Box-Benhnken響應曲面法優(yōu)化大花紫薇中科羅索酸的提取工藝

林艾和 朱培芳 李 蓉 夏宗霄 龍小妹 郭 爽 范 源,2*

1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216

大花紫薇(LagerstroemiaspeciousL.)，又名大葉紫薇(Lagerstroemiaflos-reginaeRetz)，是千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬(Lagerstroemia)的落葉喬木[1]。其原產(chǎn)于亞洲熱帶，分布于斯里蘭卡、印度、馬來西亞、菲律賓等地區(qū)[2]，在我國廣東、廣西地區(qū)有較豐富的資源。

上世紀90年代起，日本、美國以及菲律賓學者開始系統(tǒng)研究大花紫薇化學成分及功能[3]，其廣泛用于治療糖尿病及腎病[4]，在多個國家已經(jīng)被開發(fā)為茶飲料，廣泛用于治療和預防糖尿病，被譽為“天然植物胰島素”[5]，此外，其還具有減脂、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等作用[6]。近年來，隨著對大花紫薇的研究深入，發(fā)現(xiàn)其降血糖的活性成分主要是鞣質(zhì)類[5,7-8]和三萜類成分[9-10]，其中三萜類主要活性成為科羅索酸[11]，其具有胰島素樣作用且可抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶活性[12-14]。

科羅索酸(corosolic acid，CA)，又名 2α-羥基熊果酸[15]，具有降血糖、改善糖尿病性腎損傷、抗腫瘤、抗炎、降血壓、抗菌等藥理作用[16-19]。其主要存在于大花紫薇、枇杷、北五味子等植物中[20]，現(xiàn)關于在大花紫薇中提取CA相關報道較少，本實驗研究建立大花紫薇中CA HPLC 定量分析方法，同時采用響應曲面法優(yōu)化其提取工藝，為在大花紫薇中提取CA的工藝研究和對大花紫薇的后續(xù)開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 YL-040S 語路超聲波清洗機，深圳市即潔超聲科技有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀，DAD檢測器，AcclaimC30色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm),美國 Agilent 公司；DFY-600 搖擺式高速萬能粉碎機，永康式速鋒工貿(mào)有限公司；D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋，上海量壹科學儀器有限公司；T-1000 型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；AB265-S 十萬分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade(Shanghai)Co.LTD；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司。

試劑：科羅索酸(CA 批號：wkq20042404，純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

藥材：大花紫薇LagerstroemiaspeciousL.(批號：P20200819，安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學李國棟副教授鑒定為千屈菜科Lythraceae紫薇屬Lagerstroemia植物大花紫薇的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：AcclaimC30色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)；流動相：甲醇(B)-乙腈(C)-0.1%磷酸水溶液(D)；梯度洗脫:0 ～10 min 75% B，12.5% C，12.5% D；10～20 min 70% B，15% C，15% D；流速：0.1 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按科羅索酸計算應不低于 5000，分離度大于1.5。色譜圖如圖1所示。

A

BA.對照品溶液；B.供試品溶液；1.科羅索酸圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取CA對照品2.40 mg，置 10 mL 量瓶中，用甲醇配制成CA濃度分別為0.240 mg/mL 的混合對照品溶液，低溫避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備 取干燥的大花紫薇，粉碎，過 40 目篩，精密稱定約 2.0 g，置于圓底燒瓶中，加熱回流，提取溫度90℃，設置不同料液比、加熱回流時間、回流次數(shù)及乙醇體積分數(shù)，合并提取液，過濾。濾液于 60 ℃減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解后移至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜膜過濾，依次精密吸取2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL， 按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。 CA的回歸方程為y=604.24x+1.1333(R2=0.9999)，線性范圍為 0.480～2.880 μg。

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液 10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣 6 次，結(jié)果CA的峰面積RSD 為1.13% ，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，按“2.1.1”項下色譜條件，以峰面積為指標進樣分析，結(jié)果CA面積 RSD 為1.44%，表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品 6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果顯示CA平均含量為2.3246 mg/g, RSD 為 1.28%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品(每 1.0 g 大花紫薇含CA 2.3246mg)粉末 6份，每份精密稱取 1.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，加入CA對照品適量(約相當于 1.0 g 樣品中所含CA的量)，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率。結(jié)果見表 1。

表1 大花紫薇中CA加樣回收率試驗表

2.2 單因素實驗 采用加熱回流法提取大花紫薇中的科羅索酸，將料液比、加熱回流時間、回流次數(shù)及乙醇體積分數(shù)作為影響因素，固定其中3個因素，以提取率為評價指標，對另一個因素進行單一因素實驗。固定提取時間為60 min，提取次數(shù)為1次，料液比為1∶10 g/mL，考察乙醇體積分數(shù)(75%、80%、85%、95%、100%)對提取率的影響，優(yōu)選最佳乙醇體積分數(shù)，按所優(yōu)選條件依次向下考察料液比(1∶10 g/mL、1∶15g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)，提取時間(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min)，提取次數(shù)(1次、2次、3次)對醇提的影響。

結(jié)果圖2表明，CA含量隨乙醇體積分數(shù)升高而增加，由于CA是脂溶性物質(zhì)，不溶于水，隨著乙醇體積分數(shù)的增加其含量增加，當乙醇體積分數(shù)為95%和100%時，CA含量相差不明顯，考慮實驗成本，故選擇乙醇體積分數(shù)為 95%[21]；CA含量隨料液比從1∶10 g/mL到1∶25 g/mL先增加后減少，可能因為為溶劑體積過小，CA無法徹底溶解，但溶劑體積過大，更易溶出其他的雜質(zhì)達到飽和[22]，繼續(xù)增大料液比不會增加溶出率，故選擇料液比 1∶20 g/mL；CA含量隨提取時間從40～120 min先增加后減少，CA溶出率一定時間內(nèi)隨著提取時間增加增加，但提取時間過長，料液長時間處于受熱狀態(tài)，更容易造成CA損失，固選擇提取時間60 min[23]；CA含量在提取次數(shù)2次時最大，故選擇提取次數(shù)兩次。最佳條件為乙醇體積分數(shù)95%，料液比1∶20 g/mL，提取時間60 min，提取次數(shù)2次。

圖2 醇提單因素試驗結(jié)果圖

活性物質(zhì)含量(mg/g)計算公式:

含量=M供×C標/M對

式中M供為供試品峰面積；

C標為標準品的濃度(mg/mL)

M對為標準品峰面積

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化醇提工藝

2.3.1 響應曲面試驗設計及結(jié)果 依據(jù)Box-Behnken響應面試驗設計原理，結(jié)合上述醇提單因素試驗結(jié)果，進行因素水平設計與試驗。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 醇提因素水平表

表3 醇提Box-Behnken設計與結(jié)果表

表3(續(xù))

2.3.2 醇提模型擬合及方差分析 采用Design-expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結(jié)果進行分析，得到回歸方程為

Y=-51.15554+0.94402A+0.40383B+0.13185C+0.72244D-6.7×10-4AB-1.17133×10-3AC+4×10-3AD-3.17333×10-4BC-0.0197BD+2.25917×10-4CD-4.58348×10-3A2-6.60648×10-3B2-1.2384×10-4C2-0.15528D2R2=0.9158。由表3可知，模型F=10.87(P<0.0001)，表明回歸模型極顯著，失擬項F=2.03，P=0.2584>0.05，表明模型失擬項不顯著，可用于分析試驗數(shù)據(jù)。以Y為響應值時，模型的一次項影響順序是D>B>C>A，和二次項B2、D2有極顯著影響(P<0.001)，一次項D和二次項A2、C2有高度顯著影響(P<0.01)，一次項B、C有顯著影響(P<0.05)表明所得回歸方程能較好地預測Y隨各影響因子的變化。見表4。

2.3.3 醇提響應面優(yōu)化及預測 經(jīng)Design-expert 8.0.6軟件分析得響應面圖(如圖3所示)，由圖可見提取次數(shù)對Y值影響較大，交互項對Y值無顯著影響，忽略交互作用，以Y值的回歸模型的極值分析得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分數(shù)94.77%，提取時間60 min，提取次數(shù)2.27次，料液比1∶20.93 g/mL，Y預測值為2.5783 μg/g，綜合實際情況考慮，調(diào)整最優(yōu)提取條件為乙醇體積分數(shù)95%，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。如圖3所示。

圖3 4種因素對Y的響應面圖

2.4 醇提優(yōu)化工藝驗證試驗 平行稱取大花紫薇3份，每份2.0 g，按所優(yōu)化條件進行驗證試驗。結(jié)果顯示Y平均值為2.5613 mg/g(RSD=1.33%，n=3)，與預測值2.5783 mg/g相比較，相對誤差為1.20%，說明該模型預測性擬合度良好，所得數(shù)據(jù)有效可靠。見表5。

表5 驗證試驗 (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件 本實驗經(jīng)反復試驗，調(diào)整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最終選用流動相甲醇(B)-乙腈(C)-0.1%磷酸水溶液(D)，梯度洗脫，分離度>1.5，達到了檢測要求。大花紫薇中科羅索酸的加熱回流提取最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)95%，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶20 g/mL。實驗結(jié)果表明，最佳提取方法所得科羅索酸含量為2.5613 mg/g，擬合的模型能較為準確地預測總含量，同時也說明響應面分析法精確度高、模型預測性好。

3.2 結(jié)果分析 本試驗以科羅索酸為指標成分，用Box-Benhnken響應曲面法優(yōu)化大花紫薇中CA的提取工藝，經(jīng)工藝驗證實驗證明，該提取工藝操作簡單，CA的提取率高，節(jié)省溶劑且穩(wěn)定性好，是應用前景較好的提取方法之一，可為后續(xù)CA的應用提供參考。

3.2 展望 科羅索酸具有顯著的降血糖作用，且對身體毒副作用較小，是一種較為理想的降糖化合物，數(shù)據(jù)表明大花紫薇是一種科羅索酸的含量較高的天然藥用植物，尋找在其中有效提取CA的方法是很有必要的，后續(xù)的研究可以在此文章的基礎上，從藥效、作用機制的角度來探討中藥資源的合理開發(fā)。