基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討土茯苓-車前子干預(yù)尿酸性腎病作用機(jī)制

黃藝飛，尹延哲，邵忠林，張偉平，胡榮雪，佟穎，2

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

尿酸性腎?。╱ric acid nephropathy，UAN）是由高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶在腎臟沉積過多，引起腎臟受損的一類疾病[1]。UAN臨床表現(xiàn)以蛋白尿、水腫、少尿、高血壓、高尿酸等為特征[2]。HUA在全球的高發(fā)病率給社會(huì)帶來巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。

中醫(yī)治療UAN在保護(hù)腎功能、改善腎損害方面有顯著優(yōu)勢(shì)[3]。土茯苓有清熱利濕、通利關(guān)節(jié)功效，可用于治療濕熱壅毒引起的疾病，其主要化學(xué)成分黃酮類可抑制黃嘌呤氧化酶活性，減少尿酸生成[4]。車前子具有清熱、平肝、明目、利水功效，用于治療尿頻尿急、目赤腫痛、痛風(fēng)等疾病[5]。研究顯示，車前子能抑制嘌呤酶，減少尿酸生成[6]。土茯苓、車前子能下調(diào)高尿酸大鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 mRNA表達(dá)，促進(jìn)尿酸排泄，從而改善HUA[7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法，探究土茯苓-車前子干預(yù)UAN的可能機(jī)制，以期為中醫(yī)治療UAN提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 土茯苓-車前子活性成分及靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）分別檢索土茯苓、車前子化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選活性成分，通過TCMSP檢索活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“uric acid nephropathy”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）對(duì)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正并轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.3 交集靶點(diǎn)獲取

利用WPS Office Execl 11.1將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，交集靶點(diǎn)即土茯苓-車前子干預(yù)UAN的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，置信度＞0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中游離靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，保存為tsv文件。利用Cytoscape3.7.2的CytoNCA 插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，利用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到干預(yù)UAN的主要活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，將結(jié)果導(dǎo)入R軟件，進(jìn)行可視化處理。

1.7 活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載藥物活性成分2D結(jié)構(gòu)，再通過Chem3D軟件把2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。利用RCSB Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，篩選條件：①蛋白結(jié)構(gòu)來源于人；②構(gòu)象分辨率＜2.5 ?；③蛋白構(gòu)象序列完整且有小分子配體；④結(jié)晶pH值接近人體生理范圍。利用AMDock1.0軟件對(duì)主要活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓-車前子活性成分及靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP檢索獲得土茯苓活性成分15個(gè)，車前子活性成分9個(gè)，二者共同成分2個(gè)，見表1。通過TCMSP 檢索對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，去除重復(fù)后共獲得靶點(diǎn)309個(gè)。

表1 土茯苓-車前子活性成分信息

2.2 疾病靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)獲取

通過GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得疾病靶點(diǎn)975、556、0個(gè)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得UAN相關(guān)靶點(diǎn)1 512個(gè)。

將土茯苓-車前子作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，經(jīng)UniProt校對(duì)后得到59個(gè)共有靶點(diǎn)，即土茯苓-車前子干預(yù)UAN的交集靶點(diǎn)。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將59個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)有56個(gè)靶點(diǎn)和427條邊。篩選拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，將大于度值中位數(shù)2倍的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，得到核心靶點(diǎn)7個(gè)，分別為IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3，以此為基礎(chǔ)建立PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖1 土茯苓-車前子干預(yù)UAN交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 土茯苓-車前子干預(yù)UAN核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.7.2軟件繪制土茯苓-車前子活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有78 個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、柚皮素（naringenin）等19 個(gè)活性成分，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）等59個(gè)靶點(diǎn)，通過139條邊連接，見圖3。通過CytoNCA插件計(jì)算，篩選出大于度值中位數(shù)2倍的6個(gè)活性成分，見表2。

表2 土茯苓-車前子干預(yù)UAN主要活性成分拓?fù)浞治?/p>

圖3 土茯苓-車前子活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)59個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，以P＜0.05為篩選條件，得到生物過程（BP）238個(gè)，包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（cytokine-mediated signaling pathway）、基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、細(xì)胞遷移的正調(diào)控（positive regulation of cell migration）、老化（aging）等；細(xì)胞組分（CC）39個(gè)，包括質(zhì)膜（plasma membrane）、細(xì)胞外間隙（extracellular space）、胞外區(qū)（extracellular region）、大分子復(fù)合物（macromolecular complex）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔（endoplasmic reticulum lumen）等；分子功能（MF）46 個(gè)，包括相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、血紅素結(jié)合（heme binding）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）等。以P值升序排序，取各項(xiàng)前10位用R軟件繪制氣泡圖，見圖4～圖6。

圖4 土茯苓-車前子干預(yù)UAN靶點(diǎn)GO-BP富集分析

圖5 土茯苓-車前子干預(yù)UAN靶點(diǎn)GO-CC富集分析

圖6 土茯苓-車前子干預(yù)UAN靶點(diǎn)GO-MF富集分析

KEGG富集分析得到84個(gè)相關(guān)通路，以P值升序排列，取前10 位信號(hào)通路用R 軟件繪制氣泡圖，見圖7。主要作用于癌癥通路（Pathways in cancer）、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。

圖7 土茯苓-車前子干預(yù)UAN靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

將主要活性成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素與4個(gè)核心靶點(diǎn)IL6、TNF、PPARG、TP53分別進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為，結(jié)合能＜-5 kcal/mol表明成分與靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性，若＜-7 kcal/mol則提示有強(qiáng)烈結(jié)合活性[8]。運(yùn)用AMDock1.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，各成分與靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)結(jié)合活性，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素與PPARG具有強(qiáng)烈結(jié)合活性，見表3。另外，選取槲皮素與4個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接可視化分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素與IL6 的ARG167、SER175、PRO64殘基形成氫鍵，與TNF的GLN125、LEU93、ARG82 殘基形成氫鍵，與PPARG 的CYS432、ILE268殘基形成氫鍵，與TP53的GLN19、HIS73、LYS69殘基形成氫鍵，見圖8。

表3 核心靶點(diǎn)與主要活性成分分子對(duì)接平均結(jié)合能（kcal/mol）

圖8 槲皮素與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接模式

3 討論

根據(jù)臨床癥狀，UAN 屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“腰痛”“歷節(jié)”等范疇?！端貑枴け哉撈酚小帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，《靈樞·經(jīng)脈》云：“足少陰之別……虛則腰痛?！盪AN病機(jī)為正氣虧虛，肝脾腎受損，濕、痰、瘀等邪久積體內(nèi)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，病位在腎，與肺、肝、脾等臟有關(guān)。根據(jù)其基本病機(jī)，應(yīng)以健脾益腎、利濕泄?jié)帷⒒钛鰹榛局畏╗3]。土茯苓味甘、淡，性平，歸肝、胃經(jīng)，可除濕解毒、通利關(guān)節(jié)。車前子味甘、性寒，入腎、膀胱經(jīng)，可利水通淋、滲濕止瀉。土茯苓、車前子能入肝腎，泄?jié)駶?，符合UAN基本治法。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從土茯苓-車前子中篩選出22個(gè)干預(yù)UAN的活性成分，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等可能在UAN發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。槲皮素可通過調(diào)節(jié)大鼠腎組織有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3、多藥耐藥相關(guān)蛋白4、乳腺癌耐藥蛋白和多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1水平，增加尿酸排泄，降低血尿酸水平，從而改善UAN 造成的腎損傷[9]。此外，槲皮素可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、環(huán)氧化酶-2、核因子-κB水平和半胱氨酸酶-3、Bcl-2表達(dá)，調(diào)節(jié)肝腎毒性，改善肝腎組織病理變化，恢復(fù)細(xì)胞抗氧化能力[10]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，能通過降低趨化因子和炎癥因子表達(dá)發(fā)揮降低膽固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等作用[11]。其抗炎機(jī)制主要是抑制TLR4/NF-κB、NLRP3、STAT 和MAPK等信號(hào)通路[12]。豆甾醇具有抗炎、抗腫瘤等生物活性，通過影響MAPK3和PRKACA調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)，起到抗炎作用[13]。Kishore等[14]發(fā)現(xiàn)，豆甾醇可能通過減少AGEs形成和改善氧化應(yīng)激，影響糖尿病腎病進(jìn)展。根據(jù)β-谷甾醇和豆甾醇在抗炎方面的作用，我們推測(cè)，其可能通過干預(yù)UAN引起的炎癥反應(yīng)，從而改善高尿酸引起的腎損害。柚皮素對(duì)促炎因子和抗炎因子都有一定調(diào)節(jié)作用，可降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，進(jìn)而降低血尿素氮、血肌酐、血尿酸水平，改善四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝腎損傷[15]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3靶點(diǎn)可能在土茯苓-車前子干預(yù)UAN過程中起重要作用。白細(xì)胞介素（IL）-6是一種促炎因子，可激活其他細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮因子，減少中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白分泌，抑制腎臟炎癥和纖維化，從而改善慢性UAN腎損傷[16]。調(diào)節(jié)IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平可改善腎臟損傷，對(duì)UAN起到保護(hù)作用[17]。PPAR-γ是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)和纖維化，PPAR-γ通路能調(diào)節(jié)內(nèi)皮性一氧化氮合酶表達(dá)，保護(hù)缺血再灌注引起的急性腎損傷，減輕腎臟氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化[18]。Awad等[19]發(fā)現(xiàn)，降低腎組織TP53表達(dá)可減緩腎臟纖維化，保護(hù)腎功能。Ye等[20]發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)PTGS2蛋白及mRNA表達(dá)可抑制炎癥，從而減輕尿酸鹽結(jié)晶引起的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，土茯苓-車前子干預(yù)UAN的生物過程包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、基因表達(dá)的調(diào)控、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞遷移等，分子功能主要涉及相同蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性及酶結(jié)合等。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路排名靠前。AGE-RAGE/NF-κB通路激活與腎臟保護(hù)有關(guān)，且在肝臟與腎臟纖維化組織中更明顯[21]。Li等[22]研究表明，激活I(lǐng)L-17信號(hào)通路可緩解白色念球菌誘導(dǎo)的BALB/c小鼠腎臟炎癥。

綜上，土茯苓-車前子可能通過調(diào)控IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3等靶點(diǎn)及AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路，影響肝、腎細(xì)胞生物活性，干預(yù)UAN。本研究為中醫(yī)藥治療UAN提供理論依據(jù)，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)屬于理論研究，一方面受限于數(shù)據(jù)庫(kù)的時(shí)效性，另一方面需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。