響應面法優(yōu)化地皮菜總三萜提取工藝及其抗氧化活性

宋曉凡，李巖，院珍珍，2*，馬馥梅

（1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016）

地皮菜（Nostoc commune）又稱為地軟、地木耳等，一般出現(xiàn)在干旱、半干旱的地區(qū)，是一種重要的固氮原核生物，在青海省柴達木盆地的德令哈、格爾木、都蘭、天峻等地均有大面積生長[1]。據中國藥典記載，地皮菜對補充維生素和蛋白質、清熱解毒、滋陰潤肺、益氣明目、皮疹赤熱等具有明顯效果[2]，而且含有縮酚類、單取代苯環(huán)類、蒽醌類、三萜類以及多糖等多種活性成分[3]。同時地皮菜中的活性成分具有保濕、紫外線防護等多種護膚功效[4-5]。因此，研究地皮菜中活性成分對其產品開發(fā)和綜合利用具有重要意義。

三萜類化合物是一類由多個異戊二烯單位（C5H8）構成的烴類及其含氧衍生物，通常是由30個碳原子組成[6]。三萜類化合物具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、免疫[9]等生物活性，因此有很多關于靈芝[10]、牛樟芝[11]等的總三萜提取工藝的研究報道。目前，地皮菜水溶性多糖、黃酮的提取及結構特征和生物活性是研究的熱點，但是對地皮菜中總三萜的提取及其抗氧化分析的相關研究較少。地皮菜含有多種活性成分，具有重要的食用和藥用價值，開發(fā)應用前景廣泛。

目前提取三萜的方法有傳統(tǒng)熱提取、索氏提取[12]、微波輔助提取[13-14]、超臨界輔助萃取[15]、超聲波輔助提取[16-17]等，超聲波輔助提取方法操作簡便，用時較短，深受研究者的青睞。本試驗對地皮菜總三萜超聲波輔助提取工藝進行優(yōu)化，并探究其抗氧化活性，以期為地皮菜資源的研究和進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青海野生地皮菜：海東市綠品源商貿有限公司；齊墩果酸、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；95%乙醇、甲醇、冰乙酸：天津市富宇精細化工有限公司；高氯酸：北京化工廠；三氯乙酸、鄰苯三酚：天津市百世化工有限公司；香草醛：上海中秦化學試劑有限公司；以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

200T多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；R-1001VN旋轉蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；H/T16MM臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地皮菜總三萜的提取

將地皮菜洗凈烘干后，粉碎過60目篩備用。精確稱取地皮菜粉末，與一定量乙醇溶液混合，在一定的溫度下以320 W的功率超聲處理一定時間，抽濾除去廢渣，旋轉蒸發(fā)濃縮，將濃縮液烘干，得到地皮菜總三萜粗提取物。

1.3.2 標準曲線的繪制

稱取齊墩果酸4 mg，用甲醇溶解后置于10 mL容量瓶中定容，分別移取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 上述標準液置于10 mL的容量瓶中，水浴加熱15 min后依次加入0.4 mL 5%的香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，在60℃水浴加熱30 min后用流水冷卻至室溫，加冰乙酸定容，于550 nm處測定吸光值，利用吸光值和標準品的質量濃度繪制標準曲線[18]，得到線性回歸方程 y=2.370 9x+0.006 2，R2=0.999 1。

1.3.3 總三萜得率的計算

稱取一定量總三萜粗提取物，用乙醇將其溶解。在試管中加入配好的總三萜溶液1.0 mL，按1.3.2方法測定3次，測得的吸光值（A）取平均值代入1.3.2回歸方程計算地皮菜總三萜質量濃度。根據公式（1）計算地皮菜總三萜得率。

式中：W為地皮菜總三萜得率，%；C為計算得到的總三萜質量濃度，mg/mL；V為待測總三萜溶液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為地皮菜樣品質量，mg。

1.3.4 單因素試驗

固定提取溫度65℃、提取時間40 min、乙醇濃度75%、料液比1∶25（g/mL）中的3個因素，進行單因素試驗。分別改變提取溫度（55、60、65、70、75 ℃）、料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、提取時間（20、30、40、50、60 min） 和乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%），考察各因素對地皮菜總三萜得率的影響。

1.3.5 響應面試驗

根據單因素試驗結果，進行三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。固定乙醇濃度為95%，考察料液比、提取時間以及提取溫度對地皮菜總三萜得率的影響。利用Design-Expert軟件對數(shù)據進行擬合，確定最優(yōu)提取工藝。試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface test design

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參考Zhang等[19]的測定方法并作修改。取不同濃度的樣品加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL混勻，室溫避光反應30 min，于517 nm處檢測其吸光值A1。同條件下測定DPPH溶液的吸光值A0。以VC為陽性對照。按照公式（2）計算DPPH自由基清除率，平行測定3次。

1.3.6.2 ABTS+自由基清除能力測定

ABTS+自由基清除能力測定參考Liu等[20]的方法并有所改動。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，在黑暗、室溫下放置16 h；用磷酸鹽緩沖液（pH7.0）稀釋混合液至其吸光值在734 nm處為0.70±0.02，得到ABTS混合溶液。將不同濃度的樣品以1∶20的體積比加入到ABTS混合溶液中，混合后于室溫下孵育6 min，于734 nm處測定吸光值A1。同條件測定ABTS混合溶液的吸光值A0。以VC為陽性對照。ABTS+自由基清除率按公式（3）計算，平行測定3次。

1.3.6.3 羥自由基清除能力測定

參考張美萍等[21]的方法略有改動。取0.15 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）和0.04 mg/mL的番紅溶液各1 mL，0.945 mmol/L 的 EDTA-2Na-Fe2+溶液（pH7.4）0.5 mL、再加入0.5 mL不同濃度的樣品和1%H2O2溶液0.5 mL，于37℃孵育30 min，在520 nm下檢測吸光值A1。同條件測定超純水吸光值A0。以VC為陽性對照。按照公式（4）計算羥自由基清除率，平行測定3次。

1.3.6.4 總還原能力測定

參考康寧等[22]的方法略有改動。取2.5 mL不同濃度的樣品液，依此加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，置于50℃水浴反應20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5mL0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10min，在700 nm處測定吸光值。以VC作為陽性對照。

1.4 數(shù)據處理

所有試驗均重復3次，采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據分析，作圖采用EXCEL 2016軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對地皮菜總三萜得率的影響

提取溫度對地皮菜總三萜得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對地皮菜總三萜得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

圖1表明，地皮菜總三萜得率隨提取溫度升高呈先上升后下降趨勢，總三萜得率在60℃時達到最大值，為0.96%。隨著提取溫度的繼續(xù)升高，總三萜得率降低，可能是因為隨著提取溫度的升高，提取溫度越接近乙醇沸點78℃，致使乙醇揮發(fā)速度加快，導致總三萜得率減小。因此，選取提取溫度為55、60、65℃進行后續(xù)試驗。

2.1.2 料液比對地皮菜總三萜得率的影響

料液比對地皮菜總三萜得率的影響見圖2。

圖2 料液比對地皮菜總三萜得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由圖 2 可知，當料液比為 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）時，地皮菜總三萜得率隨溶劑量的增加而增加，這說明溶劑量過少導致總三萜溶解不完全，從而總三萜得率較低。在料液比為1∶20（g/mL）時得率最高，為0.85%，隨后總三萜得率隨溶劑量增大呈現(xiàn)下降的趨勢，可能是稀釋倍數(shù)過大，且溶劑乙醇在加熱條件下更易揮發(fā)，從而導致總三萜得率下降。因此，選取料液比為1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.3 提取時間對地皮菜總三萜得率的影響

提取時間對地皮菜總三萜得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對地皮菜總三萜得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由圖3可知，地皮菜總三萜得率隨著提取時間的延長先升高后降低，當提取時間為50 min時得率達到峰值，為0.59%。分析原因可能是提取時間過長破壞了總三萜的結構，導致總三萜得率降低。因此，選取提取時間為40、50、60 min進行后續(xù)試驗。

2.1.4 乙醇濃度對地皮菜總三萜得率的影響

乙醇濃度對地皮菜總三萜得率的影響見圖4。

圖4 乙醇濃度對地皮菜總三萜得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of total triterpenoids from Nostoc commune

由圖4可知，總三萜得率隨著乙醇濃度的增大而逐漸升高，當乙醇濃度為95%時，總三萜得率為1.1%。分析原因可能是地皮菜中含有的總三萜易溶于乙醇等有機溶液，而較難溶于水，所以乙醇的濃度越高，溶出的總三萜就越多。因此確定最佳的乙醇濃度為95%。

2.2 響應面優(yōu)化及分析

2.2.1 模型的建立與方差分析

響應面分析結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

表3 總三萜提取得率方差分析表Table3 Variance analysis table of total triterpenoid extraction ratio

對表2試驗數(shù)據利用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合，得到總三萜得率與提取溫度、料液比、提取時間的二次多項回歸模型：Y=1.41+0.015A+0.013B+0.062C+5.000×10-3AB+0.065AC+0.000BC-0.30A2-0.29B2-0.34C2。

由表3分析可知，該模型的F值為9.33且P＜0.01，表明擬合模型具有極顯著性。根據F值可以得到3個因素對總三萜得率的影響大小順序為C＞A＞B，即提取時間＞提取溫度＞料液比。另外，A2、B2、C2對地皮菜總三萜得率的影響極顯著，AB、AC、BC對總三萜得率的影響不顯著，因此試驗因素對響應值Y的影響不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大影響。以上均說明該模型可用于優(yōu)化地皮菜總三萜提取工藝。

2.2.2 最佳提取工藝條件的驗證

響應面試驗分析得出地皮菜總三萜的最佳提取工藝條件：料液比 1∶20.11（g/mL），提取時間 50.94 min，提取溫度60.18℃，預測在該條件下總三萜得率為1.41%?？紤]到實際操作的可行性，將試驗條件調整為料液比 1∶20（g/mL），提取時間 50 min，提取溫度 60 ℃。重復3次試驗進行驗證，所得平均得率為1.38%，該結果與理論值接近，說明所得最優(yōu)工藝參數(shù)準確可靠，表明該模型可以較好地預測地皮菜總三萜得率。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

地皮菜總三萜和VC對DPPH自由基的清除能力見圖5。

圖5 地皮菜總三萜和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由圖5可知，當?shù)仄げ丝側频馁|量濃度在0.05 mg/mL～1.60 mg/mL時，地皮菜總三萜對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加保持不斷增加的趨勢。當質量濃度為1.60 mg/mL時，總三萜對DPPH自由基清除率達到最大，為48.43%。說明地皮菜總三萜具有一定的DPPH自由基清除能力，但是與VC相比較，DPPH自由基清除能力相對較弱。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

地皮菜總三萜和VC對ABTS+自由基的清除能力見圖6。

圖6 地皮菜總三萜和VC對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 ABTS+free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由圖6可知，當質量濃度在0.05mg/mL～3.20mg/mL時，地皮菜總三萜對ABTS+自由基的清除能力與其質量濃度呈正相關。地皮菜總三萜的ABTS+自由基清除率從14.24%增加到81.43%，增加幅度較大。當質量濃度在3.20 mg/mL時，地皮菜總三萜的ABTS+自由基清除率接近VC。

2.3.3 羥自由基清除能力

地皮菜總三萜和VC對羥自由基的清除能力見圖7。

圖7 地皮菜總三萜和VC對羥自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由圖7可知，當?shù)仄げ丝側频馁|量濃度為0.05 mg/mL～1.60 mg/mL時，地皮菜總三萜對羥自由基的清除率隨質量濃度的增加無明顯變化，且始終大于VC。當質量濃度為3.20 mg/mL時，地皮菜總三萜對羥自由基的清除率有了明顯提高，但小于VC，表明地皮菜總三萜清除羥自由基的能力較強。

2.3.4 總還原能力

地皮菜總三萜和VC的總還原能力見圖8。

圖8 地皮菜總三萜和VC的總還原能力Fig.8 Total reducing ability of total triterpenoids from Nostoc commune and vitamin C

由圖8可知，當質量濃度在0.05mg/mL～3.20mg/mL時，隨著質量濃度的增加，地皮菜總三萜的總還原能力呈先緩慢上升后急劇上升的趨勢。當質量濃度為3.20 mg/mL時，地皮菜總三萜的總還原能力達到最大，為1.818，此時VC為2.566。相同質量濃度下，地皮菜總三萜的總還原能力低于VC的總還原能力。

3 結論

本試驗在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化地皮菜總三萜的超聲輔助提取工藝條件，最終確定地皮菜總三萜的最佳提取條件為乙醇濃度95%、料液比 1∶20（g/mL）、提取時間 50 min、提取溫度 60 ℃，在此最佳提取條件下得到地皮菜總三萜得率為1.38%。通過抗氧化試驗可知，地皮菜總三萜具有一定DPPH自由基清除能力，對羥自由基、ABTS+自由基有較強的清除能力并且有較強的總還原能力。甚至當?shù)仄げ丝側茲舛葹?.20 mg/mL時，對羥自由基的清除率高于VC?？梢?，地皮菜總三萜具有較好的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑進行開發(fā)利用。