活血榮絡(luò)方對腦缺血再灌注損傷大鼠SIRT1/PGC-1α信號通路的影響

周德生 ，譚惠中 ，陳瑤 ，劉利娟 ，李中 ，高曉峰 ，郭純 ，顏思陽

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

腦卒中是臨床上最主要的致死和致殘?jiān)蛑?，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中。2020年全球疾病負(fù)擔(dān)研究表明，我國腦卒中終生發(fā)病率高達(dá)39.3%，居全球首位[1]。腦缺血急性期的治療原則是盡早恢復(fù)血液灌注，但可能增加腦組織病理損害和出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[2]。CIRI病理過程涉及多種因素，腦組織能量代謝紊亂是首要環(huán)節(jié)[3]，而線粒體功能異常、供能障礙是關(guān)鍵因素。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）可通過多途徑實(shí)現(xiàn)對CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。SIRT1及其底物過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）可作用于線粒體以調(diào)節(jié)能量代謝[6]，主要機(jī)制在于SIRT1激活可使PGC-1α去乙酰化，激活的PGC-1α進(jìn)入細(xì)胞核，參與能量代謝及線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)，有助于減少神經(jīng)元死亡[7]。

CIRI屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。課題組認(rèn)為其病機(jī)與榮氣虛滯聯(lián)系密切[8]，而作為細(xì)胞內(nèi)“動力工廠”的線粒體功能可反映榮氣的部分作用，線粒體供能異常與榮氣失調(diào)均表現(xiàn)為多系統(tǒng)和組織的病理反應(yīng)[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，基于榮氣虛滯理論立方的活血榮絡(luò)方能調(diào)節(jié)血漿偶聯(lián)因子6及線粒體Ca2+濃度，減輕神經(jīng)功能缺損[9]，同時可激活線粒體自噬，減輕大鼠CIRI[10-11]。本研究通過建立CIRI大鼠模型，以SIRT1/PCG-1α通路為切入點(diǎn)，探討活血榮絡(luò)方可能的作用機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

12～15周齡健康雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物中心實(shí)驗(yàn)室，動物使用許可證號SYXK（湘）2015-0003，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批（20201010-13）。

1.2 藥物及制備

活血榮絡(luò)方（雞血藤60 g，石楠藤60 g，生地黃30 g，玄參20 g，黃精30 g，乳香20 g，沒藥20 g，川芎20 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張?jiān)Ｃ裰魅嗡帋熻b定。參照課題組前期方法[12]制成浸膏。艾地苯醌片，齊魯制藥有限公司，批號9G0821D57，0.3 g/片，將藥片充分研磨后置于蒸餾水中，配制成0.8 mg/mL混懸液。SIRT1抑制劑EX-527，美國Selleck公司，貨號S1541，參照說明書配制成濃度為20 mg/mL母液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

三磷酸腺苷（ATP）含量測定試劑盒，上海碧云天，貨號S0026；DAB顯色劑，丹麥DAKO，貨號K3468；SIRT1抗體、PGC-1α抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，英國Abcam，貨號分別為 ab189494、ab191838、ab6721；First Strand cDNA Synthesis Kit、RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX），武漢Servicebio，貨號分別為G3013、G3330、G3321。大鼠栓線（北京西濃，貨號分別為2636A4、2638A4），石蠟切片機(jī)（德國Leica，型號2245），低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific，型號Fresco17），凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad，型號Chemi DocTMXRS+），電泳/轉(zhuǎn)膜裝置、熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號分別為1658001、C1000 TouchTMThermal Cycler），超凈工作臺（蘇凈安泰，型號SW-CJ-1FD），多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer，型號Enspire），超純水儀（美國Millipore，型號Milli-QIQ-7000）。

1.4 分組、造模及給藥

60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、活血榮絡(luò)方組、EX-527組、EX-527+活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組，每組10只。除假手術(shù)組外，參照Longa等[13]大腦中動脈阻塞/再灌注方法建立CIRI大鼠模型，插入栓線梗阻右側(cè)大腦中動脈，梗阻2 h后拔出栓線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅分離血管，不插入栓線。造模前36 h首次給藥，活血榮絡(luò)方組和活血榮絡(luò)方+EX-527組予1.17 g/mL活血榮絡(luò)方浸膏稀釋液11.7 g/kg灌胃，艾地苯醌組予艾地苯醌混懸液8 mg/kg灌胃[14]，之后每隔24 h給藥1次，共3次。假手術(shù)組、模型組、EX-527組予蒸餾水10 mL/kg灌胃。EX-527組和活血榮絡(luò)方+EX-527組于再灌注前20 min腹腔注射EX-527（5 mL/kg），其余各組注射等體積生理鹽水。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分

再灌注后24 h后，按Zea-Longa 5級評分法[13]對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。0分：正?；顒樱嵛矔r兩前爪伸向地面，無神經(jīng)缺損癥狀；1分：提尾時對側(cè)前肢不能完全伸直，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；2分：提尾時對側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：站立不穩(wěn)，爬行時向偏癱側(cè)跌倒；4分：有意識障礙，不能夠自發(fā)行走。分值越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.6 HE染色

再灌注24 h后，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，先后用生理鹽水200 mL、4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流，斷頭取腦，取損傷側(cè)腦組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、冠狀位切片、脫蠟、復(fù)水、HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察缺血皮質(zhì)區(qū)病理變化，每組隨機(jī)取5個不同視野觀察損傷細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個視野的細(xì)胞總數(shù)及損傷細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞損傷率（損傷細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.7 三磷酸腺苷含量測定

大鼠置于冷凍臺上分離右側(cè)缺血皮質(zhì)區(qū)組織（約15 mg），PBS沖洗后加入ATP檢測緩沖液，冰上充分勻漿，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，參照ATP檢測試劑盒說明書配制工作液，計(jì)算缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量。

1.8 免疫組化檢測

腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、漂洗、封閉，分別滴加SIRT1、PGC-1α一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，顯微鏡（×400）下觀察，陽性染色呈棕黃色或棕褐色，隨機(jī)選取5個視野，用Image J軟件分別計(jì)算SIRT1、PGC-1α陽性表達(dá)的平均光密度。

1.9 RT-qPCR檢測

取缺血皮質(zhì)區(qū)腦組織100 mg，加入1 mL Trizol，勻漿機(jī)充分研磨提取總RNA，檢測RNA濃度及純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 活血榮絡(luò)方對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組、艾地苯醌組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯降低（P＜0.05），EX-527組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；與活血榮絡(luò)方組比較，活血榮絡(luò)方+EX-527組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；艾地苯醌組與活血榮絡(luò)方組神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與活血榮絡(luò)方組比較，#P＜0.05

評分0 2.80±0.60*1.80±0.60▲3.40±0.49▲#3.00±0.30#1.60±0.66▲組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方組EX-527組活血榮絡(luò)方+EX-527組艾地苯醌組只數(shù)10 10 10 10 10 10

2.2 活血榮絡(luò)方對模型大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷的影響

假手術(shù)組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，排列致密，形態(tài)整齊，偶見細(xì)胞損傷；模型組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元萎縮變形，排列紊亂，核仁消失，細(xì)胞周圍間隙增大，胞質(zhì)深染，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重；活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元空泡樣變、核固縮情況減輕，細(xì)胞周圍間隙減小，部分神經(jīng)元壞死，但整體較模型組改善；EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷加重，胞體固縮深染加重，細(xì)胞周圍間隙增寬，細(xì)胞空泡樣變明顯；活血榮絡(luò)方+EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列欠規(guī)整，胞體固縮變形，神經(jīng)元壞死和凋亡較活血榮絡(luò)方組增多。見圖1。

圖1 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)形態(tài)（HE染色，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率升高（P＜0.05）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率降低（P＜0.05），EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率升高（P＜0.05）；與活血榮絡(luò)方組比較，活血榮絡(luò)方+EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率比較（，%）

表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞損傷率比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與活血榮絡(luò)方組比較，#P＜0.05

細(xì)胞損傷率14.45±1.88 56.15±5.82*38.91±4.77▲65.65±4.55▲#57.10±4.18#36.14±3.43▲組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方組EX-527組活血榮絡(luò)方+EX-527組艾地苯醌組只數(shù)5 5 5 5 5 5

2.3 活血榮絡(luò)方對模型大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)三磷酸腺苷含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量明顯增加（P＜0.05），EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量明顯減少（P＜0.05）；與活血榮絡(luò)方組比較，活血榮絡(luò)方+EX-527組缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量明顯減少（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量比較（，μmol/g）

表4 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)ATP含量比較（，μmol/g）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與活血榮絡(luò)方組比較，#P＜0.05

ATP組別 只數(shù)8.02±0.75 2.70±0.37*4.77±0.23▲2.04±0.21▲#2.72±0.33#5.11±0.37▲假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方組EX-527組活血榮絡(luò)方+EX-527組艾地苯醌組5 5 5 5 5 5

2.4 活血榮絡(luò)方對模型大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)沉默信息調(diào)節(jié)因子1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與活血榮絡(luò)方組比較，活血榮絡(luò)方+EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖2、圖3、表5。

表5 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1、PGC-1α表達(dá)比較（，平均光密度）

表5 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1、PGC-1α表達(dá)比較（，平均光密度）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與活血榮絡(luò)方組比較，#P＜0.05

PGC-1α 0.41±0.02 0.22±0.04*0.30±0.02▲0.17±0.03▲0.23±0.04#0.31±0.02▲組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方組EX-527組活血榮絡(luò)方+EX-527組艾地苯醌組只數(shù)5 5 5 5 5 5 SIRT1 0.43±0.08 0.24±0.06*0.38±0.07▲0.15±0.03▲0.28±0.06#0.40±0.07▲

圖2 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)PGC-1α陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.5 活血榮絡(luò)方對模型大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)沉默信息調(diào)節(jié)因子1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組和艾地苯醌組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和 PGC-1α mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與活血榮絡(luò)方組比較，活血榮絡(luò)方+EX-527組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)比較（）

表6 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與活血榮絡(luò)方組比較，#P＜0.05

PGC-1α 1.79±0.46 0.99±0.11*1.68±0.19▲0.33±0.06▲1.00±0.04#1.70±0.30▲組別假手術(shù)組模型組活血榮絡(luò)方組EX-527組活血榮絡(luò)方+EX-527組艾地苯醌組只數(shù)5 5 5 5 5 5 SIRT1 1.92±0.59 0.97±0.07*1.71±0.11▲0.29±0.02▲0.95±0.08#1.73±0.20▲

3 討論

榮氣兼具氣、血、精、津、液等精微物質(zhì)的生理功能，而榮氣虛滯為缺血性中風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵，其根本在于肝腎陰虛，津血暗耗[15]。若內(nèi)邪聚集、凝結(jié)閉塞、氣化失職等使腦絡(luò)不通或絡(luò)虛不榮，則腦髓神機(jī)紊亂、神不導(dǎo)氣，腦竅失聰、氣機(jī)升降失職，陰陽失調(diào)，發(fā)為中風(fēng)[16]?；钛獦s絡(luò)方基于榮氣虛滯理論創(chuàng)立，由石楠藤、雞血藤、玄參、生地黃、黃精、乳香、沒藥、川芎組成，具有滋陰生津、活血通絡(luò)之效。

課題組前期探討了榮氣與線粒體病理生理的相關(guān)性，榮氣功能在一定程度上體現(xiàn)線粒體的部分功能，相關(guān)研究表明，活血榮絡(luò)方可減輕腦缺血再灌注后線粒體損傷[8-10]。線粒體約占神經(jīng)元總體積的30%，缺血時腦血流急劇減少，使氧、糖缺乏，線粒體內(nèi)酶系統(tǒng)（包括呼吸酶和氧化磷酸化酶）活性降低，ATP生成不足，神經(jīng)元代謝失衡，導(dǎo)致神經(jīng)元直接壞死或凋亡。同時，酶系統(tǒng)活性降低可使離子通道異常開放，線粒體內(nèi)鈉離子、鈣離子增多，引起水鈉潴留、鈣超載，使呼吸鏈?zhǔn)軗p，進(jìn)一步阻礙ATP生成，加重神經(jīng)元損傷[17]。再灌注后，受損線粒體無法進(jìn)行正常氧化供能，其利用氧氣時多轉(zhuǎn)化為O2-而生成過氧化物，加重線粒體損傷[18]，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元廣泛壞死或凋亡。本研究表明，能量代謝紊亂存在于CIRI過程中，并進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、死亡，而活血榮絡(luò)方與艾地苯醌能提高缺血腦組織ATP含量，改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀及病理損傷，提示2種藥物可能通過調(diào)節(jié)能量代謝保護(hù)神經(jīng)元。

SIRT1參與多種基因表達(dá)，能感受細(xì)胞代謝水平和氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而激活或抑制多種途徑參與能量代謝調(diào)節(jié)，使機(jī)體適應(yīng)腦缺血應(yīng)激狀態(tài)[19]。PGC-1α是參與線粒體呼吸和基因轉(zhuǎn)錄的有效刺激因子。SIRT1磷酸化和去乙?；绊慞GC-1α活性，而PGC-1α可通過直接或間接上調(diào)線粒體多種相關(guān)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體合成，提高能量代謝水平，適應(yīng)機(jī)體腦缺血后應(yīng)激，維持神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可去乙酰化下游靶基因PGC-1α，并提高其基因和蛋白表達(dá)水平[21]。當(dāng)細(xì)胞能量不足時，SIRT1活性增加，去乙?；せ頟GC-1α，誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生及氧化磷酸化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，提高線粒體功能，改善能量代謝，提高神經(jīng)元存活率[22]。本研究表明，活血榮絡(luò)方能上調(diào)缺血腦組織SIRT1、PGC-1α蛋白及mRNA表達(dá)，而在活血榮絡(luò)方基礎(chǔ)上使用SIRT1抑制劑EX-527后，SIRT1、PGC-1α蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低，說明抑制SIRT1可以降低活血榮絡(luò)方的腦保護(hù)作用，活血榮絡(luò)方可能通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，活血榮絡(luò)方能促進(jìn)CIRI后缺血腦組織ATP生成，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，其機(jī)制可能與激活SIRT1/PGC-1α信號通路有關(guān)。本研究可為中藥防治缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。