影響苯胺法檢測游離棉酚的因素分析研究

柴 燃，季紹東，史自強，吳 迪，宋偉光，高 偉

（1.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲 056250；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開發(fā)重點實驗室，河北邯鄲 056038；3.河北省植物資源綜合利用重點實驗室（籌），河北邯鄲 056107）

棉籽中含有大量油脂和豐富蛋白質(zhì)，可用作食品和飼料中蛋白質(zhì)、油脂的來源。我國棉籽年產(chǎn)量約1000萬t，居世界首位，若能充分利用可顯著降低我國糧食供應(yīng)風(fēng)險。但棉籽的色腺體中包含棉酚，占棉籽總重量的0.4%～2%（Cai等，2004）。盡管棉酚具有抗生育（Sharaky等，2010）、抗腫瘤（Zeng等，2019）等生物活性，但游離棉酚含量過高會影響哺乳動物（Zhu等，2020）和禽類（Farthing等，2019）的正常生理過程。棉酚的存在限制了棉籽相關(guān)產(chǎn)品在食品和飼料中的應(yīng)用（Lv等，2010）。棉酚在棉籽產(chǎn)品中有兩種存在形式，分別是游離狀態(tài)的棉酚（FG）和結(jié)合狀態(tài)的棉酚（BG）。結(jié)合棉酚是通過棉酚上的醛基與蛋白質(zhì)、氨基酸的游離氨基之間發(fā)生反應(yīng)，形成共價化合物（Lu等，2017）。游離棉酚的活性醛基和活性羥基處于游離狀態(tài)（Khalaf等，2008），易與動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生反應(yīng)，干擾正常生理過程，產(chǎn)生毒性。結(jié)合棉酚由于活性基團與其他物質(zhì)結(jié)合（Pons等，1977），對動物的健康影響不大（Gadelha等，2014），因此在國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，棉籽蛋白、棉籽油和棉籽粕的關(guān)鍵性控制指標(biāo)為游離棉酚的含量。

不同棉籽產(chǎn)品采用的檢測方法不同。棉籽油和植物性食品采用高效液相法檢測游離棉酚；當(dāng)棉籽產(chǎn)品用作飼料時，采用苯胺法檢測游離棉酚；而脫酚棉籽蛋白這兩種方法均可。脫酚棉籽蛋白作為一種用于飼料的新型蛋白原料，與傳統(tǒng)棉籽加工而成的棉籽粕有著巨大區(qū)別?！睹摲用拮训鞍住罚℅H/T1042-2007）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)明確了脫酚棉籽蛋白的質(zhì)量指標(biāo)：粗蛋白質(zhì)含量大于50%，以分光光度計法測定的游離棉酚不得超過400 mg/kg、高效液相色譜（HPLC）法測定的游離棉酚不得超過60 mg/kg。高效液相色譜法檢測標(biāo)準(zhǔn)明顯要高于分光光度計法，但對分光光度計法和高效色譜法檢測結(jié)果差異的具體原因鮮見研究報道。分光光度計法分為苯胺法和間苯三酚法（Thatching等，2008）。我國飼料行業(yè)的最新標(biāo)準(zhǔn)《飼料中游離棉酚的檢測》（GB 13086-2020）和歐盟采用的是苯胺法，因此本研究中采用苯胺法檢測樣品中的棉酚含量，通過比較苯胺法和高效液相色譜法的結(jié)果差異，研究影響苯胺法檢測的因素，這對于棉酚的檢測研究和棉籽產(chǎn)品的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、恒溫水浴鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、紫外分光光度計（日本島津公司）、超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、純水儀、振蕩器（常州國華電器有限公司）。

1.1.2 試劑和材料 正己烷、苯胺、異丙醇、冰乙酸、3-氨基-1-丙醇、丙酮、磷酸購自天津光復(fù)試劑，均為分析純；色譜純丙酮、乙醇、甲醇和棉酚標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米淀粉購自上海麥克林生化公司；棉籽油見自河北晨光生物科技集團。為保證苯胺的純度，在使用之前加入鋅粒進行蒸餾提純處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯胺法檢測棉酚 按照GB/T 13086-2020《飼料中游離棉酚的測定方法》規(guī)定的檢測步驟進行。溶劑A的配制：將異丙醇/正己烷（500 mL，6：4，V/V）混合溶劑、冰醋酸（8 mL）、純水（50 mL）和3-氨基-1-丙醇（2 mL）置于1 L的容量瓶中，再用異丙醇/正己烷混合溶劑補足。

1.2.2 高效液相色譜法檢測棉酚 參考GB 5009.148-2014《植物性食品中游離棉酚的測定方法》中規(guī)定的檢測步驟，萃取液采用乙醇或丙酮。液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），檢測波長：235 nm，柱溫：40℃，進樣量：10μL，流速：1.0 mL/min，流動相為0.5%磷酸水溶液：甲醇=15：85。

1.2.3 棉酚氧化物對棉酚檢測的影響 稱取0.1 g棉酚至燒杯中，加入9.9 g玉米淀粉，攪拌均勻，常壓下120℃烘干4 h，分別采用苯胺法和高效液相色譜法檢測游離棉酚。

1.2.4 油脂氧化對棉酚檢測的影響 精確稱取9 g玉米淀粉轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入1 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）棉籽油，攪拌均勻。鼓風(fēng)干燥箱中120℃烘干4 h后采用苯胺法檢測樣品加熱前后的游離棉酚變化。

1.2.5 黃酮類對棉酚檢測的影響 稱取9.5 g玉米淀粉和0.5 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）槲皮素轉(zhuǎn)到燒杯中，攪拌均勻，采用苯胺法檢測游離棉酚。

1.2.6 糖類對棉酚檢測的影響 稱取9.5 g玉米淀粉3份，分別加入0.5 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）葡萄糖、0.5 g棉子糖和0.5 g蔗糖，轉(zhuǎn)移到燒杯中，攪拌均勻，采用苯胺法檢測游離棉酚。

1.3 數(shù)據(jù)處理 所有試驗均設(shè)置平行實驗（n=3），利用Microsoft Excel 2013進行收集整理，數(shù)據(jù)分析通過SPSS軟件進行，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示結(jié)果，采用one-way ANOVA方法比較組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法和苯胺法檢測棉酚 高效液相法檢測棉酚含量按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，以乙醇作為溶劑萃取脫酚棉籽蛋白的游離棉酚后，通過液相色譜檢測含量，脫酚棉籽蛋白的檢測結(jié)果相對苯酚法的檢測結(jié)果都顯著偏低，平均偏低85%（P<0.05）。

相同條件下，將丙酮作為溶劑萃取游離棉酚，脫酚棉籽蛋白的液相色譜檢測結(jié)果相對苯胺法的檢測結(jié)果也都是顯著偏低，平均偏低89%（P<0.05），趨勢與乙醇萃取實驗的一致（表1）。這些結(jié)果表明苯胺法檢測游離棉酚的數(shù)值偏高，因此進一步對影響苯胺法檢測游離棉酚的因素進行分析研究。

表1 不同溶劑萃取脫酚棉籽蛋白的游離棉酚檢測結(jié)果 mg/kg

2.2 棉酚氧化物對棉酚檢測的影響 將棉酚以及在120℃常壓環(huán)境下氧化4 h后的棉酚，分別用苯胺法和高效液相色譜檢測游離棉酚含量。結(jié)果如表2所示，棉酚加熱前苯胺法和高效液相法檢測的游離棉酚含量相差不大；將棉酚氧化后，高效液相法檢測游離棉酚明顯低于棉酚氧化前的含量，苯胺法檢測結(jié)果比高效液相法的結(jié)果高出43.6%。這是由于棉酚在空氣中加熱，會在氧氣作用下氧化形成棉醌（Howell等，2000），顏色由淺黃色變深黃色。但棉酚上的醛基得到保留，保證棉醌依舊能夠與苯胺反應(yīng)，影響游離棉酚檢測結(jié)果，導(dǎo)致與棉酚氧化前的結(jié)果基本相同。

表2 苯胺法和液相法檢測棉酚氧化物中的游離棉酚 mg/kg

2.3 油脂氧化對棉酚檢測的影響 將棉籽油在高溫環(huán)境下加速氧化，檢測加熱前后棉酚含量的變化。如表3所示，苯胺法檢測結(jié)果顯示烘干后游離棉酚的含量是烘干前的6.93倍（P<0.05），表明油脂氧化會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。王美霞（2016）對棉籽油進行研究，發(fā)現(xiàn)其含有多種脂肪酸，主要成分為亞油酸、棕櫚酸、油酸，還有少量亞麻酸、花生酸。不飽和脂肪酸在棉籽油中的含量高達70%以上，其在氧氣存在下會氧化分解為一次產(chǎn)物，一次產(chǎn)物不穩(wěn)定會進一步氧化分解生成二次產(chǎn)物（羰基化合物），如酮、醛、酸等（王憲青等，2003）。醛類物質(zhì)能夠與苯胺發(fā)生反應(yīng)，使苯胺法檢測棉酚的結(jié)果偏高。

表3 油脂氧化對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

2.4 黃酮類對棉酚檢測的影響 棉籽中存在多種黃酮類物質(zhì)，包括槲皮素（Lukefahr，2016）、山奈酚（張慶建等，2001）、棉黃素（Khan，2013）等，其中槲皮素含量最豐富（額爾敦巴雅爾等，2021）。為確定黃酮類物質(zhì)對苯胺法檢測的影響，在玉米淀粉中加入5%槲皮素后進行檢測。如表4所示，添加槲皮素之后，苯胺法測得的游離棉酚含量提高16.75倍（P<0.05），這表明黃酮類物質(zhì)也能干擾苯胺法檢測游離棉酚，可能是由于黃酮上的酮基在加熱情況下與苯胺發(fā)生反應(yīng)，使440 nm吸光度增加，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。

表4 槲皮素對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

2.5 糖類對棉酚檢測的影響 棉籽中含糖類較多，主要包括棉子糖、蔗糖、葡萄糖（Xu等，2022）。如表5所示，三種糖類中，棉子糖和蔗糖對游離棉酚檢測數(shù)值沒有影響，葡萄糖使游離棉酚檢測數(shù)值比空白對照升高12.9倍（P<0.05），明顯影響苯胺法的檢測結(jié)果。作為測試樣品三種糖中，棉子糖、蔗糖屬于非還原糖，只有葡萄糖是還原糖，還原糖在加熱過程中部分暴露醛基，與苯胺發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致游離棉酚結(jié)果偏高。

表5 糖類對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，棉籽中存在的多種天然化合物都能干擾苯胺法檢測游離棉酚，包括棉酚衍生物、油脂氧化產(chǎn)物、黃酮類物質(zhì)和還原糖。另外，苯胺容易變質(zhì)，使用之前需要提純（朱利民等，2017），費時費力，且檢測誤差高達10%，逐漸無法滿足生產(chǎn)經(jīng)營中對棉酚檢測及時性和準(zhǔn)確性的要求。因此，測定棉籽相關(guān)產(chǎn)品中的游離棉酚，選用高效液相色譜法進行檢測更為快速和精確。