破壁處理對松花粉營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)的影響

王桐，曲濤，程勇，王召君，曾茂茂，秦昉，陳潔，何志勇*

（1.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 煙臺 264000；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122）

松花粉是松屬植物的精細(xì)胞，是我國傳統(tǒng)的藥食同源花粉品種，因其富含多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、酶和多酚類物質(zhì)，被譽(yù)為“微量營養(yǎng)庫”[1]。國內(nèi)外研究顯示松花粉具有多種生理功效[2]，如抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖和血脂等，具有廣闊的開發(fā)前景，越來越受到食品和醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注。

松花粉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)堅固，能夠抗酸、堿、腐蝕等，但同時也降低了其人體胃腸消化率，影響營養(yǎng)成分的吸收利用，極大限制了松花粉的開發(fā)利用[3]。因此，采收回的原松花粉需要進(jìn)行破壁處理。目前，超微粉碎技術(shù)因其具有效率高、污染小、可在無菌條件下操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于花粉細(xì)胞壁的破碎處理。該技術(shù)原理是原料通過借助壓縮空氣，高速進(jìn)入研磨室并與研磨室內(nèi)壁劇烈摩擦振動和顆粒間碰撞使原料細(xì)胞壁被破壞[4]。已有文獻(xiàn)報道超微粉碎破壁處理對花粉或其它樣品的營養(yǎng)成分溶出具有明顯的效果[5]。此外，松花粉中水不溶性膳食纖維含量為42.6%～47.2%[6]，而膳食纖維具有明顯的潤腸通便功能，其中與膳食纖維密切相關(guān)的理化性質(zhì)（包括持水力、持油力、陽離子交換能力、膽固醇吸附能力、亞硝酸鹽清除能力和金屬離子吸附能力等）可以反映出樣品潤腸通便功能的強(qiáng)弱[7]。因此，本研究采用超微粉碎破壁處理松花粉，評價松花粉破壁處理前后的成分以及相關(guān)理化性質(zhì)的變化，為松花粉的加工、開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原松花粉、破壁松花粉：煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司；大豆油、玉米油、花生油、菜籽油：市售；蘆丁、沒食子酸、Folin-Ciocalteu、熊果酸：美國Sigma公司；無水乙醇、氯化鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、高氯酸、氯化鈉、Cd（NO3）2、Pb（NO3）2、CuSO4、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、濃硫酸、冰乙酸、膽固醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全波長酶標(biāo)儀（SpectraMax 190）：美國 Molecular Devices公司；高效液相色譜儀（Waters 1525）：美國Waters公司；離子色譜儀（ICS-5000）：美國戴安公司；冷凍離心機(jī)（5910R）：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪和可溶性總糖含量測定

水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪和可溶性總糖含量分別按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中的直接干燥法、GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》中的第一法、GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱式定氮法、GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中的索式抽提法和任婧[8]的蒽酮比色法進(jìn)行測定。

1.3.2 膳食纖維含量測定

松花粉中膳食纖維含量按照GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》中的酶-重量法進(jìn)行測定。

1.3.3 總黃酮、總酚和總?cè)坪繙y定

樣品溶液的制備：向2.5 g松花粉中加入20倍體積的70%乙醇溶液，超聲輔助提取30 min（30℃）后過濾（提取3次），合并濾液濃縮至50 mL，于-20℃冰箱保存待用。

采用Cheng等[4]的方法測定總黃酮含量：向0.2 mL松花粉提取液中加入蒸餾水至4 mL并搖勻，分別加入0.3 mL 5%NaNO2溶液（混勻并靜置5 min）、0.3 mL 10%AlCl3溶液（混勻并靜置6 min）和2 mL 1 mol/L NaOH溶液，蒸餾水定容至10mL，搖勻靜置顯色10 min后測定510 nm處的吸光度（A510）?？傸S酮含量以蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）表示，單位記為 mg RE/g。

采用Quan等[9]的方法進(jìn)行總酚含量測定：向0.2mL松花粉提取液中加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑（稀釋10倍）混勻，靜置5min后加入3mLNa2CO3溶液（75g/L），蒸餾水定容至10 mL混勻后避光反應(yīng)2 h，測定765 nm處的吸光度（A765）?？偡雍恳詻]食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示，單位記為 mg GAE/g。

采用何策等[10]的方法進(jìn)行總?cè)坪繙y定：量取1.0 mL松花粉提取液并揮干其中的乙醇（85℃水浴），加入0.3 mL香草醛-冰醋酸溶液（5%）和1.0 mL高氯酸，60℃水浴15 min后冷卻，加入5.0 mL冰醋酸，搖勻，測定550 nm處的吸光度（A550），以無水乙醇為空白對照?？?cè)坪恳孕芄岙?dāng)量（ursolic acid equivalent，UAE）表示，單位記為 mg UAE/g。

1.3.4 可溶性蛋白分子量分布測定

將1g松花粉與50mL水混勻并超聲輔助提取2h，濃縮至5 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，使用高效液相色譜儀測定分子量分布。色譜條件：TSK gel 2000 SWXL（300 mm × 7.8 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，體積比）；檢測波長為 220 nm；流速為0.5 mL/min；柱溫為30℃。

1.3.5 單糖組成測定

將300mg脫脂干燥的松花粉與40mL硫酸（1mol/L）于120℃下水解3 h后冷卻，稀釋200倍，過0.22 μm膜待測。色譜條件：CarboPac PA20色譜柱；檢測器為脈沖安培檢測器；流動相A為水、B為250 mmol/L NaOH、C為1 mol/L醋酸鈉溶液；梯度洗脫程序為0～21 min，98%A；21 min～21.1 min，98%～93%A；21.1 min～30 min，93%～78%A；30 min～30.1 min，78%～20%A；30.1 min～50 min，20%A；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.6 持水力和持油力測定

參考Liu等[11]的方法測定樣品的持水力和持油力：將0.5 g松花粉與30 mL去離子水或植物油（大豆油、玉米油、花生油和菜籽油）置于燒杯中，室溫下攪拌過夜。靜置 1 h后離心（10 000 r/min，20 min，25℃）去上清液并稱重。持水力或持油力按照下列公式計算。

式中：M1為樣品干質(zhì)量，g；M2為樣品濕質(zhì)量，g。

1.3.7 陽離子交換能力測定

采用Chau等[12]的方法對樣品的陽離子交換能力進(jìn)行測定：將0.2g松花粉與70倍體積的鹽酸（0.1mmol/L）置于錐形瓶中混勻，于室溫下磁力攪拌酸化24 h，使用蒸餾水將樣品中Cl-沖洗干凈。使用50 mL NaCl溶液（5%）酸化樣品，以酚酞為指示劑并用NaOH溶液（0.01 mmol/L）滴定至溶液顏色變?yōu)槲⒓t色，記錄NaOH溶液的消耗體積。陽離子交換能力按下列公式計算。

式中：V1和V0分別為滴定樣品組和空白組消耗NaOH溶液的體積，mL；c為 NaOH溶液濃度，mol/L；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.8 膽固醇吸附能力測定

采用張啟月等[13]的方法對樣品的膽固醇吸附能力進(jìn)行測定：將2.0 g樣品與50 g蛋黃乳液（由新鮮制備的蛋黃液用水稀釋10倍所得）攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值為2.0和7.0，37℃振蕩2 h后離心（4 000 r/min，20 min）并收集上清液。向0.1 mL上清液中加入冰乙酸至1.0 mL，再加入0.4 mL鄰苯二甲醛（l.0 mg/mL）和8.0 mL混合酸（冰乙酸與濃硫酸體積比1∶1），室溫放置10 min后測定550 nm處的吸光度（A550）。以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定量，并按下列公式計算樣品對膽固醇的吸附能力。

式中：m1和m2分別為吸附前和吸附后蛋黃液中膽固醇量，mg；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.9 亞硝酸鹽清除能力測定

采用鄭佳欣[14]的方法測定樣品的亞硝酸鹽清除能力：向0.5g樣品中加入100mLNaNO2溶液（100μmol/L），調(diào)節(jié)pH值至2.0和7.0，磁力攪拌至完全分散后，于37℃下恒溫水浴振蕩2 h，取出靜置。向上清液（2.0mL）中加入2 mL對氨基苯磺酸溶液（0.4%），混勻并放置5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液（0.2%），定容至50 mL，混勻并靜置15 min后測定538 nm處的吸光度（A538）。以空管為參比，NaNO2溶液為標(biāo)準(zhǔn)液測定NO2-含量，按下列公式計算亞硝酸鹽清除率。

[5]趙晉、張建軍、王奕俊：《大數(shù)據(jù)思維下教育發(fā)展機(jī)遇與挑戰(zhàn)的再思考》，《電化教育研究》2018年5月。

式中：C0為溶液中 NO2-初始摩爾濃度，μmol/L；C1為溶液中NO2-最終摩爾濃度，μmol/L。

1.3.10 金屬離子吸附能力測定

樣品對Cd2+、Pb2+、Cu2+的吸附能力測定按照李晗等[15]的方法進(jìn)行：分別取 100 mL 100 mg/L 的 Cd（NO3）2、Pb（NO3）2和 CuSO4溶液置于 250 mL 的三角瓶中，用HNO3和NaOH溶液（0.01 mol/L）依次調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0和7.0。然后在每個三角瓶中分別加入0.50 g樣品，于37℃下振蕩培養(yǎng)（120 r/min）2 h后吸取適量吸附液離心（8 000 r/min，10 min，25℃）取上清液，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定各上清液中金屬離子的濃度。按下列公式計算樣品對金屬離子的吸附率。

式中：100為反應(yīng)總體積，mL；M1和M2分別為初始和吸附2 h后的離子質(zhì)量濃度，g/L；N為樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Statistix 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）分析平均值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁處理對松花粉營養(yǎng)成分的影響

原松花粉和破壁松花粉基本成分含量如表1所示。

表1 破壁處理對松花粉基本成分含量的影響Table 1 Effect of cell wall disruption on content of basic components in pine pollen%

由表1可知，原松花粉和破壁松花粉水分含量分別為6.69%、5.46%，灰分含量分別為4.36%、2.35%，粗蛋白含量分別為11.59%、11.64%，與文獻(xiàn)[2]報道的含量接近。破壁松花粉粗脂肪含量顯著高于原松花粉粗脂肪含量，這是由于松花粉經(jīng)過破壁處理后，有機(jī)溶劑更易進(jìn)入花粉細(xì)胞內(nèi)，從而可以提取出更多的脂肪[3]。破壁松花粉的可溶性總糖含量（20.15%）顯著高于原松花粉（13.84%），這可能是松花粉經(jīng)破壁處理后由于比表面積的增加而溶出了更多的總糖，這與高歌[16]對靈芝的研究結(jié)果一致。

原松花粉和破壁松花粉膳食纖維含量如表2所示。

表2 破壁處理對松花粉膳食纖維的影響Table 2 Effect of cell wall disruption on dietary fiber of pine pollen%

由表2可知，原松花粉與破壁松花粉的總膳食纖維含量分別為55.16%和54.47%，主要以不溶性膳食纖維為主，不溶性膳食纖維含量分別為53.93%和52.98%。破壁處理對松花粉總膳食纖維、不溶性膳食纖維和可溶性膳食纖維含量無顯著影響。

松花粉破壁處理前后的總黃酮、總酚和總?cè)坪咳绫?所示。

表3 破壁處理對松花粉中總黃酮、總酚和總?cè)坪康挠绊慣able 3 Effect of cell wall disruption on total flavonoids，phenols，and triterpenes of pine pollen

由表3可知，經(jīng)過破壁處理后，松花粉中總黃酮、總酚和總?cè)坪糠謩e增加了18.6%、30.2%和29.6%，這表明破壁處理后松花粉比表面積增大使酚類物質(zhì)更易溶出[17]，也有文獻(xiàn)報道松花粉在加工過程中產(chǎn)生的局部碰撞可能使結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)降解釋放為游離態(tài)，使得總游離態(tài)酚含量明顯升高[4]。此外，由于總黃酮、總酚和總?cè)坪烤捎帽壬ㄟM(jìn)行測定，樣品中的多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的存在對測定結(jié)果有一定的干擾[9]。

松花粉破壁處理前后的可溶性蛋白分子量分布如表4所示。

表4 破壁處理對松花粉中可溶性蛋白分子量分布的影響Table 4 Effect of cell wall disruption on molecular weight of soluble proteins in pine pollen

由表4可知，原松花粉和破壁松花粉可溶性蛋白分子量主要以分子量＜180Da為主，分子量180Da～500Da次之，經(jīng)過破壁處理后，松花粉可溶性蛋白分子量＜180 Da的占比由79.92%降低為67.16%，分子量在180 Da～500 Da的占比由18.34%升高到24.45%。此外，破壁松花粉中可溶性蛋白分子量＞10 000 Da的占比（2.70%）要明顯高于原松花粉（0.18%）。松花粉可溶性蛋白中主要以小分子肽段為主，小分子肽具有多種生理活性，如抗氧化性、免疫活性等。

松花粉破壁處理前后的單糖組成如表5所示。

表5 破壁處理對松花粉單糖組成的影響Table 5 Effect of cell wall disruption on monosaccharides of pine pollen%

由表5可知，原松花粉和破壁松花粉中主要以葡萄糖（73.99%～75.51%）和鼠李糖（14.36%～14.78%）為主，破壁處理對松花粉單糖組成影響較小。有文獻(xiàn)報道松花粉中主要以葡萄糖（69.17%）、阿拉伯糖（10.43%）和木糖（5.63%）為主[18]，蕎麥花粉主要以阿拉伯糖（45.30%）和半乳糖（36.80%）為主[19]，玉米花粉中以葡萄糖（67.3%）、半乳糖（22.32%）和阿拉伯糖（10.33%）為主[20]，這些含量差異主要與花粉品種、產(chǎn)地、生長條件、采后貯藏時間和貯藏環(huán)境等因素有關(guān)。本研究中松花粉葡萄糖占比要明顯高于其他花粉中葡萄糖占比。

2.2 破壁處理對松花粉理化性質(zhì)的影響

松花粉中含有豐富的膳食纖維，而膳食纖維具有多種理化特性，如持水力、持油力、陽離子交換能力、膽固醇吸附能力、亞硝酸鹽清除能力和金屬離子吸附能力等。盡管破壁處理前后松花粉中膳食纖維含量并未有明顯變化，但破壁處理前后松花粉形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變[4]，這可能極大影響著松花粉的上述理化特性。

松花粉破壁處理前后的持水力和持油力如表6所示。

表6 破壁處理對松花粉持水力和持油力的影響Table 6 Effect of cell wall disruption on water-holding capacity and oil-holding capacity of pine pollen g/g

持水力與樣品的水化性能相關(guān)。樣品的微粒大小、加工條件、表面特性等極大影響著樣品的持水力[15，21]。由表6可知，破壁松花粉的持水力顯著強(qiáng)于原松花粉（P＜0.05）。

持油力可用來簡單模擬樣品吸收脂肪的能力，具有高持油力的樣品可以減少其在加工過程中脂肪的流失，還可以在腸道中吸附脂類從而降低血清中膽固醇的含量[21-22]。由表6可知，除對大豆油持油力沒有明顯影響外，破壁松花粉的玉米油、花生油和菜籽油持油力均顯著強(qiáng)于原松花粉（P＜0.05）。樣品的持油力與樣品的表面特性、電荷密度、微粒疏水性息息相關(guān)[21]。受樣品粒子的表面性質(zhì)和疏水性質(zhì)的影響，理論上，比表面積大的粒子對油性成分的吸收率更強(qiáng)[23]。

松花粉的陽離子交換能力、膽固醇吸附能力和亞硝酸鹽清除能力如表7所示。

表7 破壁處理對松花粉陽離子交換能力、膽固醇吸附能力和亞硝酸鹽清除能力的影響Table 7 Effect of cell wall disruption on cation exchange capacity，cholesterol-adsorbing capacity，and nitrite-scavenging capacity of pine pollen

由表7可知，破壁松花粉的陽離子交換能力顯著強(qiáng)于原松花粉（P＜0.05），這是由于松花粉經(jīng)過破壁處理后其粒徑減小、比表面積增大，松花粉表面所帶的羧基與羥基等官能團(tuán)裸露[24]。原松花粉和破壁松花粉的膽固醇吸附能力分別為12.24 mg/g和13.78 mg/g，未見明顯差異。樣品表面的正負(fù)電荷所產(chǎn)生的排斥力或吸引力極大影響了纖維樣品與膽固醇的結(jié)合力，從而影響其膽固醇吸附能力[12]。

破壁松花粉亞硝酸鹽清除能力顯著強(qiáng)于原松花粉，這種差異可能是由于樣品暴露出不同種類和數(shù)量的羧基、羥基等官能團(tuán)[13]。以纖維素、半纖維素和木質(zhì)素為主要成分的不溶性膳食纖維可從消化道吸收水分，減少排泄物在腸道的停留時間，增加糞便的體積，從而減輕或者預(yù)防便秘；而可溶性膳食纖維在吸水后黏度增大，可延長胃排空的時間[25-26]。

破壁處理對松花粉金屬離子吸附能力的影響如表8所示。

表8 破壁處理對松花粉金屬離子吸附率的影響Table 8 Effect of cell wall disruption on metal ion-adsorbing capacity of pine pollen mg/g

高含量膳食纖維的破壁松花粉由于其具有比表面積大、表面粗糙、結(jié)構(gòu)疏松等特點(diǎn)，可能具有良好的金屬離子吸附特性，如吸附Cu2+、Cd2+、和Pb2+等重金屬離子。由表8可知，破壁松花粉對Cu2+的吸附能力顯著強(qiáng)于原松花粉，而原松花粉對Cd2+和Pb2+的吸附能力顯著強(qiáng)于破壁松花粉。各個樣品的結(jié)構(gòu)與成分的不同是其對金屬離子吸附能力不同的主要原因，樣品與金屬離子間的物理、化學(xué)和分子間相互作用決定樣品的吸附能力[27]。

3 結(jié)論

本文研究了破壁處理對松花粉營養(yǎng)成分及理化特性（包括持水力、持油力、陽離子交換能力、膽固醇吸附能力、亞硝酸鹽清除能力和金屬離子吸附能力）的影響。結(jié)果表明：經(jīng)過破壁處理后，松花粉具有更高含量的粗脂肪和可溶性總糖；膳食纖維含量無顯著變化；總黃酮、總酚和總?cè)坪糠謩e增加了18.6%、30.2%和29.6%；可溶性蛋白分子量＜180 Da的占比降低，分子量在180 Da～500 Da的占比升高；單糖組成無明顯變化。破壁松花粉的持水力、持油力、陽離子交換能力和亞硝酸鹽清除能力明顯強(qiáng)于原松花粉；破壁處理對松花粉膽固醇吸附能力無顯著影響，但對不同金屬離子吸附能力具有一定的影響，其中破壁松花粉相比于原松花粉對Cu2+吸附能力增強(qiáng)，而對Cd2+和Pb2+吸附能力減弱。從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，松花粉經(jīng)過破壁處理后其中的主要營養(yǎng)和功能成分溶出較多、含量明顯增加，大部分理化性質(zhì)明顯提高，這可為松花粉的加工處理與開發(fā)利用提供支持。