N-甲基-N” -硝基-N-亞硝基胍復(fù)合法構(gòu)建胃癌前病變氣虛血瘀證大鼠模型

左嬌嬌 ，舒勁 ，宋瑞平 ，陳心怡 ，封壯壯

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，居全球癌癥相關(guān)性死亡原因第3位[1]。全球每年約有120萬(wàn)新發(fā)胃癌病例，其中約40%發(fā)生在中國(guó)[2]。1971年世界衛(wèi)生組織提出，異型增生為直接的“胃癌前病變”[3]。廣義的胃癌前病變（precancerous lesion of gastric cancer，PLGC）包括腸上皮化生及異型增生。Correa等[4]指出，胃癌的發(fā)生模式為正常胃黏膜→非萎縮性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃腺癌（腸型），至今仍被廣泛認(rèn)可。鑒于PLGC是胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要病理階段，也是預(yù)防胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，早期有效阻斷或逆轉(zhuǎn)PLGC向胃癌轉(zhuǎn)變對(duì)胃癌防治具有重要意義。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)PLGC缺乏有效的干預(yù)措施，中醫(yī)藥在防治PLGC方面具有一定優(yōu)勢(shì)[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究PLGC發(fā)病機(jī)制及藥物療效的重要途徑，故建立合理有效、安全穩(wěn)定的病證結(jié)合動(dòng)物模型尤為重要。大鼠因易于飼養(yǎng)、成模率高的特性，成為PLGC模型制備最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6]。N-甲基-N” -硝基-N-亞硝基胍（MNNG）法是目前較公認(rèn)的PLGC造模方法[7-9]。該法主要模擬人類(lèi)過(guò)多攝入硝酸鹽后，在胃內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸銨等致癌物質(zhì)，誘導(dǎo)胃黏膜組織發(fā)生慢性萎縮性胃炎及PLGC等病理?yè)p傷過(guò)程[10]。本課題組對(duì)MNNG誘導(dǎo)的模型進(jìn)行改良，采用MNNG復(fù)合造模法（MNNG溶液自由飲用+饑飽失常+乙醇灌胃+氨水自由飲用+雷尼替丁飼料喂養(yǎng)）構(gòu)建病證結(jié)合PLGC大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察并記錄大鼠表征變化，結(jié)合大鼠體質(zhì)量、24 h進(jìn)食量、24 h飲水量及胃黏膜病理形態(tài)等指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，判斷其證候，為建立理想、安全、穩(wěn)定的PLGC病證結(jié)合大鼠模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，5周齡，體質(zhì)量（130±20）g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～24 ℃、濕度50%環(huán)境，晝夜12 h循環(huán)，自由飲水，喂食普通維持飼料。大鼠維持飼料及含0.03%雷尼替丁飼料均由沈陽(yáng)茂華生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染液（貨號(hào)B1003），江蘇艾迪生生物科技有限公司；MNNG（貨號(hào)R030453-25g），蘭州科寶生物科技有限公司；25%氨水（批號(hào)202152），天津北辰方正試劑廠(chǎng)；無(wú)水乙醇（批號(hào)20201015），天津匯杭化工科技有限公司。磁力攪拌器，杭州旌斐儀器科技有限公司；電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)；顯微鏡（型號(hào)U-B130-2），日本OLYMPUS。

1.3 溶液配制

用1 L去離子水溶解1 g MNNG，使用磁力攪拌器使其充分溶解，配制成濃度為1 g/L的MNNG母液，置于棕色避光瓶4 ℃低溫保存，使用時(shí)用滅菌水將其稀釋成100 μg/mL溶液，置于避光飲水瓶中。使用前用滅菌水250 mL稀釋1 mL 25%氨水，配制成0.1%氨水溶液。使用前用滅菌水200 mL稀釋無(wú)水乙醇50 mL，配制成20%乙醇溶液。

1.4 分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組14只、模型組16只。結(jié)合課題組前期造模經(jīng)驗(yàn)[11-12]及相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，模型組大鼠以MNNG為主的五因素復(fù)合造模法進(jìn)行造模：①每日以100 μg/mL MNNG溶液供大鼠自由飲用；②正常進(jìn)食2 d，再禁食1 d；③禁食當(dāng)日采用20%無(wú)水乙醇2 mL/只灌胃，灌胃前后禁水1 h；④禁食當(dāng)日停止飲用MNNG溶液，改為0.1%氨水自由飲用；⑤除禁食日外，每日以0.03%雷尼替丁飼料供大鼠自由食用。連續(xù)造模26周。正常對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)。

1.5 取材

造模結(jié)束后，大鼠禁食18 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.2 mL/100 g）麻醉，剖腹，取全胃，沿胃大彎側(cè)剪開(kāi)，去除胃內(nèi)容物并用生理鹽水沖洗，在濾紙上展開(kāi)胃組織，測(cè)量胃組織大小，觀察是否有黏膜損傷，若有損傷在損傷部位切取條狀組織（1 cm×2 mm），若無(wú)損傷則在近胃小彎側(cè)從胃體延伸至胃竇切取條狀組織，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色，光鏡下觀察大鼠胃黏膜腸化及異型增生情況。

1.6 表征采集

結(jié)合《中醫(yī)診斷學(xué)》[15]及相關(guān)文獻(xiàn)[8，16]設(shè)計(jì)大鼠表征觀察量表，3名實(shí)驗(yàn)人員造模前每周根據(jù)大鼠表征觀察量表（見(jiàn)表1）對(duì)大鼠表征觀察1次，若產(chǎn)生分歧，采用2人同意原則。大鼠證候特征判斷參考《中醫(yī)診斷學(xué)》[15]，表征比率=陽(yáng)性表征大鼠數(shù)量÷大鼠總數(shù)。

表1 大鼠表征觀察量表

1.7 食水量觀察

每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量和24 h進(jìn)食量，每日測(cè)量大鼠24 h飲水量。

1.8 HE染色

造模第17周末各組隨機(jī)抽取2只大鼠、造模結(jié)束后將所有剩余大鼠取材，對(duì)胃黏膜組織進(jìn)行HE染色。根據(jù)《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)（2017年，上海）》[17]及《中國(guó)胃黏膜癌前狀態(tài)和癌前病變的處理策略專(zhuān)家共識(shí)（2020年）》[18]進(jìn)行病理診斷。腸化即化生性萎縮，指胃黏膜腺體有腸化生者。腸化分度：腸化區(qū)域占腺體和表面上皮總面積1/3以下為輕度，≥1/3～2/3為中度，2/3以上為重度。異型增生指上皮有明顯的細(xì)胞和/或結(jié)構(gòu)異常，呈腫瘤生長(zhǎng)性質(zhì)，而無(wú)固有膜浸潤(rùn)。按非典型性細(xì)胞累及上皮的范圍分為輕、中、重3級(jí)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況

正常對(duì)照組大鼠因互相撕咬致死亡2只。模型組大鼠死亡2只，其中1只因胃腸脹氣導(dǎo)致意外死亡，另1只大鼠死亡前體質(zhì)量進(jìn)行性減輕，精神萎靡，活動(dòng)減少，抓捕反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)凌亂、枯槁、發(fā)黃，眼神黯淡，唇甲色白。解剖后觀察胃組織病理顯示：胃絨毛排列紊亂，絨毛間出現(xiàn)充血現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不一，出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞核大，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底層有出血現(xiàn)象。

2.2 2組大鼠唇色及舌色比較

正常對(duì)照組大鼠唇色淡紅，舌質(zhì)紅潤(rùn)；模型組大鼠唇色青紫，舌質(zhì)黯紅。見(jiàn)圖1。

圖1 2組大鼠第26周唇色及舌色形態(tài)

2.3 2組大鼠表征變化

與正常對(duì)照組同一時(shí)期比較，模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)度減少（第6～26周）、唇淡白（第12～24周）、舌淡白（第12～24周）、爪淡白（第12～26周）、毛枯黃無(wú)澤（第18～26周）、倦怠嗜臥（第18～26周）、大便不成形（第18～26周）、眼黯紅（第18～26周）、唇青紫（第18～26周）、舌黯紅（第18～26周）、爪黯紅（第24～26周）、尾部瘀點(diǎn)（第24～26周），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠表征比率比較

2.4 2組大鼠體質(zhì)量、24 h進(jìn)食量和飲水量變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠第6周開(kāi)始體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），24 h進(jìn)食量和飲水量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 2組大鼠體質(zhì)量、24 h進(jìn)食量和飲水量比較（）

表3 2組大鼠體質(zhì)量、24 h進(jìn)食量和飲水量比較（）

注：與正常對(duì)照組同一時(shí)期比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組24 h飲水量/mL 44.30±3.65 47.60±2.88 52.40±1.50 53.50±1.84 57.10±2.23 58.30±2.41 45.20±2.70 33.42±2.50**28.75±3.20**25.42±2.81**22.92±4.60**22.67±3.28**只數(shù)10 10 10 10 10 10 12 12 12 12 12 12時(shí)間造模前第6周第12周第18周第24周第26周造模前第6周第12周第18周第24周第26周體質(zhì)量/g 139.23±12.21 408.93±40.06 538.22±39.74 555.60±35.50 562.60±36.58 572.61±40.91 139.80±11.90 293.80±21.39**358.21±25.44**398.18±20.59**423.45±20.86**429.56±25.53**24 h進(jìn)食量/g 29.03±3.06 30.01±3.07 30.67±2.90 31.17±2.94 31.81±2.78 33.16±3.04 30.85±2.65 27.33±1.89*26.58±1.93**23.99±2.97**23.32±2.80**22.50±2.92**

2.5 2組大鼠胃組織病理變化

正常對(duì)照組大鼠胃組織未見(jiàn)病變；模型組大鼠胃壁變薄，胃黏膜灰白、蒼白，黏膜皺襞異常集中或變平，走向紊亂、欠規(guī)則，可見(jiàn)散在糜爛帶及糜爛點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 2組大鼠胃體形態(tài)

HE染色顯示，模型組10只大鼠（83.3%）胃黏膜表現(xiàn)為腸上皮化生或輕至重度異型增生，腺體排列擁擠、紊亂，細(xì)胞形態(tài)不一，可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞，細(xì)胞漿嗜堿性，細(xì)胞核大、深染、不規(guī)則，黏膜肌層浸潤(rùn)破壞，病理診斷為PLGC。另外2只大鼠胃黏膜固有腺體萎縮，病理診斷為慢性萎縮性胃炎。見(jiàn)表4、圖3。

表4 2組大鼠胃組織病變情況（只）

圖3 2組大鼠胃黏膜形態(tài)（HE染色，×200）

3 討論

目前，西醫(yī)治療PLGC以根除幽門(mén)螺桿菌感染、內(nèi)鏡下黏膜切除（包括射頻消融和氬離子凝固術(shù)），以及定期行內(nèi)鏡、組織病理學(xué)隨訪(fǎng)為主。中醫(yī)藥治療PLGC通過(guò)多靶點(diǎn)、多層次發(fā)揮保護(hù)胃黏膜、調(diào)節(jié)免疫、影響細(xì)胞增殖分化、抗氧化等作用，體現(xiàn)了中醫(yī)“治未病”思想，與現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)理念不謀而合。動(dòng)物證候模型是基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐相互轉(zhuǎn)化的紐帶，也是揭示中醫(yī)藥干預(yù)機(jī)理的重要載體[19]。因此，本研究在以MNNG復(fù)合造模法構(gòu)建疾病模型基礎(chǔ)上根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)理論，結(jié)合飲食失宜、濕熱邪氣等特定致病因素，模擬PLGC特征，建立中醫(yī)“證”的動(dòng)物模型，通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察大鼠表征、胃組織病理變化對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。造模初期（第6周），大鼠出現(xiàn)活動(dòng)度減少、唇舌色淡、毛枯黃無(wú)澤、爪甲淡白等氣虛證表現(xiàn)；第12周出現(xiàn)大便不成形，推測(cè)氣虛可能以脾胃氣虛為主；第18周出現(xiàn)舌黯紅、唇青紫、爪黯紅等血瘀證表現(xiàn)。表明MNNG復(fù)合造模法復(fù)制PLGC大鼠模型初期以脾胃氣虛證為主，后期在氣虛證基礎(chǔ)上兼見(jiàn)血瘀證。

3.1 病證結(jié)合模型特點(diǎn)

相較單病因法，多病因法更貼合臨床“證”形成的復(fù)雜特點(diǎn)。亞硝酸鹽攝入不當(dāng)、幽門(mén)螺桿菌感染、飲食不規(guī)律及質(zhì)子泵抑制劑濫用等因素在一定程度上已被確定為胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。課題組結(jié)合前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及查閱文獻(xiàn)后采用MNNG五因素復(fù)合法造模。具體思路如下：①M(fèi)NNG自由飲用。MNNG是一種活性N-亞硝基化合物，具有很強(qiáng)的致突變能力，可導(dǎo)致DNA鏈上的堿基烷基化并產(chǎn)生致癌性[20]。早在1967年，Sugimura等[21]就以MNNG持續(xù)性飲用誘導(dǎo)大鼠胃腺癌模型。此后，以MNNG為基礎(chǔ)的造模法廣泛用于建立和誘發(fā)PLGC及胃癌動(dòng)物模型。MNNG可被視為中醫(yī)理論飲食偏嗜（如長(zhǎng)期攝入腌制、熏制食品）或飲食不潔（長(zhǎng)期進(jìn)食有毒物質(zhì)）致病，日久毒邪損傷脾胃，與其他病邪相合，以致氣虛毒損[22]。MNNG灌胃操作會(huì)增加造模期間大鼠死亡率，模擬自然狀態(tài)下飲用MNNG溶液造模更接近萎縮發(fā)展至胃癌的自然病理演變，參考價(jià)值較高[15]?？崭癸嬘肕NNG溶液在胃中停留時(shí)間相較飽腹時(shí)間縮短，使MNNG對(duì)腸道黏膜刺激較胃黏膜增加，加重MNNG致腸道腫瘤的不良反應(yīng)，故本研究于禁食日停飲MNNG溶液。此外，PLGC成模率與MNNG配制濃度密切相關(guān)，濃度過(guò)低成模率降低，過(guò)高易發(fā)展為胃癌。課題組結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究得出，以100 μg/mL MNNG自由飲用成模率高。②胃內(nèi)低酸環(huán)境容易促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，使內(nèi)源性硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，誘發(fā)胃黏膜出現(xiàn)腸上皮化生，且能加強(qiáng)MNNG誘變作用。雷尼替丁能通過(guò)拮抗胃壁細(xì)胞H2受體，抑制胃酸分泌，故常與MNNG溶液配合使用[4]。③無(wú)水乙醇作為一種高刺激性攻擊因子，當(dāng)濃度過(guò)高或攝入量過(guò)多時(shí)，會(huì)使胃黏膜屏障失衡，促使炎癥因子釋放，損傷胃黏膜[23]。此外，相關(guān)研究表明，乙醇可以促進(jìn)MNNG溶解，提高PLGC誘發(fā)率，縮短造模時(shí)間[24]?！夺t(yī)意商》載：“蓋酒之傷人，濕而且熱，濕熱之毒，永久不變?！本贫拘詫贊駸?，過(guò)量攝入乙醇致濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)，損傷脾胃，脾失健運(yùn)，以致氣血不和。④饑飽失常法是模擬人類(lèi)因不規(guī)律進(jìn)食而導(dǎo)致胃黏膜損傷?；凇肮炔蝗氚肴談t氣衰，一日則氣少矣”（《靈樞·五味》）的中醫(yī)理論，本課題組采用正常進(jìn)食2 d再禁食1 d的饑飽失常法作為復(fù)合造模方式之一?！皻庹哐畮浺?，氣行則血行，氣止則血止，氣有一息之不運(yùn)，則血有一息之不行”（《普濟(jì)方·方脈總論》）。氣為血之帥，氣虛無(wú)力行血、攝血，則血行異常，或停滯脈管留瘀，或血出致瘀。⑤幽門(mén)螺桿菌感染是造成PLGC的主要病因，中國(guó)幽門(mén)螺桿菌感染率（56%）高于英國(guó)和美國(guó)（分別為35.5%、35.6%）[25]，這可能是中國(guó)胃癌發(fā)病率較高的原因之一。幽門(mén)螺桿菌通過(guò)尿素酶分解尿素，產(chǎn)生大量氨，從而刺激胃黏膜細(xì)胞出現(xiàn)炎癥、萎縮等病理改變[6]。氨水正是模擬在幽門(mén)螺桿菌感染狀態(tài)下高濃度氨對(duì)胃黏膜的毒性損害，造成大鼠胃黏膜持續(xù)受損，故用0.1%氨水于禁食日自由飲用。此外，實(shí)驗(yàn)研究表明，氨水與MNNG溶液、雷尼替丁聯(lián)用可有效縮短PLGC成模期，提高成模率[26]。

3.2 造模過(guò)程思考與總結(jié)

①造模動(dòng)物選擇。選擇合適的造模動(dòng)物是成功建立病證結(jié)合動(dòng)物模型的首要條件，綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[27-28]，應(yīng)用最多的復(fù)制PLGC模型的動(dòng)物是4～12周齡大鼠，且相較Wistar大鼠，SD大鼠適應(yīng)性和抗病性更強(qiáng)[6]。因此，本課題組選擇5周齡SD大鼠作為模型動(dòng)物。②灌胃操作。灌胃操作易誘發(fā)前胃癌，而人類(lèi)95%以上的胃癌為腺癌，故理想的模型大鼠病變部位應(yīng)在后胃。因此，在灌胃操作前，對(duì)操作者灌胃手法進(jìn)行針對(duì)性培訓(xùn)以盡量避免灌胃失誤造成模型差錯(cuò)。③MNNG溶液飲用方式。鑒于MNNG需要低溫、避光保存，故造模初期課題組使用錫箔紙包裹瓶身，但大鼠具有喜嚙咬的生理特性，可觸及并吞食錫紙，故改用黑色油性筆涂黑并晾干飲水瓶。此外，每日檢查飲水瓶有無(wú)缺口、毛刺以防劃傷大鼠口鼻。④乙醇濃度。胃腸脹氣是造模過(guò)程中大鼠致死的主要原因之一，由于乙醇產(chǎn)氣較多，與MNNG協(xié)同會(huì)加劇胃腸脹氣，故復(fù)合造模應(yīng)注意乙醇濃度及干預(yù)頻率。本課題組結(jié)合前期造模經(jīng)驗(yàn)，于禁食日停止飲用MNNG溶液，改用20%乙醇灌胃，結(jié)果較為理想。⑤大鼠喂食時(shí)間。本研究造模過(guò)程中，正常組2只大鼠因互相撕咬致死，其原因可能是夜間飼料不足，爭(zhēng)搶飼料時(shí)發(fā)生打斗所致。大鼠具有夜間采食的生理特性，故應(yīng)在傍晚足量喂食，避免打斗傷亡。

本課題組基于前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為PLGC核心病機(jī)為脾胃氣虛、胃絡(luò)瘀阻，二者常互為因果，脾胃受損，脾失健運(yùn)，胃失和降，中焦氣機(jī)阻滯，則出現(xiàn)氣滯、血瘀、濕阻。以上病理產(chǎn)物進(jìn)一步阻礙脾胃功能，致氣血生化乏源，脾胃益虛，瘀血深伏脈絡(luò)，出現(xiàn)由氣及血、由經(jīng)入絡(luò)的緩慢發(fā)展過(guò)程?！堵晕s性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見(jiàn)（2017年）》[29]提出，脾胃虛弱與氣滯血瘀相互影響，貫穿疾病始終。因此，本研究以PLGC氣虛血瘀證動(dòng)物模型為切入點(diǎn)，通過(guò)運(yùn)用改良后的大鼠造模方法，為建立穩(wěn)定、可靠的PLGC病證結(jié)合動(dòng)物模型提供較理想、安全的方法，以期促進(jìn)PLGC氣虛血瘀證動(dòng)物模型的規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化。