+IgM-IgD-)4.97±2.50 12.59±4.96 68.44±6.84 7.09±2.59 4.83±1.45 11.15±2.77 84.80±2.82a 8.62±3.21 4.87±1.94 13.53±3.98 82.45±4.29a 9.03±1.88 0.021 1.514 50.916 2.623 P值0.980 0.124 0.231<0.001<0.001<0.001 0.083 0.064

表3 FRNS組、NFRNS組GC治療前后記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

表3 FRNS組、NFRNS組GC治療前后記憶B細胞亞群水平比較 （± s，%）

注：［NFRNS］非頻復發(fā)腎病綜合征；［FRNS］頻復發(fā)腎病綜合征。

images/BZ_72_273_2456_967_2574.pngimages/BZ_72_273_2633_967_2692.pngimages/BZ_72_273_2751_967_2810.pngimages/BZ_72_273_2869_967_2928.pngimages/BZ_72_273_2987_967_3046.pngimages/BZ_72_967_2456_1631_2515.pngimages/BZ_72_967_2515_1176_2574.pngimages/BZ_72_967_2633_1176_2692.pngimages/BZ_72_967_2751_1176_2810.pngimages/BZ_72_967_2869_1176_2928.pngimages/BZ_72_967_2987_1176_3046.pngimages/BZ_72_1176_2515_1370_2574.pngimages/BZ_72_1176_2633_1370_2692.pngimages/BZ_72_1176_2751_1370_2810.pngimages/BZ_72_1176_2869_1370_2928.pngimages/BZ_72_1176_2987_1370_3046.pngimages/BZ_72_1370_2515_1501_2574.pngimages/BZ_72_1370_2633_1501_2692.pngimages/BZ_72_1370_2751_1501_2810.pngimages/BZ_72_1370_2869_1501_2928.pngimages/BZ_72_1370_2987_1501_3046.pngimages/BZ_72_1501_2515_1631_2574.pngimages/BZ_72_1501_2633_1631_2692.pngimages/BZ_72_1501_2751_1631_2810.pngimages/BZ_72_1501_2869_1631_2928.pngimages/BZ_72_1501_2987_1631_3046.pngimages/BZ_72_1631_2515_1824_2574.pngimages/BZ_72_1631_2633_1824_2692.pngimages/BZ_72_1631_2751_1824_2810.pngimages/BZ_72_1631_2869_1824_2928.pngimages/BZ_72_1631_2987_1824_3046.pngimages/BZ_72_1824_2515_2018_2574.pngimages/BZ_72_1824_2633_2018_2692.pngimages/BZ_72_1824_2751_2018_2810.pngimages/BZ_72_1824_2869_2018_2928.pngimages/BZ_72_1824_2987_2018_3046.pngimages/BZ_72_2018_2515_2149_2574.pngimages/BZ_72_2018_2633_2149_2692.pngimages/BZ_72_2018_2751_2149_2810.pngimages/BZ_72_2018_2869_2149_2928.pngimages/BZ_72_2018_2987_2149_3046.png總B細胞 (CD19+)IgD+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgM-IgD+)類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞 (CD19+CD27+IgM-IgD-)IgE+記憶B細胞 (CD19+CD27+IgE+IgM-IgD-)12.64±4.02 23.47±10.20 55.78±10.09 18.88±8.08 4.87±1.94 13.53±3.98 82.45±4.29 9.03±1.88 12.184 5.998-14.903 6.863<0.001<0.001<0.001<0.001 NFRNS組 (n=15)9.40±3.04 17.29±7.19 63.45±8.39 12.71±7.74 4.83±1.45 11.15±2.77 84.80±2.82 8.62±3.21 7.321 5.041-12.747 3.013 P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.009<0.001

2.3 三組患兒治療前臨床指標的比較及相關(guān)性分析

FRNS組尿蛋白定量高于NFRNS組及健康對照組（P<0.05）。FRNS組白蛋白水平低于健康對照組（P<0.05），與NFRNS組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。三組肌酐及尿素水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 三組患兒GC治療前臨床指標水平比較

類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞比例與尿蛋白定量呈負相關(guān)（r=-0.512，P=0.021），IgE+記憶B細胞比例與尿蛋白定量呈正相關(guān)（r=0.571，P=0.009），見圖2?？侭細胞、總記憶B細胞、IgD+記憶B細胞、IgM+IgD+記憶B細胞、IgM+記憶B細胞、IgG+記憶B細胞比例與尿蛋白定量無相關(guān)性（分別r=0.209、0.172、0.126、0.101、0.250、0.244，P>0.05）。

圖2 類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞、IgE+記憶B細胞與尿蛋白定量的相關(guān)性分析

3 討論

隨著B細胞耗竭療法在PNS中的成功應用，B細胞在其發(fā)病機制中的作用逐漸被認識。而記憶B細胞在B細胞耗竭期的重建，與PNS復發(fā)顯著相關(guān)。記憶B細胞與初始B細胞相比，更易活化，一旦再次遭遇同一特異性抗原，迅速活化、增殖，產(chǎn)生高親和力特異性抗體［8］。記憶B細胞常通過腫瘤壞死因子超家族成員CD27的表達來鑒定，主要包括3種類別轉(zhuǎn)換前記憶B細胞（IgM+IgD+、IgM+IgD-和IgD+IgM-）和類別轉(zhuǎn)換的IgM-IgD-表型（IgG、IgA或IgE）［9］。已證實在不同疾病中，記憶B細胞的比例與疾病活動程度和治療反應相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患兒外周血類別轉(zhuǎn)換前記憶B細胞顯著增高，且與尿蛋白水平呈正相關(guān)［10］；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患兒外周血中類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞比例的增加，與患兒對免疫抑制劑的治療不敏感有關(guān)［11］。在心臟移植、造血干細胞移植及血液透析患者中，類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞比例減少顯著增加感染概率［12-14］。類別轉(zhuǎn)換前記憶B細胞以T細胞非依賴抗原的方式，分泌IgM抗體，而類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞以T細胞依賴方式，在T細胞的輔助下分泌高親和力IgG抗體［15］。

本研究顯示，F(xiàn)RNS組患兒初次發(fā)病總B細胞、記憶B細胞比例顯著高于NFRNS組及健康對照組，提示FRNS患兒體內(nèi)存在B細胞、記憶B細胞的異常活化，與Colucci等［16］、Ling等［17］研究一致；我們進一步分析了記憶B細胞功能亞型，發(fā)現(xiàn)FRNS組患兒在初發(fā)時，類別轉(zhuǎn)換前IgD+記憶B細胞比例增加，類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞比例降低，這與劉光磊等［18］研究結(jié)果一致。而研究發(fā)現(xiàn)，PNS患兒在初發(fā)期記憶B細胞增高，以類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞增高為主，應用RTX后，類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞的恢復可以預測疾病復發(fā)［3-4］。分析有以下兩個原因：一方面該研究是在患兒應用RTX后，檢測其外周血淋巴細胞亞群情況，而免疫抑制劑的應用可能會影響其原有記憶B細胞分布情況；另一方面我們將類別轉(zhuǎn)換前IgM+記憶B亞型細分為IgM+IgD+、IgM+IgD-和IgD+IgM-3個亞型，而先前的研究并未細分此亞群。Geisberger等［19］研究顯示，IgD+記憶B細胞在遇到抗原刺激時能夠通過調(diào)節(jié)B細胞信號強度，提高陰性選擇的閾值。綜上，推測患兒類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞的減少，可能與IgD+記憶B細胞提高了記憶B細胞的陰性選擇，使其向IgM-IgD-轉(zhuǎn)換降低有關(guān)。類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞能夠提高機體對異種抗原的清除能力，降低機體感染風險。而感染是PNS患兒復發(fā)的常見原因之一，因此我們推測FRNS患兒頻復發(fā)可能與其外周血類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞減少，潛在感染風險增加有關(guān)。

在類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞的基礎(chǔ)上，我們進一步將類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞分為IgE+和IgG+記憶B細胞亞群，發(fā)現(xiàn)FRNS組患兒初發(fā)時，IgE+記憶B細胞比例顯著高于NFRNS組及健康對照組，且IgE+記憶B細胞與尿蛋白定量呈正相關(guān)。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，50%~70%的PNS患兒外周血總IgE升高，并出現(xiàn)多種特應性疾病的表型，而接觸過敏原也常常與復發(fā)相關(guān)［20］。過敏性疾病與PNS之間存在共同的發(fā)病機制［21］。在調(diào)節(jié)IgE合成、促進B細胞增殖分化中，表達于活化的B淋巴細胞的跨膜糖蛋白CD23發(fā)揮了重要作用，它易被蛋白水解酶裂解為可溶性CD23［22］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FRNS患兒在疾病活動期可溶性CD23顯著升高［23］，因此，我們推測患兒IgE+記憶B細胞的增高，可能與患兒體內(nèi)存在B細胞的異?；罨翱扇苄訡D23異常高表達有關(guān)。

為進一步了解緩解期兩組患兒記憶B細胞亞群是否存在差異，我們分析了GC治療后兩組記憶B細胞的分布情況。兩組IgM+IgD+記憶B細胞、IgM+記憶B細胞較治療前降低，均低于健康對照組；類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞高于健康對照組。提示即使是在緩解期，PNS患兒的部分記憶B細胞亞群也未能恢復至正常水平，這與PNS疾病活動可能密切相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)RNS患兒存在記憶B細胞亞群的分布異常；IgE+記憶B細胞和類別轉(zhuǎn)換記憶B細胞比例可作為FRNS患兒在GC干預后復發(fā)的正相關(guān)和負相關(guān)因素。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。