采用全基因組測(cè)序技術(shù)快速診斷危重癥新生兒的臨床實(shí)踐

肖非凡 盧宇藍(lán) 吳冰冰 董欣然 程國(guó)強(qiáng) 胡黎園 周文浩, 彭小敏 楊琳 王慧君

（國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心/復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 1.分子醫(yī)學(xué)中心；2.新生兒科，上海 201102）

兒童是遺傳性疾病的高發(fā)人群［1-2］，遺傳因素是導(dǎo)致危重癥新生兒早期死亡的重要原因［3］。但是，遺傳性疾病在生命早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，臨床診斷困難。因此，早期明確是否存在遺傳性病因，對(duì)危重癥新生兒的治療及預(yù)后至關(guān)重要［4］。目前，快速基因檢測(cè)技術(shù)已在危重癥新生兒疾病診斷方面具有良好的應(yīng)用［5］。全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）可檢測(cè)整個(gè)基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列，是檢測(cè)范圍最廣的技術(shù)，可為遺傳性疾病的診斷提供更為全面的線索［6-7］。本文旨在通過(guò)臨床的應(yīng)用研究，探索WGS在臨床快速診斷危重癥新生兒中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性研究，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019-066），并獲得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。以2019年8—9月間在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院進(jìn)行WGS檢測(cè)的危重癥患兒為研究對(duì)象，分析患兒臨床特征、基因檢測(cè)結(jié)果、結(jié)局轉(zhuǎn)歸。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（neonatal intensive care unit，NICU）中懷疑為遺傳因素致病的危重癥新生兒（日齡≤28 d），出現(xiàn)肌力或肌張力異常、先天結(jié)構(gòu)畸形、反復(fù)感染、血或尿串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝指標(biāo)異常等；（2）進(jìn)行了一家三口（患兒和其父母）的WGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒已經(jīng)獲得產(chǎn)前基因診斷；（2）無(wú)法取得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 WGS的檢測(cè)方法

抽取患兒及其父母外周靜脈血各2 mL，采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）抽提基因組DNA。通過(guò)Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。患兒樣本測(cè)序深度為40×~50×，測(cè)序數(shù)據(jù)量為120 Gb；患兒父母樣本的測(cè)序深度為8×~10×，測(cè)序數(shù)據(jù)量為30 Gb。應(yīng)用Illumina公司的Dynamic Read Analysis for GENomics Bio-IT（DRAGEN）平臺(tái)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行超快速分析。依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行評(píng)級(jí)［8］。上述流程中，DNA提取和建庫(kù)用時(shí)約12 h，基因組測(cè)序約42 h，測(cè)序數(shù)據(jù)處理及變異檢測(cè)約19 h，測(cè)序數(shù)據(jù)解讀約1 h。

1.3 臨床資料收集

收集患兒性別、入院年齡、孕產(chǎn)次、出生體重、孕周、出生方式、入院主訴、主要癥狀等資料。通過(guò)門(mén)診或電話隨訪患兒預(yù)后情況。

1.4 WGS的數(shù)據(jù)分析流程

針對(duì)危重癥家系的WGS，采用快速反應(yīng)流程，優(yōu)化了從血樣和臨床信息采集到向臨床醫(yī)生報(bào)告候選致病變異的數(shù)據(jù)分析流程［9］。

全部流程包括：測(cè)序?qū)嶒?yàn)；原始數(shù)據(jù)快速生成；序列生成、變異格式轉(zhuǎn)化和篩選；臨床信息處理；候選變異解讀。其中，測(cè)序?qū)嶒?yàn)包括血液樣本編號(hào)和家系關(guān)系登記、DNA質(zhì)控、測(cè)序上機(jī)、FastQ產(chǎn)出與質(zhì)控。測(cè)序數(shù)據(jù)分析過(guò)程包括使用DRAGEN進(jìn)行數(shù)據(jù)生成、快速變異檢測(cè)、再次質(zhì)控，校驗(yàn)性染色體，變異注釋篩選，校驗(yàn)家系關(guān)系以輔助遺傳模式分析。臨床信息處理包括病史標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)化處理和基于臨床表型的候選基因分析。病史標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)化處理包括基本的自然語(yǔ)言處理和現(xiàn)有的國(guó)際疾病分類(lèi)（第10版）轉(zhuǎn)化等，以將原始病歷轉(zhuǎn)化為人類(lèi)表型術(shù)語(yǔ)（Human Phenotype Ontology）。臨床表型分析以基于表型的候選基因優(yōu)選為目標(biāo)，主要采用PhenoPro算法，根據(jù)綜合的標(biāo)準(zhǔn)化人類(lèi)表型術(shù)語(yǔ)對(duì)可能的致病基因進(jìn)行排序。最后，遺傳診斷團(tuán)隊(duì)基于篩選的變異和患兒的表型，對(duì)變異的致病性進(jìn)行綜合評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及臨床特征

共納入15例患兒，入院年齡為2 h至28 d，中位年齡為5 d，其中男9例 （60%），女6例（40%）；早產(chǎn)兒8例（53%），足月兒7例（47%）；剖宮產(chǎn)9例（60%），順產(chǎn)6例（40%）。主要入院原因?yàn)楹粑惓?例（47%），反應(yīng)差、喂養(yǎng)困難各2例（13%），發(fā)熱、低體溫、早產(chǎn)、抽搐各1例（7%）。詳細(xì)臨床特征見(jiàn)表1。

表1 15例患兒的基本臨床特征、基因檢測(cè)結(jié)果及臨床轉(zhuǎn)歸

2.2 WGS檢測(cè)結(jié)果分析

WGS平均檢測(cè)周期為4.5 d，最短為72 h。3例患兒（患兒7、9、11）經(jīng)WGS檢測(cè)后獲得基因診斷，診斷陽(yáng)性率為20%（3/15）。

患兒7因早產(chǎn)生后氣促呻吟入院，臨床表型為肥厚型梗阻性心肌病、室間隔缺損、肺動(dòng)脈高壓，WGS檢測(cè)到PTPN11基因存在錯(cuò)義變異c.1528C>G(p.Q510E)。PTPN11基因是常染色體顯性遺傳的Noonan綜合征的致病基因。截至2022年12月，ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）已有20余篇文獻(xiàn)與該變異有關(guān)，并將其評(píng)為致病變異。本例患兒父母均未攜帶該變異，分析為新發(fā)變異，其心臟表現(xiàn)是典型的Noonan綜合征心臟表型，結(jié)合臨床與變異位點(diǎn)分析，該患兒診斷為Noonan綜合征。患兒入院后反復(fù)出現(xiàn)經(jīng)皮血氧飽和度波動(dòng)，后因呼吸困難明顯、血氧飽和度持續(xù)降低予以氣管插管，氣管插管加壓下可維持血氧飽和度?；純杭覍倩诨純翰∏榧凹彝ソ?jīng)濟(jì)情況，選擇放棄治療，拔管后患兒死亡。分析文獻(xiàn)顯示，該位點(diǎn)的多個(gè)病例均在數(shù)月內(nèi)因嚴(yán)重心臟問(wèn)題夭折［10-11］。

患兒9因生后2 d喂養(yǎng)困難入院，臨床表現(xiàn)為皮-羅綜合征，WGS檢測(cè)到COL11A1基因存在剪接變異c.2295+1G>A，該變異位點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道，經(jīng)Sanger驗(yàn)證，確認(rèn)遺傳自父親（父親自述表型正常，但未來(lái)院進(jìn)行相關(guān)檢查）。COL11A1基因變異可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳病Stickler綜合征II型。本例患兒下頜短小、舌根后墜、腭裂、隱匿性陰莖，符合該綜合征表型。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)評(píng)級(jí)依據(jù)［8］，該變異評(píng)為可疑致病變異（PVS1+PM2_S），該患兒診斷為Stickler綜合征。本例患兒因舌根后墜及下頜短小導(dǎo)致呼吸困難，血氧飽和度不能維持。外科會(huì)診后建議手術(shù)，家屬拒絕并出院。最終患兒死亡。結(jié)合患兒病史及基因檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)該基因變異導(dǎo)致的畸形引起呼吸功能障礙是患兒的直接死亡原因。

患兒11因陣發(fā)性發(fā)紺半天入院，主要表型為中樞性呼吸衰竭，WGS檢測(cè)到PHOX2B基因存在新發(fā)插入變異c.756_776dup(p.Ala254_Ala260dup)。PHOX2B基因是先天性中樞性低通氣綜合征的致病基因，呈常染色體顯性遺傳。ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)記錄有7篇文獻(xiàn)報(bào)道該變異，評(píng)級(jí)為致病變異。既往文獻(xiàn)［12］報(bào)道該病患兒需有創(chuàng)機(jī)械通氣支持。本例患兒臨床表現(xiàn)為中樞性呼吸衰竭，住院期間需呼吸機(jī)輔助呼吸，基因檢測(cè)結(jié)果回報(bào)前，患兒家屬已要求放棄治療，后患兒死亡。

此外，在患兒8的CHD7基因編碼區(qū)38號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)臨床意義未明變異：c.8639C>T(p.Q510E)，變異位點(diǎn)遺傳自母親。

2.3 臨床結(jié)局及轉(zhuǎn)歸

3例基因診斷陽(yáng)性的患兒（患兒7、9、11）均死亡。攜帶臨床意義未明變異的患兒8，因胎糞性腹膜炎行剖腹探查術(shù)，術(shù)中見(jiàn)全腸全壞死，患兒父母決定放棄治療后患兒死亡。11例基因檢測(cè)結(jié)果為陰性的患兒中，5例病情好轉(zhuǎn)；3例患兒需呼吸機(jī)輔助通氣，家屬考慮患兒預(yù)后不良，放棄治療；3例患兒隨訪結(jié)局死亡。

3 討論

我們前期的數(shù)據(jù)顯示，約20%（44/223）的NICU死亡患兒存在遺傳致病因素［13］。早期基因診斷可協(xié)助臨床醫(yī)生改善危重癥新生兒的管理策略。一些傳統(tǒng)的遺傳檢測(cè)方法，如核型分析和基因芯片技術(shù)，難以檢測(cè)單基因位點(diǎn)的變異。目前，國(guó)內(nèi)已有多項(xiàng)研究［14-16］證實(shí)基因包測(cè)序和/或全外顯子組測(cè)序技術(shù)具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，這些測(cè)序技術(shù)并不能全面覆蓋整個(gè)基因組的變異情況。近年來(lái)，一些團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試將WGS用于危重癥患兒的快速遺傳性病因檢測(cè)。一項(xiàng)納入11篇文獻(xiàn)的薈萃分析［5］結(jié)果表明，快速WGS技術(shù)在危重癥嬰兒中的綜合診斷率為37%，說(shuō)明快速WGS在危重癥患兒的遺傳性病因檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

本研究檢測(cè)15例患兒，其中3例獲得基因診斷，診斷陽(yáng)性率為20%，與國(guó)外的WGS診斷陽(yáng)性率接近［17］。結(jié)合國(guó)內(nèi)臨床實(shí)際應(yīng)用情況，本研究采用高性?xún)r(jià)比的測(cè)序方案，即對(duì)患兒樣本使用測(cè)序深度為40×~50×，父母樣本使用8×~10×的低覆蓋測(cè)序，在確保有效檢測(cè)效果的同時(shí)降低測(cè)序成本。常規(guī)高通量測(cè)序，因需要進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲建庫(kù)，需要耗時(shí)3周以上，本研究中WGS檢測(cè)，因不需要進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲，節(jié)省建庫(kù)時(shí)間，平均檢測(cè)周期僅為4.5 d，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間。WGS檢測(cè)數(shù)據(jù)量龐大，數(shù)據(jù)處理和變異解讀是目前一個(gè)難點(diǎn)問(wèn)題。本研究基于實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)發(fā)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)一體化全流程分析系統(tǒng)［9］，根據(jù)不同變異類(lèi)型的特點(diǎn)，按照單核苷酸變異和小插入/缺失，拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異、非編碼區(qū)域的變異注釋、線粒體和雜合性缺失分別進(jìn)行注釋和篩選，將結(jié)果統(tǒng)一匯總至基因?qū)用孢M(jìn)行分析，便于數(shù)據(jù)解讀人員結(jié)合受檢患兒的臨床表型，提升解讀效率。當(dāng)然，對(duì)于在WGS數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的臨床意義未明變異，仍需結(jié)合人工判讀、病例表型隨訪進(jìn)行致病性分析。

遺傳性疾病的臨床表型在新生兒期沒(méi)有特異性，臨床診斷困難，易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間。既往研究［6］顯示，僅有10%的病例可根據(jù)典型的臨床表型預(yù)測(cè)出最有可能導(dǎo)致疾病的基因。與既往報(bào)道［6］類(lèi)似，本研究納入的15例患兒入院主訴均不典型，主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)異常、反應(yīng)差及喂養(yǎng)困難等常見(jiàn)的新生兒疾病臨床癥狀。在明確診斷后，我們對(duì)基因診斷陽(yáng)性患兒的表型與基因診斷陰性的患兒表型進(jìn)行比較，無(wú)法獲得較為特異性的表型，難以根據(jù)表型進(jìn)行陽(yáng)性診斷的預(yù)測(cè)。因此，采用快速WGS檢測(cè)有利于盡早查明NICU患兒的病因，明確診斷，確定治療方案并進(jìn)行相應(yīng)的遺傳咨詢(xún)。

目前NICU日均住院費(fèi)用在2 000元以上，長(zhǎng)時(shí)間的維持治療給患兒家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，家屬急迫需要知道具體的病因。有些遺傳性疾病需要在生命早期盡快干預(yù)，而一些遺傳性疾病在現(xiàn)有的醫(yī)療條件下缺乏有效治療手段，只能進(jìn)行姑息治療?？焖俚幕驒z測(cè)的結(jié)果可以為病因診斷提供重要依據(jù)，輔助臨床醫(yī)生做出最佳的醫(yī)療決策，還有可能減輕患兒及其家庭的痛苦，避免無(wú)效努力。這其中需要遵循遺傳咨詢(xún)的相關(guān)倫理問(wèn)題。在基因檢測(cè)前，臨床醫(yī)生應(yīng)詳細(xì)地向患兒家屬解釋基因檢測(cè)在病因診斷中的意義。獲得基因檢測(cè)結(jié)果后，臨床醫(yī)生應(yīng)客觀地告知患兒家屬關(guān)于該疾病的知識(shí)，強(qiáng)調(diào)遺傳性疾病在個(gè)體間存在的差異，科學(xué)引導(dǎo)患兒家屬做出合理選擇。

本研究尚有兩點(diǎn)局限性值得探討。首先，WGS數(shù)據(jù)量龐大，對(duì)生物信息學(xué)分析和臨床解讀要求非常高，需要配備相應(yīng)的信息處理系統(tǒng)和生物信息分析團(tuán)隊(duì)，短期內(nèi)難以在各醫(yī)院推廣應(yīng)用；其次，WGS數(shù)據(jù)的變異解讀基于對(duì)現(xiàn)有疾病知識(shí)的認(rèn)知，一些患兒的數(shù)據(jù)可能在之后的數(shù)據(jù)更新中獲得診斷，可能需要醫(yī)生和家屬配合提供進(jìn)一步的臨床隨訪信息，定期更新數(shù)據(jù)分析。

綜上，WGS可為臨床懷疑為遺傳性疾病的危重癥新生兒提供全面、快速、高性?xún)r(jià)比的遺傳檢測(cè)技術(shù)，縮短等待時(shí)間，為臨床處置危重癥病例提供診斷依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。