大黃素緩解類風濕關節(jié)炎痛的機制研究

成鼎文 朱海麗 謝 敏 劉 玲

湖北科技學院醫(yī)學部藥學院，湖北咸寧 437000

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性疾病，可導致關節(jié)損傷及病理性疼痛，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]，其病理機制與氧化應激失調(diào)和免疫炎癥反應密切相關[2]。核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）作為一種重要的抗氧化蛋白，可激活內(nèi)源性抗氧化通路，清除氧自由基，維持細胞氧化還原平衡，顯著抑制RA發(fā)展[3]。白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）是最常見的炎性細胞因子，在RA疼痛患者中，通過抑制IL-1β分泌，可顯著改善患者癥狀[4]。因此，激活內(nèi)源性抗氧化通路和抑制脊髓神經(jīng)炎癥可作為治療RA痛的一個有效手段。

大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌）是從藥用植物的根和樹皮中提取的衍生蒽醌化合物，其具有抗炎、抗氧化等特性[5]。為研究大黃素在RA疼痛中的作用，本研究中構建佐劑型RA疼痛小鼠模型，大黃素腹腔給藥后檢測其對疼痛的緩解作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所使用的C57BL/6小鼠購自湖北省實驗動物中心[動物許可證號：SYXK（鄂）2018-0071]，共30只，6～8周齡，體重18～22 g。動物飼養(yǎng)在明暗交替的動物房中，并給予適量的食物和水。所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學院實驗動物倫理委員會批準（2021-05-981）。

1.2 儀器及試劑

冰凍離心機（德國eppendorf公司，型號：5424R）；微型垂直電泳儀（北京韋克斯科技有限公司，型號：EP300）；迷你手持均質(zhì)儀（北京蘭杰柯科技有限公司，型號：L-C119-0502）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號：IX73P1F）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國GE公司，型號：29-0050-63）。

大黃素（上海源葉生物科技有限公司）；完全弗式佐劑、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、SDSPAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；本實驗所用一抗如下：兔抗核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、兔抗β肌動蛋白（β-actin）和兔抗IL-1β均購于Affinity公司；兔抗NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor 3，NLRP3）、兔抗環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）和兔抗Nrf2均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，兔抗小膠質(zhì)細胞標記蛋白游離鈣結合適配器蛋 白1（ionized calcium binding adapter protein 1，Iba1）購于碧云天生物科技有限公司；所用二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 動物造模與給藥處理

將30只小鼠隨機分為對照組、模型組和大黃素給藥組，每組各10只。模型組和大黃素給藥組采用左膝關節(jié)注射完全弗式佐劑造模。動物適應1周后，開始造模，具體流程如下：完全弗式佐劑與生理鹽水1∶1稀釋，采用水合氯醛麻醉，小鼠左腿剃毛，使用無菌微量注射器向小鼠左膝關節(jié)內(nèi)緩慢注射完全弗式佐劑混懸液（40 μl），隨后用碘伏消毒傷口。建模持續(xù)14 d，14 d后觀察造模部位，若皮膚發(fā)紅腫脹或膝關節(jié)有紅腫，則視為造模成功。造模成功后，10 mg/kg大黃素腹腔給藥處理小鼠，連續(xù)給藥3 d，3 d后檢測所有動物行為學變化，行為學檢測完以后進行動物麻醉處死，脊髓取材用于后續(xù)實驗研究。

1.4 動物行為學實驗

1.4.1 自發(fā)縮足反射次數(shù)記錄 將小鼠置于20 cm×20 cm×20 cm的透明玻璃盒內(nèi)，實驗開始前適應20 min，過程中觀察并記錄每5 min內(nèi)小鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)，記錄3次，計算其縮足反射平均值。

1.4.2 縮足閾值檢測 將動物放置于20 cm×20 cm×20 cm的透明正方體玻璃盒內(nèi)，適應30 min后，用Von Frey纖維（0.16～2.0 g）垂直刺激小鼠左側后肢足底正中，持續(xù)時間≤5 s，出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應，反之則為陰性反應。記錄6次數(shù)據(jù)后結束檢測。根據(jù)公式50% PWT（g）=（10[Xf+Kδ]）/10 000計算各組小鼠的縮足閾值。

1.4.3 轉棒運動實驗 正式實驗開始前3天每天將小鼠放在轉棒儀器上適應，設置參數(shù)勻速4 r/min的速度適應10 min，間隔休息30 min，重復3次。正式實驗時以10 r/min運動10 s，勻加速10 s，以20 r/min運動30 s，勻加速10 s，以20 r/min運動9 min。記錄實驗動物運動的距離和在轉棒上停留的時間。

1.5 免疫印跡（Western blot）

過量麻醉處死小鼠分離腰段脊髓，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解、勻漿、4℃條件下12 000 r/min離心15 min后取上清，BCA蛋白測定試劑盒檢測其蛋白濃度；SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，孵育一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，用LAS500凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，凝膠成像Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對RA痛小鼠行為學的影響

模型組小鼠的縮足閾值、轉棒停留時間和運動距離均低于對照組，自發(fā)縮足次數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），表明RA小鼠痛覺過敏并伴有運動功能的降低；大黃素給藥組小鼠的縮足閾值、停留時間和運動距離均高于模型組，自發(fā)縮足次數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），表明大黃素腹腔給藥可顯著改善RA小鼠的運動能力。見表1。

表1 大黃素對RA痛小鼠行為學的影響（±s）

表1 大黃素對RA痛小鼠行為學的影響（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05

組別 n 縮足閾值（g） 自發(fā)縮足次數(shù)（次/5 min） 轉棒停留時間（s） 運動距離（m）對照組 10 1.186±0.215 2.700±0.675 569.415±41.067 23.176±4.511模型組 10 0.326±0.146a 6.100±1.287a 267.048±76.599a 9.173±3.820a大黃素給藥組 10 1.083±0.114ab 4.500±1.178ab 469.661±93.014ab 18.596±4.851ab F值 108.800 95.270 43.940 24.900 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白表達情況

Western blot結果顯示，模型組小鼠的脊髓組織Iba1和COX-2蛋白表達高于對照組，Nrf2蛋白表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；大黃素給藥組小鼠的脊髓組織Iba1和COX-2蛋白表達低于模型組，Nrf2蛋白表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖1、表2。

圖1 小鼠脊髓組織Iba1、Nrf2和COX-2蛋白表達結果

表2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白相對表達水平（±s）

表2 小鼠脊髓組織中Iba1、Nrf2和COX-2蛋白相對表達水平（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05；Iba1：小膠質(zhì)細胞標記蛋白游離鈣結合適配器蛋白1；Nrf2：核因子E2相關因子2；COX-2：環(huán)氧化酶2；β-actin：β肌動蛋白

組別 n Iba1/β-actin Nrf2/β-actin COX-2/β-actin對照組 10 1.000±0.031 1.000±0.023 1.001±0.013模型組 10 1.132±0.037a 0.959±0.031a 2.436±0.113a大黃素給藥組10 0.771±0.017ab 1.918±0.071ab 1.250±0.113ab F值 75.690 310.100 358.800 P值 0.001 0.002 0.003

2.3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達情況

western blot結果顯示，模型組小鼠的脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；大黃素給藥組小鼠的脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖2、表3。

圖2 小鼠脊髓組織NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白表達結果

表3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白相對表達水平（±s）

表3 小鼠脊髓組織中NF-κB、NLRP3和IL-1β蛋白相對表達水平（±s）

注 與對照組比較，aP＜ 0.05；與模型組比較，bP＜ 0.05；NF-κB：核因子κB；NLRP3：NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3；IL-1β：白介素1β；β-actin：β肌動蛋白

組別 nNF-κB/β-actinNLRP3/β-actinIL-1β/β-actin對照組 10 1.000±0.040 1.000±0.036 1.000±0.042模型組 10 1.208±0.048a 2.094±0.017a 1.154±0.032a大黃素給藥組10 1.034±0.031ab 1.252±0.071ab 1.070±0.021ab F值 64.550 322.400 26.220 P值 0.015 0.001 0.029

3 討論

研究表明大黃素在多種病理性疼痛進程中發(fā)揮作用，在慢性炎癥痛大鼠模型中，腹腔注射大黃素降低血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）/IL-1β和IL-6的水平并緩解大鼠機械痛和熱痛[6]。在慢性縮窄性損傷神經(jīng)痛模型中，大黃素降低背跟神經(jīng)節(jié)中初級感覺神經(jīng)元嘌呤P2X受體的表達并減輕大鼠痛覺過敏[7]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素在RA疼痛模型中可有效緩解小鼠自發(fā)痛和機械痛。因此，大黃素可作為治療病理性疼痛的藥物，具有較好的醫(yī)用前景。

NLRP3炎癥小體激活介導的脊髓炎癥多種病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。NLRP3被刺激后與接頭蛋白ASC組裝成復合物，催化caspase-1激活，將無活性的pro-IL-1β裂解為具有促炎活性的IL-1β并釋放[8]。在患有纖維肌痛和Schnitzler綜合征（一種罕見的以關節(jié)疼痛和關節(jié)炎為特征的自身免疫性疾?。┑幕颊哐褐邪l(fā)現(xiàn)了NLRP3和IL-1β表達增加。同時在疼痛動物模型包括炎癥痛、神經(jīng)痛、癌痛以及RA痛中均報道了NLRP3表達和激活增加以及IL-1β的產(chǎn)生增加[9]。進而NF-κB激活可促進無活性NLRP3和pro-IL-1β轉錄，上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達水平[10]。在胰腺癌[11]和肥胖哮喘[12]模型中發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制NF-κB信號活性及IL-1β水平從而發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素可降低脊髓中NF-κB、NLRP3和IL-1β的表達，具有抑制脊髓炎癥的效果。

Nrf2及其下游靶點與炎癥和病理性疼痛相關。過量的活性氧導致慢性疼痛的發(fā)展，Nrf2激活可增加抗氧化激酶的基因轉錄包括血紅素加氧酶-1、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶等，降低活性氧的水平進而緩解疼痛[13]。同時Nrf2激活還可抑制NF-κB核蛋白和炎癥因子的表達[14]。研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病模型中，大黃素增加Nrf2、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶活性從而改善小鼠空間記憶和學習能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素給藥可升高脊髓Nrf2表達并降低COX-2表達，從而減輕脊髓氧化應激水平。

本研究的創(chuàng)新點在于將脊髓炎癥及氧化應激與大黃素的鎮(zhèn)痛效果聯(lián)系在一起，并為大黃素的鎮(zhèn)痛作用機制作出解釋。同時，局限性在于給藥方式為腹腔給藥，大黃素起效劑量和代謝率不能準確定量，在進一步研究中可改用靜脈給藥或鞘內(nèi)給藥，從而明確大黃素藥物劑量與鎮(zhèn)痛功效的關系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大黃素可激活抗氧化Nrf2途徑降低NF-κB介導的炎癥信號并發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應，有助于大黃素作為RA痛的鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)研究。